羅傳皊，孫利平，戚成棟 *

(棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.小兒內(nèi)科，山東 棗莊 277100)

肺部的很多疾病都是與肺部的炎性反應(yīng)密切相關(guān)，尤其是膿毒血癥肺損傷[1-2]。近期有報(bào)道稱，非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA)能夠調(diào)控膿毒血癥肺損傷的肺泡巨噬細(xì)胞炎性小體的釋放[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)，又稱核富集豐富轉(zhuǎn)錄本2 (nuclear enrichment enriched transcripts 2，NEAT2)，是一種高度保守的非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA)，被認(rèn)為是肺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的預(yù)后生物標(biāo)志物[4-5]。已有研究報(bào)道，lnc-MALAT1(lncRNA-MALAT1)被認(rèn)為是肺部炎性損傷的重要預(yù)后因素[6]。本研究旨在探究lnc-MALAT1調(diào)控LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系(alveolar macrophages,AMOs)(ATCC公司)；F12K培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)公司)；人白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒(上海碧云天生物公司)；RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)實(shí)驗(yàn)試劑盒(廣州伯信生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：用F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)(20%胎牛血清+1%青鏈霉素)在37 ℃、95% O2、5% CO2的條件下培養(yǎng)、傳代NR8383細(xì)胞。將正常培養(yǎng)的AMOs隨機(jī)分為對(duì)照組(正常培養(yǎng)細(xì)胞)、LPS組(1 mg/L的LPS處理12 h)，下列各組轉(zhuǎn)染后均進(jìn)行1 mg/L的LPS處理12 h，pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-MALAT1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT1)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-217組(轉(zhuǎn)染miR-217 mimics)、pcDNA-MALAT1+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT1和miR-NC)、pcDNA-MALAT1+miR-217組(共轉(zhuǎn)染pcDNA-MALAT1和miR-217 mimics)。

1.2.2 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的含量：收集待檢測(cè)細(xì)胞的上清液，按照人白介素1β(IL-1β)檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書要求檢測(cè)其中IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MALAT1、miR-217的表達(dá)量：用RNA提取試劑盒提取需要檢測(cè)的細(xì)胞中的總RNA，再將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照RT-qPCR試劑盒的要求檢測(cè)cDNA中MALAT1、miR-217的表達(dá)，結(jié)果以GAPDH、U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算MALAT1、miR-217的表達(dá)。所用引物序列為：MALAT1，上游引物5′-GGGGGAGTTTTCAGTATTTTTTTTTG-3′，下游引物5′-TACACCTTGAGTCATTTGCCTTTAGG-3′；GAPDH，上游引物5′-GGGAAACTGCGGCGTGAT-3′，下游引物5′-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′；miR-217，上游引物5′-CGCTCTACTGCATCAGGAACTGA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6，上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-217與MALAT1的靶向關(guān)系:生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測(cè)MALAT1潛在的靶標(biāo)。根據(jù)預(yù)測(cè)到的miR-217與MALAT1之間的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含有結(jié)合位點(diǎn)的片段(WT-MALAT1)和不含結(jié)合位點(diǎn)的片段(MUT-MALAT1)，送由上海吉瑪公司完成。將其克隆至熒光載體psiCHECK2，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因。再將miR-NC、miR-217分別與其轉(zhuǎn)染至AMOs。按雙熒光報(bào)告基因試劑盒要求操作，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，用螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性表示細(xì)胞的熒光活性。

1.2.5 RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-217與MALAT1的靶向關(guān)系:首先將miR-NC、miR-217轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，然后按照RIP試劑盒使用說(shuō)明書要求操作，加入裂解液，作為樣本。向含磁珠1.5 mL離心管中加入樣本、RNase抑制劑、DNase、IgG抗體或Ago2抗體，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。次日用RIP清洗液充分洗滌，再用DEPC水純化RNA。提取其中總RNA含量，RT-qPCR檢測(cè)其中MALAT1的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lnc-MALAT1、miR-217在LPS誘導(dǎo)AMOs中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞中IL-1β、TNFα的含量均顯著升高，MALAT1表達(dá)顯著升高，miR-217表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖1)。

2.2 過(guò)表達(dá)MALAT1對(duì)LPS誘導(dǎo)的AMOs炎性反應(yīng)的影響

與pcDNA組相比，pcDNA-MALAT1組細(xì)胞中MALAT1表達(dá)顯著升高，IL-1β、TNFα的含量均顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-217對(duì)LPS誘導(dǎo)的AMOs炎性反應(yīng)的影響

