郭艷飛

（瓦房店市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116300）

多個(gè)領(lǐng)域如食品、醫(yī)療及餐飲等均涉及微生物采樣，故微生物采樣對(duì)公共衛(wèi)生控制意義重大。表面微生物采樣是微生物檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有較大影響。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)消毒餐（飲）具》GB14934-2016的相關(guān)規(guī)定：傷寒沙門菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌為餐具、飲用器具的主要檢測(cè)菌。目前，拭子擦拭的采集方式是收集待測(cè)物體表面微生物的主要方式，然后將收集的菌體移植到培養(yǎng)皿來(lái)進(jìn)行微生物培養(yǎng)，在這個(gè)過(guò)程中，微生物的回收率受到多種因素的影響，許多因素會(huì)產(chǎn)生相互作用，如取樣拭子是什么材質(zhì)、如何進(jìn)行取樣、怎么樣洗脫等均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果[1-3]。臨床上常見(jiàn)的拭子材質(zhì)主要有海綿、植絨及棉簽等，植絨拭子主要由短纖絨毛頭與ABS的塑料桿構(gòu)成，是一次性采樣拭子的一種，在采集病毒和收集DNA方面，其吸附力非常強(qiáng)，也有較好的釋放率，但是目前的研究對(duì)拭子材質(zhì)對(duì)采樣結(jié)果影響的報(bào)道比較少[4]。所以，如何選取性價(jià)值高，采集效果好的拭子材質(zhì)和合適的洗脫方法具有重要意義，對(duì)高表面微生物的采樣效率具有重要價(jià)值。本研究通過(guò)比較3種不同材質(zhì)拭子和3種不同洗脫方式對(duì)表面微生物收集的影響，為選擇何種方法收集待測(cè)物表面微生物提供依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 試驗(yàn)材料與設(shè)備：大腸埃希菌、傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌均由南京生物科技有限公司提供；規(guī)格為6 cm×6 cm的不銹鋼板、植絨拭子、海綿拭子、棉簽拭子；培養(yǎng)皿有營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯兩種類型，均由青島生物技術(shù)有限公司提供；濃度為0.85%的氯化鈉溶液；精密移液器（Eppendorf中國(guó)有效公司提供）；HFSafe1200TE型的大型生物安全柜；LRH250F型的生化培養(yǎng)箱；WG2XJ型的細(xì)菌濁度儀器；HTY302型額微生物限度檢測(cè)儀；LabdancerS25型的渦旋振蕩儀；VHX1000系列的超景深三維顯微顯像系統(tǒng)；HQ5312E超聲波清洗儀。

1.2 菌懸液制備 將含有傷寒沙門菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液迅速移植到培養(yǎng)皿（肉湯）中，然后放置在36 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h，之后選取濃度為0.85%的無(wú)菌氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋，稀釋時(shí)候嚴(yán)格根據(jù)比例執(zhí)行，測(cè)定獲取菌液的OD值，再根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落》GB4789.2-2016檢測(cè)方式，將其制成含菌量為1000 CFU/mL、500 CFU/mL及100 CFU/mL的混懸液。

1.3 洗脫方式驗(yàn)證

1.3.1 拭子接種 應(yīng)用精密移液器將250 μL含菌量不同的菌液移到植絨拭子、棉簽拭子及海綿拭子這3種無(wú)菌拭子上，以比較緩慢的速度進(jìn)行滴加，并且滴加過(guò)程中輕輕的轉(zhuǎn)動(dòng)采樣拭子，使菌液可以比較均勻的分布，并且可以使菌液充分的吸收，值得注意的是，在滴加不同濃度的菌液時(shí)均分別滴加到3種不同材質(zhì)中，每組均保持3個(gè)平行。

