楊媚

胸腔積液為臨床常見胸科疾病，有惡性良性之分，病因復(fù)雜，常見原因有結(jié)核、感染、腫瘤等，臨床為減輕患者癥狀，多以穿刺抽取積液為主，并予以常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片檢查，多數(shù)患者可通過此方法進(jìn)行明確診斷，但對于內(nèi)鏡活檢、體外穿刺及手術(shù)獲得組織的患者，實(shí)施常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片檢查明顯無法滿足需求[1-2]。因此，臨床迫切需要能夠明顯診斷胸腔積液，盡早為患者提供優(yōu)質(zhì)治療。目前，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷深入發(fā)展和改善，細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色應(yīng)時(shí)代而出現(xiàn)，并在胸腔積液臨床診斷中廣泛應(yīng)用[3-4]。為此，筆者收集了近3年的300例患者的胸腔積液，予以細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色行回顧性總結(jié)，旨在探究細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色在胸腔積液診斷中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月—2019年1月期間，共收集本院病理科診斷的300例胸腹腔積液患者的胸腔積液標(biāo)本，均接受常規(guī)染色顯微鏡下觀察涂片、細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色。其中男女性別之比為159∶141；年齡45～80歲，平均年齡（56.68±2.35）歲。所有病理資料均經(jīng)高年資病理科醫(yī)師復(fù)核，研究符合醫(yī)學(xué)倫理，入選患者均自愿參與，且簽署研究知情書。

1.2 方法

1.2.1 甲組 采用常規(guī)染色顯微鏡下觀察涂片，即：取入選患者的漿膜胸腔積液標(biāo)本200～500 mL，立即送至細(xì)胞室；取漿膜胸腔積液標(biāo)本20 mL放于離心管中，以3 000 r/min的速度，離心分離10 min，取沉渣棄上清液，每一個(gè)樣品標(biāo)本以推拉法制片2張，待風(fēng)干后，使用巴氏雙染色法予以染色處理。

1.2.2 乙組 采用細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色，具體如下。（1）制備細(xì)胞蠟塊。①剩余的漿膜腔積液靜止10 min，丟棄上層液體，剩余約100 mL的標(biāo)本充分混勻后，均分倒入2個(gè)50 mL離心管，以2 500 r/min的速度，離心分離5～10 min，取下層沉淀物棄上清液。若標(biāo)本是血性胸腔積液，需用冰醋酸處理，離心沉淀，直至血液無。②包裹：沉淀物用吸管吸取，并安放于試鏡紙，包裹后置于脫水盒。③固定：10%福爾馬林液內(nèi)裝入脫水盒2 h，避免細(xì)胞皺縮溶解和變形，影響細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。④脫水：細(xì)胞塊在濃度不同的酒精（50%、70%、80%、90%、95%）各浸泡1 h后，在分別置入2個(gè)酒精濃度為100%各1.5 h，確保細(xì)胞中水分徹底清除。⑤透明：將已徹底脫水的細(xì)胞快，置入1∶1混合的二甲苯和100%酒精20 min，再置入二甲苯溶液15 min，二次置入二甲苯溶液15 min。通過二甲苯的浸泡，能夠保障石蠟與酒精徹底混合，經(jīng)過逐層替換后，確保細(xì)胞內(nèi)浸入石蠟容易。⑥浸蠟，首先將細(xì)胞塊浸入1∶1混合的石蠟和二甲苯的混合液30 min，隨后可將細(xì)胞塊置入純石蠟中2～3 h，共2次。另外，注意控制浸蠟期間的溫度54～56℃。⑦包埋、切片：完成浸蠟的細(xì)胞塊，將其密封在小蠟塊中完成包埋工作，包埋完成后的細(xì)胞塊可長期保存，多次重復(fù)進(jìn)行切片。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)染色。①切片：制作細(xì)胞蠟塊切片，其厚度在2～3 μm，隨后置入烤箱（65℃）60 min后，移出，冷卻至室溫。②脫蠟和水化：選新鮮二甲苯，將石蠟切片置入，共浸泡2次，20 min/次。除去多余液體，選無水酒精，共浸泡2次，3 min/次。出去多余液體，選95%酒精，共浸泡3 min；除去多余液體，選85%酒精，共浸泡3 min；最后，自來水連續(xù)沖洗1 min。③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：選3% H2O2溶液，置入染色架，連續(xù)浸泡5～10 min后，使用PBS溶液沖洗，3 min/次，共3次。④抗原修復(fù)：取修復(fù)液適量，置入壓力鍋，大功率加熱至沸騰，功率調(diào)至中度，并置入染色架，壓力閥扣上，不終止加熱。待壓力閥噴氣，計(jì)時(shí)2 min。壓力鍋停止加熱，并移走，壓力鍋流水沖淋，直至修復(fù)液冷卻，蒸餾水連續(xù)沖洗切片3次，并對待測組織區(qū)域使用圓珠筆圈定在玻片上，使用PBS溶液沖洗3 min，共3次。⑤加一抗：除去PBS溶液后，加一抗100 μL，孵育60min（室溫下），PBS沖洗3 min，共計(jì)3次。已知陽性切片、PBS代替一抗為惡性對照、良性對照。⑥加酶標(biāo)二抗：PBS溶液除去，加酶標(biāo)二抗100 μL，孵育15 min（室溫下），使用PBS溶液沖洗3 min，共3次。⑦DAB顯色：PBS溶液除去，取新鮮配置的DAB顯色液100～200 μL，孵育3～5 min（室溫下），沖洗使用清水。⑧復(fù)染：清水沖洗后，置入蘇木素染缸10～30 s后，自來水沖洗至返藍(lán)。⑨脫水：依次在85%、95%、100%酒精中各浸泡3 min。⑩透明：二甲苯。 封片：中性樹膠、蓋玻片；閱片：光學(xué)顯微鏡下閱片。

