王穎秋，鄭 巖，王春偉，高漫雪，王相國通信作者

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京朗心睿明生物技術(shù)有限公司，北京 102299；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師畜牧獸醫(yī)站，新疆 伊犁 833200)

0 引言

皮膚是機(jī)體的第一道防線，能夠防止外界有害物質(zhì)對機(jī)體的入侵以及阻止體內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)的流失，起到維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的屏障作用[1]。而皮膚受傷后，一般情況下，傷口暴露在外會引起細(xì)菌感染、水分和蛋白質(zhì)流失、內(nèi)分泌功能失調(diào)和免疫系統(tǒng)破壞、嚴(yán)重時還會引起一系列臨床并發(fā)癥。這種情況下，在傷口處覆蓋傷口敷料使傷口處于一個利于愈合的微環(huán)境對于傷口的愈合和后期的臨床治療至關(guān)重要[2-3]。

理想的傷口敷料除了具有保持傷口環(huán)境的最佳濕度外，還具備避免傷口發(fā)生二次感染、可吸收傷口滲出液、減少傷口表面壞死、保持創(chuàng)面彈性、生物相容性良好等功能[4]。目前，在“濕性愈合理論”的支撐下，創(chuàng)面的治療發(fā)生了革命性的變化。臨床治療中，泡沫敷料、高壓敷料、負(fù)壓敷料、膠原敷料、海藻酸鈉敷料等主動型敷料(新型傷口敷料)已經(jīng)逐漸取代了被動型敷料(如干紗布和油紗布等)[5-12]。

影響傷口愈合的因素有很多，而氧氣則是影響傷口愈合過程中一種至關(guān)重要的因素，因此從氧氣這一因素著手來探究含氧敷料對皮膚全層創(chuàng)傷的愈合效果。含氧敷料除了能為傷口提供必要的氧氣之外，還有抑菌、保持創(chuàng)面濕潤、隔熱等促進(jìn)傷口愈合的作用。目前，含氧敷料在國外已經(jīng)被普遍應(yīng)用，但在國內(nèi)應(yīng)用或者報道還較少。而小型豬的皮膚結(jié)構(gòu)與人類的皮膚結(jié)構(gòu)極為相似，且小型豬全層皮膚缺損創(chuàng)面模型制備簡便、快速，創(chuàng)傷程度均一，是進(jìn)行創(chuàng)傷愈合及外用藥物對創(chuàng)面愈合影響研究的較理想模型。用此模型可進(jìn)行創(chuàng)面面積、傷腔容積、愈合時間及創(chuàng)面組織的病理、生化及分子生物學(xué)分析[14]。因此試驗選用巴馬小型豬來制備動物模型并用含氧敷料來研究其對于皮膚全層創(chuàng)口的愈合效果，確定含氧敷料促進(jìn)傷愈合的有效性，進(jìn)而為在國內(nèi)應(yīng)用到人皮膚外科治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、儀器與動物來源

1.1.1 主要試劑與儀器

阿托品、鹽酸賽拉嗪注射液、異氟烷、含氧敷料(北京朗心睿明生物科技有限公司提供)、甲醛、特制致傷器、取材器、光學(xué)顯微鏡。

1.1.2 實驗動物

巴馬小型豬20 kg，9月齡(購自北京通和立泰生物科技有限公司)。飼喂北京科澳協(xié)力有限公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化小型豬飼料，每頭每天分2次供給其體重3%的飼料，自由飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備與分組

巴馬小型豬3頭術(shù)前禁食12 h，4 h禁水，然后稱重，用0.05 mg/kg阿托品和0.1 mL/kg鹽酸賽拉嗪注射液進(jìn)行肌肉注射，待小型豬肢體活動穩(wěn)定后，取俯臥位固定于手術(shù)臺上。將呼吸面罩與麻醉呼吸機(jī)連接，吸入5%濃度的異氟烷進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，當(dāng)小型豬的四肢出現(xiàn)松弛、活動消失后，及時進(jìn)行氣管內(nèi)插管術(shù)，使用濃度為0.5%異氟烷進(jìn)行麻醉維持[15]。①傷口規(guī)劃：在小型豬背部剃毛，面積為40 cm×25 cm，消毒完畢后以背部脊柱為正中線，在兩側(cè)各2 cm處由前至后各規(guī)劃4個邊長為5 cm的正方形創(chuàng)面，總共8個創(chuàng)面(圖1A)。②取皮操作：用特制致傷器(直徑18 mm打孔器)在規(guī)劃好的區(qū)域進(jìn)行取皮操作，垂直于皮膚向下鉆至肌肉筋膜，抽出致傷器，剪去已鉆掉的皮膚[14]，形成8個深達(dá)肌肉筋膜的正方形全層皮膚缺損創(chuàng)面(圖1B)。③傷口包扎：將正中線左右兩側(cè)所制備的創(chuàng)面分別為空白對照組和實驗組，空白對照組的創(chuàng)面用普通紗布進(jìn)行包扎，實驗組的創(chuàng)面則用含氧敷料進(jìn)行包扎(圖1C)。在術(shù)后0 d、7 d、14 d、21 d分別拍照，觀察創(chuàng)口恢復(fù)情況。

