李偉宏，田莉，劉俊保

1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 450064；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，且預(yù)后不良［1-2］。中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡治療腫瘤是有效的治療手段，應(yīng)用中藥治療腫瘤得到了廣泛的關(guān)注。莪術(shù)油有較好的抗腫瘤、抗炎、抗病毒、細(xì)胞凋亡［3-4］等作用；其主要有效成分為莪術(shù)酮、莪術(shù)二酮等。但關(guān)于莪術(shù)油對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的研究報道較少，本研究將探討莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞的增殖、凋亡及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)HEC-1-B細(xì)胞株由上海歌凡生物科技有限公司提供。將細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中，放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育［10］。

1.2 藥品及試劑DMEM培養(yǎng)基（美國康寧公司，批號：C2413118）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（standard FBS，天津灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司，批號：20191230）；四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT，美國Sigma公司，貨號：88417）；DMSO（美國Amresco公司，貨號：472301）；Hoechst 33258染色劑（美國Sigma公司，貨號：BK17520）；Caspase-3、Bax與Bcl-2抗體（美國Cell signaling technology公司，貨號分別為：9622、5023、15071）；ECL化學(xué)發(fā)光液（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0018AS）；莪術(shù)油注射液（徐州萊恩藥業(yè)有限公司，批號：H20067076）。

1.3 儀器倒置顯微鏡及照相裝置（日本Olympus公司）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；MP200A型電子天平（上海精科天平）；DNM-9602G酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；Mini-REPOTEANⅡ（Bio-Red公司）；DYY-Ⅲ型電轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 MTT法檢測莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞增殖抑制作用將生長達(dá)到80% ～90%的HEC-1-B細(xì)胞棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗后加入0.25%胰酶細(xì)胞消化液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104·mL-1時將此注入96孔板內(nèi)，每孔200μL，放入體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換液，各組加入含莪術(shù)油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg·L-1、960 mg·L-1）的培養(yǎng)基150μL，對照組加入無血清的培養(yǎng)基，作用細(xì)胞48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT試劑20μL（5 g·L-1），作用4 h，去除上清液，加入150μL，每孔DMSO，于搖床上低速振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長測定吸光度（A）值。應(yīng)用MTT法測細(xì)胞增殖抑制的情況。每組設(shè)8個平行復(fù)孔，計算細(xì)胞抑制率。

2.2 Hoechst33258熒光染色檢測HEC-1-B細(xì)胞凋亡將對數(shù)生長期的HEC-1-B細(xì)胞制成濃度為1×105·mL-1單細(xì)胞懸液，接種于24孔板培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行分組，莪術(shù)油組加入含有不同濃度莪術(shù)油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg·L-1、960 mg·L-1）的DMEM培養(yǎng)基，正常對照組加入無血清培養(yǎng)基，作用細(xì)胞48 h，進(jìn)行Hoechst 33258熒光染色，鏡下觀察莪術(shù)油對細(xì)胞凋亡的情況并拍照。