1.3.2 菌液洗脫 將獲取不同濃度的細(xì)菌的采樣拭子用無(wú)菌剪刀剪下來(lái)，將與手接觸處去掉，然后將拭子放置在試管中，試管中放置20 mL滅菌生理鹽水，然后人工手動(dòng)振蕩約100次，渦旋振蕩1 min，再應(yīng)用40 KHz的超聲波進(jìn)行清洗約1 min，分別應(yīng)用上述的3種方式進(jìn)行洗脫，洗脫后采用濾過(guò)膜（孔徑約0.45 μm）進(jìn)行濾過(guò)，再應(yīng)用20 mL的無(wú)菌生理鹽水來(lái)清洗大試管，然后再抽濾洗潤(rùn)液，重復(fù)進(jìn)行操作4次。采用無(wú)菌鑷子把濾膜夾出，使其平整的鋪在培養(yǎng)皿（瓊脂）中，濾膜和培養(yǎng)基之間不能存在氣泡，將其放置36 ℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h以后取出記錄菌落個(gè)數(shù)。菌落回收率=洗脫的菌落數(shù)/制備菌落數(shù)×100%。

1.4 模擬采樣后洗脫驗(yàn)證

1.4.1 不銹鋼板接種 選擇不銹鋼材質(zhì)的無(wú)菌板約81塊，分為3組，每組均由27塊組成，吸取含菌量100 CFU/mL的待測(cè)菌液約1 mL，一組用來(lái)接種每種試菌液，接種的面積為5 cm×5 cm，對(duì)照組則是將無(wú)菌生理鹽水接種在接種鋼板上，以此取代菌液，接種好以后將其放置在層流臺(tái)，然后將其吹干。

1.4.2 擦拭取樣 試驗(yàn)組：分別以3種不同材質(zhì)拭子擦拭接種相同菌的接種板，每一個(gè)組均存在3個(gè)平行，然后將帶菌拭子放置于濃度0.85%的無(wú)菌氯化鈉溶液浸泡，再傾斜（30°）涂抹均勻，如此操作3次。應(yīng)用滅菌剪刀將拭子和手接觸的部分剪掉，將拭子放置在20 mL生理鹽水中。對(duì)照組：吸取含菌量100 CFU/mL傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌1 mL菌液，分別將其放置于存有20 mL無(wú)菌生理鹽水試管里，每一組保持2個(gè)平行。搖混均勻后，應(yīng)用0.45 μm的濾膜孔徑進(jìn)行過(guò)濾，在以20 mL的生理鹽水進(jìn)行潤(rùn)洗，抽濾潤(rùn)洗液，重復(fù)操作4次。采用無(wú)菌鑷子把濾膜夾出，使其平整的鋪在培養(yǎng)皿（瓊脂）中，濾膜和培養(yǎng)基之間不能存在氣泡，將其放置36 ℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h以后取出記錄菌落個(gè)數(shù)。

1.4.3 指標(biāo)觀察 把獲取裝有帶菌拭子試管進(jìn)行洗脫，以人工振蕩、渦旋振蕩、超聲洗脫3種洗脫方式進(jìn)行洗脫，應(yīng)用濾膜（孔徑0.45 μm）來(lái)過(guò)濾，在以20 mL的生理鹽水進(jìn)行潤(rùn)洗，抽濾潤(rùn)洗液，重復(fù)操作4次。采用無(wú)菌鑷子把濾膜夾出，使其平整的鋪在培養(yǎng)皿（瓊脂）中，濾膜和培養(yǎng)基之間不能存在氣泡，將其放置36 ℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h以后取出記錄菌落個(gè)數(shù)。

1.5 顯微鏡樣品觀察 分別把不同材質(zhì)的拭子頭取下，然后應(yīng)用200倍的超景深顯微鏡觀察拭子頭里菌落形態(tài)、構(gòu)造。

2 結(jié)果

2.1 洗脫方式對(duì)菌落數(shù)的影響 一定菌量負(fù)荷后，3種材質(zhì)拭子結(jié)合3種洗脫方式的回收率均超過(guò)75%。見(jiàn)表1。

表1 拭子在不同洗脫方式下菌落回收情況比較

2.2 模擬采樣后不同材質(zhì)拭子洗脫方式對(duì)細(xì)菌回收率影響 模擬采樣發(fā)現(xiàn)，相同的洗脫方式，植絨材質(zhì)的釋放率最高，超聲洗脫、旋渦洗脫的回收率均高于70%。植絨拭子采集樣本以后，以渦旋振蕩的方式洗脫1 min，可以獲得最佳的洗脫效果。