圖1 小型豬同體自身對照全層皮膚缺損創(chuàng)面(左側(cè)為普通紗布包扎，右側(cè)為含氧敷料包扎)

1.2.2 取樣與HE染色

在術(shù)后0 d、7 d、14 d、21 d時用直徑為1 mm的取材器在每個創(chuàng)面均勻取5個深至肌層的、直徑為1 mm的柱狀組織塊，然后用10%甲醛溶液固定組織塊，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色[15]，顯微鏡觀察組織切片并拍照。

1.2.3 CD31 免疫組化染色

分別取普通繃帶和含氧敷料處理7 d、14 d、21 d豬全層皮膚，石蠟包埋并切片，石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，(如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行)； 5%～10%正常胎牛血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2 h；PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37℃孵育10～30 min；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10～30 min；PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃孵育10～30 min；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10～30 min；PBS沖洗，5 min×3次；顯色劑顯色(DAB或AEC)；自來水充分沖洗，復(fù)染，封片，照相。

1.2.4 Masson染色分析

石蠟切片脫蠟至水；鉻化處理或去汞鹽沉淀(甲醛固定的組織此步可略)；依次自來水和蒸餾水洗；用Regaud蘇木精染液或Weigert蘇木精液染核5～10 min；充分水洗，如過染可鹽酸酒精分化；蒸餾水洗；用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min；以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min；不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)或光綠液染5 min；以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固，照相。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有圖片均為3次獨立重復(fù)試驗后選取的代表性圖片。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果

術(shù)后7 d時，普通紗布處理和含氧敷料處理的所有創(chuàng)面均已結(jié)痂，普通紗布繃帶組(對照組)的創(chuàng)面形成干痂，顏色較深，觸之堅硬且比較干燥，含氧敷料組(實驗組)的創(chuàng)面結(jié)痂顏色較淺，觸之較為柔軟濕潤。術(shù)后14 d時，部分痂皮已脫落，對照組痂皮脫落后的部分可見瘢痕組織生長不平整，實驗組痂脫落后部分瘢痕組織較為平整。術(shù)后21 d時2組處理創(chuàng)面的痂皮已基本脫落，對照組創(chuàng)面瘢痕觸之干燥，質(zhì)地較硬且不平整，而實驗組的創(chuàng)面瘢痕觸之柔軟有彈性且較為平整，如圖2所示。

圖2 術(shù)后不同時間點各組小型豬全層皮膚缺損創(chuàng)面大體觀察(左側(cè)為普通紗布包扎，右側(cè)為含氧敷料包扎)

2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，治療7 d時，對照組和實驗組真皮細(xì)胞層內(nèi)均可見大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮層形成不良；實驗組表皮基底層已形成一層完整的單層基底細(xì)胞，而對照組基底層細(xì)胞尚不完整。實驗組表皮棘層細(xì)胞核染數(shù)量明顯多于對照組。治療14 d時，實驗組表皮層細(xì)胞層數(shù)明顯多于對照組。治療21 d時，對照組和實驗組表皮各層細(xì)胞均已完成修復(fù)，而實驗組真皮乳頭修復(fù)明顯好于對照組，如圖3所示。

圖3 術(shù)后不同時間點各組小型豬全層皮膚缺損創(chuàng)面蘇木精-伊紅染色結(jié)果觀察( 200 μm)

2.3 CD31檢測結(jié)果

CD31指代血管內(nèi)皮細(xì)胞形成，免疫組化結(jié)果顯示，治療7 d和14 d時，實驗組中CD31蛋白的表達(dá)強度明顯強于對照組中CD31蛋白的表達(dá)強度。而在治療21 d時，對照組中CD31蛋白的表達(dá)強度明顯強于實驗組中CD31蛋白的表達(dá)強度。說明含氧敷料在治療的早期就已經(jīng)促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成，加速損傷局部血管形成，加速愈合，如圖4所示。

圖4 術(shù)后不同時間點各組小型豬全層皮膚缺損創(chuàng)面CD31蛋白表達(dá)結(jié)果觀察

2.4 Masson檢測結(jié)果

Masson染色中膠原纖維、黏液、軟骨呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核黑藍(lán)色。在治療的7 d和14 d，實驗組中藍(lán)色膠原纖維的增殖明顯強于對照組，且在14 d時排列緊密，并交織成網(wǎng)，促進(jìn)了真皮層的修復(fù)。治療21 d時，對照組中膠原纖維才出現(xiàn)增殖，而實驗組中皮下脂肪已經(jīng)形成，如圖5所示。

3 討論

皮膚創(chuàng)面愈合是炎性細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等多種因素共同參與，并相互調(diào)控又高度協(xié)調(diào)的復(fù)雜過程[16]。而氧氣對上述各種因素的合成有重大影響，含氧敷料正是利用這點，對創(chuàng)面輸送氧氣來促進(jìn)創(chuàng)口的愈合，起到減少感染，保持創(chuàng)面濕潤等作用。