2.3 W estern blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)對照組細(xì)胞加入無血清培養(yǎng)基，實驗組加入莪術(shù)油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg· L-1、960 mg·L-1）處理細(xì)胞作用48 h后，收集細(xì)胞，放入冷的細(xì)胞裂解液中作用30 min，細(xì)胞樣品反復(fù)吹打，4℃，12 000 g，離心半徑8 cm，離心20 min后，把上清液移至新管，用BCA試劑盒測定蛋白含量，將各組蛋白含量調(diào)成一致。將玻璃板清洗干凈后，蒸餾水沖洗，固定好板子后，配制10%SDS-PAGE凝膠溶液（根據(jù)分子量選擇相應(yīng)濃度的分離膠），每孔上樣20μL，加適量電泳緩沖液，進(jìn)行電泳來分離蛋白質(zhì)，并適時終止電泳。將膠浸泡于轉(zhuǎn)膜液中，標(biāo)記膠的方向，然后于搖床上30 min低速震蕩。截取和膠的大小一致PVDF膜，甲醇溶液浸泡，浸透后將PVDF膜轉(zhuǎn)移浸入轉(zhuǎn)膜液中5 min以上。取一張用轉(zhuǎn)膜液浸潤的濾紙放在半干轉(zhuǎn)印儀的電極板底層上，放上PVDF膜，再將膠貼于PVDF膜上；再取用轉(zhuǎn)膜液潤濕另一張厚濾紙，鋪在分離膠的上面，用玻璃試管壓緊趕走氣泡；蓋上頂層電極板，接通電源，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)??；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜浸泡在封閉液中，與膠相鄰面要向上，放置在水平搖床上緩慢震蕩1 h以上。取出PVDF膜，裁取想要的位置并放置于含有一抗抗體的雜交液盒中孵育；取出PVDF膜，應(yīng)用TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min；然后把PVDF膜放入裝有二抗的雜交液盒中，搖床上震蕩雜交1 h；取出PVDF膜，用TBST清洗3次，每次5 min；將ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒內(nèi)的試劑A與試劑B等體積混合后，均勻滴在PVDF膜上，反應(yīng)后利用凝膠成像采集系統(tǒng)進(jìn)行曝光，并對蛋白條帶進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，實驗計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間樣本的比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞增殖的影響與對照組比較，不同濃度的莪術(shù)油（120mg·L-1、240mg·L-1、480mg·L-1、960mg·L-1）作用HEC-1-B細(xì)胞48 h后，吸光度值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝8.336，P＜0.01；t＝12.609，

P＜0.01；t＝13.583，P＜0.01；t＝17.766，P＜0.01），說明莪術(shù)油能夠明顯抑制HEC-1-B細(xì)胞的增殖，呈一定的濃度依賴性。根據(jù)各組吸光度值計算細(xì)胞抑制率，結(jié)果顯示，隨著莪術(shù)油濃度的增大，其對HEC-1-B細(xì)胞的抑制率也逐漸增加。見表1。

表1 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01

/%對照組組別 n 吸光度值 細(xì)胞抑制率8 1.14±0.12 0莪術(shù)油120 mg·L-1組 8 0.71±0.08** 37.10±7.10莪術(shù)油240 mg·L-1組 8 0.52±0.07** 53.90±6.20莪術(shù)油480 mg·L-1組 8 0.40±0.10** 65.20±8.70莪術(shù)油960 mg·L-1組 8 0.25±0.08**77.90±6.80

3.2 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞凋亡的影響熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，莪術(shù)油各組細(xì)胞都出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂、熒光亮度變強等凋亡特征，細(xì)胞凋亡率顯著增加。

3.3 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，莪術(shù)油作用細(xì)胞48 h后，隨著莪術(shù)油濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝6.079，P＜0.01；t＝19.545，P＜0.01；t＝34.903，P＜0.01；t＝21.151，P＜0.01）；Bax蛋白表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝7.146，P＜0.01；t＝13.809，P＜0.01；t＝15.890，P＜0.01；t＝52.971，P＜0.01）；Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.797，P＞0.05；t＝3.044，P＜0.05；t＝6.309，P＜0.01；t＝11.455，P＜0.01）。見表2、圖1。

表2 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

Caspase3/GAPDH Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH對照組組別 n 3 0.359±0.015 0.599±0.072 0.252±0.019莪術(shù)油120mg·L-1組 3 0.440±0.017**0.548±0.084 0.593±0.055**莪術(shù)油240mg·L-1組 3 0.629±0.018**0.442±0.052* 0.735±0.044**莪術(shù)油480mg·L-1組 3 1.016±0.029**0.324±0.023** 1.031±0.071**莪術(shù)油960mg·L-1組 3 1.254±0.072**0.121±0.006** 1.142±0.017**