3 討 論

各種物體表面均存在微生物，這是自然界的常見(jiàn)現(xiàn)象，但部分微生物具有致病性，對(duì)人體具有一定危害，需要及時(shí)篩查，并且將其去除，進(jìn)而預(yù)防不良事件的發(fā)生[5]?，F(xiàn)階段，無(wú)菌拭子是采集待測(cè)樣本表面微生物的主要方式[6]。較多因素會(huì)影響拭子采樣結(jié)果，內(nèi)容如下。①拭子頭的吸水性：一般情況下，被檢測(cè)的環(huán)境表面含有干燥了的污染物，里面存在較多致病菌，應(yīng)用拭子來(lái)采集樣本時(shí)，會(huì)把水分釋放到干燥的污染物中，水分被吸收以后，污染物會(huì)發(fā)生變化，尤其是表面張力，使微生物容易被采集[7]。②拭子與微生物的接觸面積：拭子頭大小、其與環(huán)境表面接觸大小，均會(huì)影響微生物的吸收。拭子表面若含有靜電，會(huì)增強(qiáng)吸附能力，捕獲效能明顯增加。③拭子摩擦力：采集標(biāo)本時(shí)施加壓力，使拭子頭和表面環(huán)境摩擦力加大，摩擦力越大，捕獲的微生物也會(huì)越多。④拭子頭的釋放效率：拭子采集到微生物以后，要進(jìn)行培養(yǎng)接種，其最大釋放能力可以較好的反映表面的污染情況，有利于病原菌的檢測(cè)[8]。

本研究中選擇3種拭子，分別為植絨拭子、棉簽拭子及海綿拭子。植絨拭子的拭子頭結(jié)構(gòu)規(guī)整。海綿拭子以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為主。棉簽拭子結(jié)構(gòu)最為雜亂，主要由絲狀的物質(zhì)構(gòu)成[9]。通過(guò)對(duì)比3種不同材質(zhì)可知，植絨拭子中的尼龍纖維束具有促進(jìn)樣品吸收的作用，表面吸收的樣品也比較容易被洗脫。海綿的拭子由一層一層的棉絲構(gòu)成，微生物進(jìn)入其內(nèi)部以后，較難被釋放出來(lái)。傳統(tǒng)的棉簽拭子，在采集樣品后微生物被捕獲在其頭部纖維基質(zhì)里，具有較小的釋放量[10]。3種拭子中，植絨拭子的回收率遠(yuǎn)高于其他兩種材質(zhì)的拭子，在一定程度上說(shuō)明，植絨拭子采集效果最佳，能起到最大限度收集和釋放的作用。研究發(fā)現(xiàn)，一定細(xì)菌量負(fù)荷以后，不同材質(zhì)拭子結(jié)合不同洗脫方式的回收率均高于70%，本研究中選擇的3種洗脫方法均能達(dá)到理想效果，其中渦旋振蕩、超聲振蕩回收率相對(duì)較高，人工振蕩的回收率較低。人工振蕩具有操作方便、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但是受人力、頻率等限制，不容易達(dá)到洗脫效果。超聲振蕩所采用的儀器體積龐大，需要隨時(shí)更換洗脫水，操作過(guò)程煩瑣。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，渦旋振蕩具有操作便捷、容易清洗、振蕩器體積小等優(yōu)點(diǎn)，所以可以選擇為最佳洗脫方式。研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用植絨拭子采樣以后經(jīng)過(guò)旋渦振蕩1 min，可以取得最佳微生物洗脫效果。在一定程度上說(shuō)明，檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)對(duì)渦旋振蕩時(shí)間有一定要求，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)比較耗費(fèi)時(shí)間，時(shí)間太短又達(dá)不到洗脫效果，而控制1 min左右洗脫效果最佳。

綜上所述，以植絨拭子采樣后經(jīng)渦旋振蕩1 min可以獲取最佳效果，能為食品衛(wèi)生、醫(yī)療器具等表面微生物監(jiān)控提供參考。