表1 300例患者積液檢查結(jié)果對比

表2 乙組檢測的良性組和惡性組中不同標(biāo)記物免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果對比[例（%）]

1.3 觀察指標(biāo)

檢測結(jié)果分析工作有2名或以上資深診斷醫(yī)師完成，使用En-Vision法，研究所用試劑均購自北京中杉，如：甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、細(xì)胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）及間皮細(xì)胞（mesothelial cell，MC）等；陽性為棕褐色、棕黃色，表示胸腔積液為惡性；陰性為無色、染色淺及陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞的5%，表示胸前積液為良性。

以Light標(biāo)準(zhǔn)為積液性質(zhì)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]，即：滿足以下三條之一，即可證明積液是陽性（惡性），（1）胸液蛋白/血清蛋白＞0.5；（2）胸液乳酸脫氫酶/血清乳酸脫氫酶＞0.6；（3）胸液乳酸脫氫酶＞2/3血清乳酸脫氫酶正常值。上述3條均不符合，則表示為陰性（積液為良性）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者積液檢查結(jié)果

參考Light標(biāo)準(zhǔn)判斷，300例受檢患者中，檢出良性患者32例惡性檢出人數(shù)為268例，不確定0例。其中甲組行常規(guī)染色顯微鏡下觀察涂片的檢查結(jié)果顯示，良性（未查見癌細(xì)胞）52例，惡性（查見癌細(xì)胞）223例，不確定患者有25例（經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)等證明，良性9例，惡性16例）。乙組行細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色的檢查結(jié)果顯示，良性42例，惡性258例，不確定0例。

2.2 患者積液檢查惡性率、漏檢率結(jié)果對比

甲組的惡性檢出率為74.33%（223/300），漏檢率為15.00%（45/300）。乙組惡性檢出率為86.00%（258/300），漏檢率為3.33%（10/300）。乙組惡性檢出率高于甲組、漏檢率低于甲組（P＜0.05），見表1。

2.3 乙組檢測的良性組和惡性組中不同標(biāo)記物免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果對比

惡性組的TTF-1、CEA、CK7表達(dá)率高于良性組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但兩組的CK20、MC表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

胸腔積液為臨床常見疾病，準(zhǔn)確地判斷良惡性對患者疾病診治、預(yù)后意義重大。若疾病未及時(shí)檢出，極易延誤患者最佳治療時(shí)機(jī)，影響患者后續(xù)治療，甚至危及患者生命安全。因此，做好胸腔積液檢查工作意義重大。既往胸腔積液離心后，多制作細(xì)胞涂片后，對涂片進(jìn)行觀察，是臨床最基本診斷方式。雖然能夠幫助臨床解決一定的實(shí)際問題，但無法滿足現(xiàn)有臨床需求[6]。因胸腔積液中存在呈現(xiàn)分離狀的細(xì)胞和組織，利用常規(guī)涂片觀察法無法對其良、惡性進(jìn)行觀察，且在多種因素影響下，如：細(xì)胞量少、細(xì)胞變性或重疊以及涂片質(zhì)量差等，極易錯(cuò)誤判斷患者疾病[7]。

