郭文浩，房士琨，張玥，梁照鋒

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

胃癌是導(dǎo)致人類死亡的主要惡性腫瘤之一。我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第二位，已成為國(guó)民健康的重大威脅。香煙煙霧中含約70種致癌物及大量的自由基和過氧化物，可引起炎癥和致癌反應(yīng)。長(zhǎng)期香煙煙霧暴露是許多疾病的主要危險(xiǎn)因素，且吸煙的數(shù)量和時(shí)間與發(fā)病率呈正比[1]。研究發(fā)現(xiàn)吸煙與胃癌的發(fā)生發(fā)展存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，但其機(jī)制并不清楚[2]。腫瘤干細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，是腫瘤的起源細(xì)胞和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥等密切相關(guān)，在胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有決定性作用[3-4]。然而目前尚無吸煙與胃癌干細(xì)胞相關(guān)的研究報(bào)道。

近年來植物化學(xué)物在腫瘤的防治中頗受關(guān)注，其具有抗癌、防癌作用，且安全性高，在腫瘤等慢性病中的防治效應(yīng)研究已成為重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。然而食源性的植物化學(xué)物在腫瘤干細(xì)胞的干預(yù)方面的研究鮮有報(bào)道。大蒜活性成分二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide, DATS)在胃癌、甲狀腺癌、肝癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有干預(yù)效應(yīng)[5-6]，但其分子機(jī)制并不清楚。本研究觀察DATS對(duì)香煙煙霧懸液(cigarette smoke extract, CSE)增強(qiáng)的SGC-7901源胃癌干細(xì)胞干性的干預(yù)效應(yīng)，并探討其作用機(jī)制，為DATS在胃癌防治中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (recombinant human epidermal growth factor, rh-EGF)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(recombinant human fibroblast growth factor, rh-FGF)、B27(美國(guó)Gibco公司)；PMSF、RIPA(美國(guó)Invitrogen公司)，BCA試劑盒(碧云天公司)，PVDF 膜(德國(guó)Millipore 公司)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、OCT-4一抗(美國(guó)CST公司)，NANOG、LIN28、SOX2、GSK3β一抗(美國(guó)SAB公司)，GAPDH(美國(guó)Bioworld公司)。電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)，Ima-geQuant LAS4000mini 化學(xué)發(fā)光成像儀(日本GE 公司)，倒置式生物顯微鏡(日本 Nikon公司)，UltraSYBR混合物(康為世紀(jì)生物科技有限公司)，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(CFX96，美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱。用含20 ng/mL rh-EGF、10 ng/mL rh-FGF、2% B27無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞7 d。根據(jù)細(xì)胞球的形成情況及干性基因的表達(dá)情況判斷干細(xì)胞是否培養(yǎng)成功。

1.3 香煙煙霧懸液的制備

本實(shí)驗(yàn)所用香煙為國(guó)內(nèi)較為常見的香煙，其煙堿量為1.0 mg，焦油量為10.0 mg。將點(diǎn)燃的香煙用負(fù)壓驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸，香煙煙霧溶于10 mL的RPMI-1640無血清培養(yǎng)基中，搖勻，5 min燃燒完，調(diào)節(jié)pH值至7.40，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，以此懸液為100%，按實(shí)驗(yàn)所需稀釋使用，每日新鮮制備。

1.4 篩選適宜的DATS濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901源胃癌干細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，4 000個(gè)/孔，用0%、0.25%、0.50%的CSE和5、10、20 μmol/L的DATS單獨(dú)或聯(lián)合連續(xù)處理7 d，每組設(shè)3個(gè)平行。溶劑對(duì)照用DMSO處理。每天更換含特定生長(zhǎng)因子(20 ng/mL rh-EGF、20 ng/mL rh-FGF 和 2% B27)及處理因素的新鮮培養(yǎng)基。7 d后采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)其細(xì)胞活力，篩選適宜的DATS濃度。