本研究中所用的含氧敷料可以向傷口部位提供氧氣，促進(jìn)傷口愈合，同時可以解決膠原類敷料因為吸水而易破損，薄膜類敷料不透水造成的頻繁更換，海藻酸鈉類敷料與水反應(yīng)生成明膠和皮膚粘連不易分離等問題[1]?？瞻讓φ战M使用的是以紗布為代表的傳統(tǒng)敷料，現(xiàn)在在臨床上使用廣泛，但其缺點是容易與創(chuàng)面粘連，抗感染能力差，主要原敷料吸收大量滲出物并干燥，更換時敷料粘連引起病人疼痛、新生上皮脫落等情況[5]。

圖5 術(shù)后不同時間點各組小型豬全層皮膚缺損創(chuàng)面masson染色結(jié)果觀察

通過直觀傷口發(fā)現(xiàn)，含氧敷料包扎創(chuàng)面結(jié)痂顏色較淺，保持濕潤狀態(tài)，觸之柔軟，創(chuàng)面愈合較快；普通紗布包扎創(chuàng)面結(jié)痂顏色深，堅硬干燥，創(chuàng)面愈合較慢。含氧敷料還有保持創(chuàng)面濕潤的作用，但也不會使創(chuàng)面過度濕潤導(dǎo)致愈合組織耐力降低，從而提高了傷口的愈合速度。眾多研究同樣證實“濕性愈合”有利于創(chuàng)面愈合，濕潤的環(huán)境促進(jìn)組織纖維蛋白溶解及毛細(xì)血管形成，調(diào)節(jié)傷口氧張力，促進(jìn)多種生長因子釋放并上調(diào)其活性，從而加速愈合速度[5]。

組織學(xué)結(jié)果證實，在術(shù)后7 d時，實驗組的創(chuàng)面已有大量血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，用于新生毛細(xì)血管的合成，為創(chuàng)口愈合營造良好的組織生長環(huán)境，14 d后實驗組創(chuàng)面的毛細(xì)血管數(shù)量要多于對照組。良好的局部血液循環(huán)能保證傷口修復(fù)所需要的營養(yǎng)和氧，有利于壞死物質(zhì)吸收、運輸，控制局部感染。研究發(fā)現(xiàn)傷口膠原蛋白含量、傷口創(chuàng)面強度與組織氧張力和組織灌注呈正相關(guān)[17]。若創(chuàng)面組織處于持續(xù)缺氧狀態(tài)，則會導(dǎo)致創(chuàng)口炎癥癥狀維持甚至嚴(yán)重，從而阻障創(chuàng)口愈合的進(jìn)程。此外，用含氧敷料包扎傷口還能夠維持創(chuàng)面組織氧分壓，以維持白細(xì)胞活性，起到抑菌的作用，并且促進(jìn)膠原蛋白合成和細(xì)胞再生。然而，術(shù)后21 d時對照組創(chuàng)面的成纖維細(xì)胞數(shù)量要遠(yuǎn)多于實驗組，成纖維細(xì)胞的過量增殖雖然有利于膠原蛋白的合成，但是促進(jìn)肉芽組織的過度生長，導(dǎo)致傷口的疤痕形成。而含氧敷料能夠保證適度肉芽組織的增殖，減少疤痕組織的形成。

根據(jù)CD31和Masson檢測結(jié)果可知，整個愈合過程中實驗組CD31的表達(dá)強度要明顯強于對照組，并且實驗組中膠原纖維的增值速度也明顯快于對照組。在術(shù)后14 d時，實驗組創(chuàng)面的膠原纖維已是排列緊密的狀態(tài)，而對照組的還未開始增殖；術(shù)后21 d時，實驗組創(chuàng)面的皮下脂肪已基本形成，而對照組的膠原纖維才開始增殖，且實驗組的血管形成也明顯快于對照組。綜合以上各項實驗結(jié)果可知，采用含氧敷料的實驗組在創(chuàng)口早期就對創(chuàng)口愈合有明顯的促進(jìn)作用，包括促進(jìn)細(xì)胞和膠原蛋白合成再生，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠原纖維增殖等，為創(chuàng)口的愈合營造了一個優(yōu)良的環(huán)境。

4 結(jié)論

本實驗利用巴馬小型豬來構(gòu)建動物模型，并采用了同體自身對照的方法來研究含氧敷料對全層皮膚創(chuàng)傷的愈合效果。研究結(jié)果顯示，含氧敷料能夠為創(chuàng)面提供氧氣，來促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的增殖，提高各種細(xì)胞因子的活性，保持創(chuàng)面濕潤，并且起到了抑制細(xì)菌生長繁殖，減少創(chuàng)口感染的作用，從而加速創(chuàng)傷愈合。含氧敷料對巴馬小型豬皮膚全層創(chuàng)傷的愈合有顯著促進(jìn)效果。