與miR-NC組相比，miR-217組細(xì)胞中miR-217表達(dá)顯著升高，IL-1β、TNFα的含量均顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group圖1 LPS誘導(dǎo)的AMOs中MALAT1、miR-217的表達(dá)Fig 1 LPS-induced expression of MALAT1 and miR-217 in alveolar n=9)

*P<0.05 compared with the pcDNA group圖2 過(guò)表達(dá)MALAT1對(duì)LPS誘導(dǎo)AMOs炎性反應(yīng)的作用Fig 2 Over-expressing MALAT1 affected LPS-inducedin flammatory response in n=9)

*P<0.05 compared with the miR-NC group圖3 過(guò)表達(dá)miR-217對(duì)LPS誘導(dǎo)AMOs炎性反應(yīng)Fig 3 Over-expressing miR-217 affected LPS-induced inflammatory response in n=9)

2.4 過(guò)表達(dá)miR-217對(duì)MALAT1調(diào)控LPS誘導(dǎo)的AMOs炎性反應(yīng)的調(diào)控

與pcDNA-MALAT1+miR-NC組相比，pcDNA-MALAT1+miR-217組細(xì)胞中MALAT1表達(dá)明顯降低，IL-1β、TNFα的含量也均發(fā)生下降(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with the pcDNA-MALAT1+miR-NC group圖4 LPS誘導(dǎo)的AMOs炎性反應(yīng)Fig LPS-induced AMOs inflammatory response

2.5 MALAT1靶向miR-217

通過(guò)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測(cè)到MALAT1與miR-217之間存在連續(xù)的7個(gè)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。與miR-NC組相比，miR-217組WT-MALAT1細(xì)胞的熒光活性顯著降低。與miR-NC組相比，miR-217組Ago2 RIP顯示細(xì)胞的MALAT1表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

RIP.RNA binding protein immunoprecipitation;A.complementary nucleotide sequence;B.dual luciferase experiment result;C.RIP experiment result;*P<0.05 compared with the miR-NC group圖5 MALAT1靶向調(diào)控miR-217Fig 5 MALAT1 targeted and regulated miR-217

3 討論

肺泡巨噬細(xì)胞是肺部的重要先天免疫細(xì)胞[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)增強(qiáng)肺泡巨噬細(xì)胞自噬減輕肺部的炎性損傷[8]。MALAT1敲低通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S和小鼠肺泡上皮細(xì)胞MLE-12的炎性反應(yīng)在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)大鼠模型中起保護(hù)作用[9]。MALAT1敲低能夠減弱LPS誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞激活，增強(qiáng)IL-4誘導(dǎo)的M2分化以及巨噬細(xì)胞纖維化表型[10]。低表達(dá)MALAT1可以通過(guò)p300介導(dǎo)的IL-8下調(diào)，抑制中性粒細(xì)胞的趨化性，從而改善肺移植缺血-再灌注炎性損傷[11]。本研究結(jié)果顯示，MALAT1在LPS誘導(dǎo)的AMOs中的表達(dá)異常升高，并且MALAT1明顯上調(diào)致炎因子IL-1β、TNFα的含量，這與報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，與Dai的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖。深入研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1與miR-217之間存在靶向關(guān)系，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，提示miR-217可能也參與了MALAT1對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞炎性因子分泌的調(diào)控作用。

miR-217作為miRNAs的一種，在炎性反應(yīng)和纖維化中發(fā)揮重要作用[12]。miR-217在高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中通過(guò)Sirt1/HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)炎性反應(yīng)和纖維化，參與糖尿病腎病的發(fā)展過(guò)程[13]；miR-217在間質(zhì)性肺炎患者的肺泡巨噬細(xì)胞和血清中的表達(dá)異常下降[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-217在LPS誘導(dǎo)的AMOs中的表達(dá)發(fā)生下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-217能夠抑制LPS誘導(dǎo)的AMOs IL-1β、TNFα的分泌，這暗示miR-217具有潛在的抗感染價(jià)值。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-217還可部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)MALAT1對(duì)LPS誘導(dǎo)的AMOs IL-1β、TNFα分泌的促進(jìn)作用。不足之處為這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅在體外得到了初步驗(yàn)證，仍需進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行更充分的驗(yàn)證。

綜上所述，lnc-MALAT1在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其可促進(jìn)炎性反應(yīng)，作用機(jī)制為靶向抑制miR-217，為肺部損傷的治療提供新靶標(biāo)。