1.5 顯微鏡觀察DATS對(duì)胃癌干細(xì)胞的干細(xì)胞球形成的影響

分別用0% CSE、0.25% CSE、0.25% CSE+10 μmol/L DATS、0.50% CSE和0.50% CSE+10 μmol/L DATS連續(xù)處理SGC-7901源胃癌干細(xì)胞7 d，每組設(shè)3個(gè)平行。每天更換含新鮮的CSE、10 μmol/L DATS和含特定生長(zhǎng)因子(20 ng/mL rh-EGF、10 ng/mL rh-FGF和2% B27)的無血清培養(yǎng)基。7 d后顯微鏡下觀察胃癌干細(xì)胞球大小，并拍照和計(jì)數(shù)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)胃癌干細(xì)胞基因和Wnt通路相關(guān)蛋白

用0%、0.25%和0.50% CSE，10 μmol/L DATS和20 μmol/L 氯化鋰(LiCl)單獨(dú)或聯(lián)合連續(xù)處理SGC-7901細(xì)胞來源的胃癌干細(xì)胞7 d，按照蛋白提取試劑盒的說明書提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。12%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)。 將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上，在5%脫脂牛奶中封閉1 h，然后與一抗β-catenin、OCT-4、NANOG、LIN28、SOX2、GSK3β (均1 ∶1 000)，GAPDH (1 ∶500)孵育過夜，1×TBST洗3次，羊抗兔二抗孵育1 h，1×TBST洗5次，化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胃癌干細(xì)胞干性基因

收取各個(gè)處理組的胃癌干細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗2次，按照RNA提取試劑盒的說明書提取胃癌干細(xì)胞總RNA，并測(cè)定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用UltraSYBR混合物在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上檢測(cè)NANOG、OCT-4、SOX2、LIN28、GAPDH的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系為：Mixture (UltraSYBR) 10 μL，無RNA酶水8 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。引物序列如下，NANOG：上游5′-GGAACGCCTCATCAATGC -3′，下游5′- TGTCAGCCTCAGGACTTGAGA -3′；OCT-4：上游 5′- AC-ACCAATCCCATCCACACT-3′，下游 5′- GCAAACTTCCTGCAAAGCTC-3′；SOX2：上游5′-TTGAGGCTCTGCAGCTTAG-3′，下游 5′-GCCGGTTACAGAACCACAC-3′；LIN28：上游5′-TCGGCTTCCTGTCTATGACC-3′，下游5′-GGAATCCATCCGTGTCACTG-3′；GAPDH：上游 5′-GCTGCCCAACGCACCGAATA-3′，下游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DATS能抑制CSE促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞自我更新能力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L DATS能顯著抑制CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，為最適作用濃度(圖1)。0.25% CSE和0.50% CSE處理組的懸浮細(xì)胞球明顯大于0.25% CSE和0.50% CSE與DATS聯(lián)合處理組，表明DATS能抑制CSE促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞球的形成(圖2)。

①：0% CSE，②：DMSO，③：0.25% CSE，④：0.25% CSE+5 μmol/L DATS，⑤：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，⑥：0.25% CSE+20 μmol/L DATS，⑦：0.50% CSE，⑧：0.50% CSE+5 μmol/L DATS，⑨：0.50% CSE+10 μmol/L DATS，⑩：0.50% CSE+20 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.01，與0.25% CSE相比；c：P<0.01，與0.50% CSE相比

①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.05，與0.25% CSE相比；c：P<0.05，與0.50% CSE組相比

2.2 DATS能抑制CSE促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞干性基因的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，DATS能明顯抑制CSE促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞的干性基因NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28的mRNA水平(圖3A)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，DATS聯(lián)合處理能抑制CSE誘導(dǎo)的胃癌干細(xì)胞NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28蛋白表達(dá)水平的上調(diào)(圖3B)。

2.3 DATS抑制CSE促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞Wnt通路活性

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，DATS能抑制CSE導(dǎo)致的β-catenin、GSK3β蛋白表達(dá)異常，提示DATS能抑制CSE促進(jìn)的SGC-7901源胃癌干細(xì)胞Wnt通路活性。見圖4。

A：qRT-PCR檢測(cè)胃癌干細(xì)胞干性基因的mRNA表達(dá)；B：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)胃癌干細(xì)胞干性基因的蛋白表達(dá)。①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.05，與0.25% CSE相比；c：P<0.05，d：P<0.01，與0.50% CSE相比