圖1 不同濃度的莪術(shù)油對HEC-1-B細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

自殷墟出土的甲骨文中，就有“瘤”的記載。漢代劉熙《釋名》定義為“瘤，流也，血流聚生而瘤腫也。”周代有瘍醫(yī)之位，其主治范圍包括“腫瘍”，即腫瘤類疾病。子宮內(nèi)膜癌相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“癥瘕”，唐代孫思邈《千金要方》中載有明確的病機，明確其病位在下焦，為腹中積塊，或脹或痛的疾病，并有固定的方藥?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干?！弊訉m內(nèi)膜癌的基本病機是正氣虧虛，熱毒內(nèi)聚，氣滯血瘀。治療原則是解毒化瘀，扶正消積。莪術(shù)具有破血逐瘀作用，可縮小瘤體，改善全身狀況，提高生存質(zhì)量［5-9］，莪術(shù)油可抑制HEC-1-B細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡［10］。

細(xì)胞凋亡是刪除細(xì)胞的一種選擇性過程，是組織大小調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生所必需的生理過程。在哺乳動物細(xì)胞中，凋亡是由兩種不同的信號途徑誘導(dǎo)的：外部或死亡受體和內(nèi)在或線粒體［6］。Bcl-2家族的蛋白質(zhì)已被確定為線粒體途徑的基本成分。Bcl-2家族的成員可以通過合成抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）或促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bd、Bcl-xs）來促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡。在人類的各種癌癥組織中，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌，都觀察到了抗凋亡Bcl-2基因的表達(dá)［7］。Bcl-2家族基因與子宮內(nèi)膜癌之間的關(guān)系主要通過對人體組織樣本的體外研究得到揭示［8］；過多的Bcl-2表達(dá)會減緩細(xì)胞生長，高表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而較低的表達(dá)則可能是抑制人類乳腺和子宮內(nèi)膜癌組織凋亡的跡象。研究還表明，Bcl-2的表達(dá)因腫瘤的侵入性和分化程度而有所不同，而Bcl-2表達(dá)在較高級的癌癥中與較低級的癌癥相比是非常低或不存在的。據(jù)推測，在癌癥發(fā)生發(fā)展期間，Bcl-2的表達(dá)可能會被抑制。因此，Bcl-2的表達(dá)高低被用來作為預(yù)測癌癥進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。本實驗結(jié)果表明，與對照組相比較，莪術(shù)油組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著增加，且Bcl-2/Bax明顯降低。說明莪術(shù)油可能是通過降低Bcl-2蛋白表達(dá)、增加Bax蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

在細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-3是最主要的終末剪切酶［9-10］，也是CTL細(xì)胞殺傷重要的組成部分。Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，可以被多種因素活化，被激活后，可以使蛋白酶多聚（ADP-核糖）及與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA核酸復(fù)制等相關(guān)聚合酶PARP失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11-12］。并且Caspase-3被激活后還可以進(jìn)一步使Bcl-2滅活，讓細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究表明，莪術(shù)油能導(dǎo)致肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，其可能與Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。與對照組比較，莪術(shù)油作用HEC-1-B細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2/Bax的比值降低。表明莪術(shù)油能夠誘導(dǎo)HEC-1-B細(xì)胞凋亡，其作用機制可能是通過增加了Caspase-3、Bax的表達(dá)水平和降低Bcl-2表達(dá)水平有關(guān)。

大量研究證實，莪術(shù)油具有抗腫瘤、抗病毒和提高人體免疫等作用，通過許多藥理作用及臨床應(yīng)用研究，證明了莪術(shù)油藥理活性較好、抗腫瘤效果好、藥物安全性高。但莪術(shù)油成分較多且組成復(fù)雜，因此其抗腫瘤機制也比較復(fù)雜，我們的實驗僅對莪術(shù)油凋亡因子方面做相關(guān)研究，為進(jìn)一步研究莪術(shù)油抑制子宮內(nèi)膜癌提供實驗依據(jù)，但其作用機制需進(jìn)一步研究。