目前，外科組織病理學(xué)常用免疫組織化學(xué)進(jìn)行臨床診斷，有助于判斷待測腫瘤相關(guān)信息，如：良惡性、組織來源及亞型[8]。如何在細(xì)胞學(xué)中應(yīng)用免疫組織化學(xué)，臨床想了多種方式，如：多張涂片免疫細(xì)胞化學(xué)染色、細(xì)胞涂片退染免疫細(xì)胞化學(xué)染色及細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)。

細(xì)胞蠟塊制備，是通過離心細(xì)胞懸浮液得到細(xì)胞塊，再經(jīng)固定、脫水、包埋等操作后得到細(xì)胞蠟塊[9]。目前，臨床常用細(xì)胞塊制作方式，大體分為兩種，分別是有試管包埋法、離心管沉淀制備法的直接法和Histo Gel制備法、雄姿細(xì)胞塊制備的間接法。本次研究選擇應(yīng)用離心沉淀制備法，細(xì)胞蠟塊富含豐富的有核細(xì)胞層，具有細(xì)胞數(shù)量多、染色鮮艷、組織結(jié)構(gòu)保存完整等優(yōu)勢。同時(shí)，細(xì)胞蠟塊，可連續(xù)切片和長期保存，使細(xì)胞學(xué)具備組織病理學(xué)特點(diǎn)，故細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色已成為胸腔積液性質(zhì)判斷的重要手段，制備好的細(xì)胞蠟塊可行多次切片處理，因此臨床醫(yī)師可多次重復(fù)檢查可以細(xì)胞，若檢測出棕褐色的顆粒，表示此胸腔積液性質(zhì)為惡性，故使用細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色的檢出率高[10]。另外，細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色的流程不繁瑣，便于進(jìn)行下一步的分析蠟塊免疫組化，有利于臨床醫(yī)師準(zhǔn)確判斷和分析組織的來源。與常規(guī)染色顯微鏡下觀察涂片相比，應(yīng)用優(yōu)勢極為明顯，主要是應(yīng)用細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法后，幾乎不出現(xiàn)細(xì)胞丟失問題，其結(jié)果也不受細(xì)胞量的多少影響，從而明顯提升胸腔積液的惡性檢出率[11]。

胸腔積液需要一組標(biāo)志物對其炎癥反應(yīng)、間皮瘤還是轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行鑒別診斷，常用的是TTF-1、CEA、CK7、CK20及MC等。TTF-1是一種核蛋白，分子量為38 kDa，于呼吸道上皮細(xì)胞等部位選擇性表達(dá)，故是一種較為理想的檢測肺癌性胸腔積液的標(biāo)志物。CK7分子量為54 kDa，常于卵巢、肺等組織的上皮細(xì)胞表達(dá)，幾乎不于胃腸道表達(dá)。有學(xué)者指出[12]，細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測TTF-1、CK7、CK20，能夠找出胸腔積液的來源。在本次研究中，乙組惡性檢出率高于甲組，漏檢率低于甲組（P＜0.05）。惡性組的TTF-1、CEA、CK7表達(dá)率高于良性組（P＜0.05），但CK20、MC表達(dá)在兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢娪诔Ｒ?guī)染色顯微鏡下觀察涂片相比，應(yīng)用細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對胸腔積液的惡性檢出率高。同時(shí)，細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法還可提供客觀的細(xì)胞病理學(xué)診斷依據(jù)，初步判斷腫瘤細(xì)胞的形態(tài)，不僅可以判斷胸腔積液的良惡性，還可明確腫瘤細(xì)胞的病理類型，揭示組織來源確定診斷范圍。

綜上所述，在胸腔積液診斷中，應(yīng)用細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法胸腔積液惡性檢出率明顯高于常規(guī)染色顯微鏡下涂片，且可進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)移癌的來源及類型。細(xì)胞蠟塊具有長時(shí)間保存優(yōu)勢，因此細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對提高細(xì)胞學(xué)診斷準(zhǔn)確性有較大幫助。當(dāng)前，已有在宮頸及非婦科液基細(xì)胞學(xué)的細(xì)胞蠟塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色法已有研究。在今后的工作中，學(xué)者將不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，不斷提高細(xì)胞學(xué)診斷水平。