①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.05，與0.25% CSE組相比，c：P<0.01，與0.50% CSE組相比

2.4 DATS調(diào)控Wnt通路抑制CSE增強(qiáng)的胃癌干細(xì)胞干性

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，DATS能顯著抑制CSE激活的Wnt通路和胃癌干細(xì)胞干性基因NANOG和OCT-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。氯化鋰和CSE聯(lián)合能進(jìn)一步激活Wnt通路，而氯化鋰與DATS的聯(lián)合作用，使GSK3β蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而β-catenin蛋白表達(dá)水平下調(diào)(圖5A)。同時(shí)氯化鋰能明顯上調(diào)胃癌干細(xì)胞干性基因NANOG和OCT-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，氯化鋰與DATS的聯(lián)合作用能部分減弱氯化鋰引起的NANOG和OCT-4的表達(dá)水平上調(diào)(圖5B，5C)。初步說明DATS能通過調(diào)控Wnt通路抑制CSE增強(qiáng)的胃癌干細(xì)胞干性。

A：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Wnt通路活性改變；B：qRT-PCR檢測(cè)胃癌干細(xì)胞干性基因mRNA表達(dá)水平；C：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)胃癌干細(xì)胞干性基因蛋白表達(dá)水平。①：0% CSE，②：0.50% CSE，③：0.50% CSE+DATS，④：0.50% CSE+LiCl，⑤：0.50% CSE+DATS+LiCl。a：P<0.01，與0% CSE相比；b: P<0.01，與0.5%CSE相比；c: P<0.05，d： P<0.01，與0.5%CSE+LiCl組相比

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，最初已獲得致癌突變，具有自我更新和分化的可能性，從而負(fù)責(zé)整個(gè)腫瘤細(xì)胞群的產(chǎn)生及異質(zhì)性、耐藥性和侵襲性，在胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有決定性作用。研究表明，香煙煙霧能夠促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力和干性基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Qian等[7]發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧暴露能增強(qiáng)腎癌干細(xì)胞干性基因的表達(dá)，進(jìn)而在腎癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Wang等[8]研究表明長(zhǎng)期的香煙暴露會(huì)促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的獲得，促進(jìn)增殖與侵襲，抑制凋亡。Nimmakayala等[9]在細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明，香煙煙霧會(huì)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞中的干細(xì)胞功能，從而進(jìn)一步促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展。本研究的結(jié)果同樣證明了香煙煙霧能促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的自我更新能力，并且能增強(qiáng)胃癌干細(xì)胞干性基因NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28的表達(dá)水平，能夠增強(qiáng)胃癌干細(xì)胞的干性。

DATS是從大蒜、洋蔥等植物中提取的一種有機(jī)硫化合物，能通過提供硫自由基和巰基而發(fā)揮生物學(xué)作用，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種功能。研究發(fā)現(xiàn)，DATS在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有干預(yù)效應(yīng)。 Tao等[10]研究結(jié)果顯示DATS對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可以誘導(dǎo)其凋亡。Liu等[11]研究結(jié)果顯示DATS能下調(diào)乳腺癌多種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。Wnt信號(hào)通路在多種生理病理過程發(fā)揮作用，近年來發(fā)現(xiàn)其在維持腫瘤干細(xì)胞干性中具有非常重要作用。本研究結(jié)果顯示，DATS能夠干預(yù)香煙煙霧促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞的自我更新能力，抑制香煙煙霧促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞干性基因OCT-4、SOX2、NANOG和LIN28的表達(dá)水平，Wnt信號(hào)通路在其中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果初步顯示了DATS對(duì)香煙煙霧促進(jìn)的胃癌干細(xì)胞干性的干預(yù)效應(yīng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DATS可通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路抑制胃癌干細(xì)胞的干性。然而，本研究并未在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中探討DATS干預(yù)效應(yīng)的分子機(jī)制，我們將在后續(xù)研究中加以探討，進(jìn)一步提升DATS在胃癌等腫瘤防治中的價(jià)值。