郝小花，向玉婷，曾 孟，楊友偉，謝 鵬，李 密，李東屏，田連福*

(1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，中國(guó)湖南常德415000；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410081)

株高是水稻最重要的性狀之一，理想的株高在水稻育種中占有重要地位，中等矮化有利于水稻品種耐肥、抗倒伏和高產(chǎn)。矮化突變體的分離和鑒定有助于闡明植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制[1]。研究表明，水稻的高度受株高主效基因的控制，同時(shí)受基因修飾、基因抑制等多種因素的影響[2]。這些基因的變化可以導(dǎo)致植物細(xì)胞水平的變化，如節(jié)間細(xì)胞縮短、數(shù)量減少等，其中一些與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，另一些與相關(guān)激素的生物合成有關(guān)[3]。已報(bào)道的涉及水稻株高的基因有很多，如SD1[4]、SLR1[5]、EUI1[6]、D11[7]、BRD1[8]、D2[9]、D33[10]、D53[11]等，這些基因在赤霉素(gibberellin，GA)或油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和合成中起著非常重要的作用。

GA是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的植物激素之一，不僅在植物株高調(diào)控過(guò)程中具有重要的作用，而且在調(diào)控種子萌發(fā)、下胚軸伸長(zhǎng)、葉片伸展及花、果實(shí)、種子發(fā)育等眾多生理過(guò)程中也起著重要的作用[12]。近年來(lái)，隨著擬南芥、水稻等模式植物的應(yīng)用，GA在高等植物中的生物合成調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面的研究取得突破性進(jìn)展[13]。Kobayashi等[14]對(duì)水稻日本晴的營(yíng)養(yǎng)組織和生殖組織中的內(nèi)源GA進(jìn)行了詳細(xì)分析，一共鑒定到13種GA，不同種類(lèi)的GA可能參與不同的生理過(guò)程。水稻的兩個(gè)矮化品種Tan-ginbozu(dx突變體)和Waito-C(dy突變體)的地上部分均表現(xiàn)出GA缺陷的表型[15]，外源施加貝殼杉烯可以刺激Tanginbozu地上部分的伸長(zhǎng)[16]。然而，尚未確定由Dx和Dy基因所控制的GA生物合成途徑的具體步驟[17]。d35是一個(gè)與GA合成相關(guān)的突變體，D35基因編碼GA合成初始階段的合成酶——貝殼杉烯氧化酶(kaurene oxidase，KO)，該基因的突變使GA前體物質(zhì)的產(chǎn)生減少，最終出現(xiàn)植株矮化的現(xiàn)象[3]。sbl(shortened basal internodes)是一個(gè)半矮桿突變體，SBL基因編碼GA合成關(guān)鍵酶GA2ox(gibberellin 2-oxidase)，該基因的突變導(dǎo)致GA合成受阻，從而使植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象[18]。SBL主要在水稻莖稈的基部表達(dá)，所以矮化現(xiàn)象集中出現(xiàn)在水稻基部節(jié)間位置，從而使水稻獲得更強(qiáng)的抗倒伏能力。水稻EUI(elongated uppermost internode)基因編碼一個(gè)可以失活GA的P450蛋白酶，該基因突變后導(dǎo)致活性GA在水稻最上節(jié)間過(guò)度積累，從而引起長(zhǎng)頸穗的植株表型[19]。

GA與其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)之間存在相互作用，如細(xì)胞分裂素(cytokinin，CK)。Fleishon 等[20]證實(shí)在番茄花青素積累過(guò)程中，施加CK可以促進(jìn)花青素的積累，施加GA則抑制花青素的積累，而同時(shí)施加GA和CK時(shí)，GA會(huì)完全抑制CK的作用。另外，在番茄下胚軸伸長(zhǎng)過(guò)程中，外施GA可以促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)，而外施CK對(duì)下胚軸的伸長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，當(dāng)同時(shí)施加GA和CK時(shí)，則完全抑制由GA所引起的下胚軸伸長(zhǎng)。此外，在番茄座果形成及發(fā)育過(guò)程中，生長(zhǎng)素應(yīng)答因子ARF7(auxin response factor 7)參與GA誘導(dǎo)的細(xì)胞膨大與生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂[21]。因此，GA所參與的植株形態(tài)的改變不僅是由于其含量的變化，也涉及GA與其他生長(zhǎng)物質(zhì)相互作用而進(jìn)行的多重調(diào)節(jié)。

課題組前期從水稻Kitaake(Oryza sativa L.japonica)甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)誘變的M2群體中分離到一株超矮桿突變體ag1(ai-gan1)，表型分析顯示突變體節(jié)間長(zhǎng)度及其所占整株比例發(fā)生顯著改變。為了對(duì)導(dǎo)致植株矮化的基因進(jìn)行精確定位，我們利用MBS(mapping-bysequencing)方法對(duì)超矮桿突變體與野生型(wild type，WT)雜交F1代自交產(chǎn)生的F2后代進(jìn)行全基因組序列比對(duì)分析，共篩選到6個(gè)導(dǎo)致蛋白質(zhì)可讀框發(fā)生改變的突變基因，并利用CRISPR-Cas9技術(shù)最終確定導(dǎo)致植株矮化的基因位于1號(hào)染色體，編碼赤霉素3β-羥化酶2(gibberellin 3-betahydroxylase 2，GA3ox2)，是D18的等位基因。d18突變體的發(fā)現(xiàn)較早[22]，但其細(xì)胞學(xué)研究卻較少。本文通過(guò)對(duì)突變體節(jié)間和劍葉的細(xì)胞學(xué)特性進(jìn)行觀(guān)察及對(duì)部分細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OsGA3ox2不僅抑制倒二節(jié)間細(xì)胞的伸長(zhǎng)，而且影響劍葉和節(jié)間細(xì)胞縱向、橫向的分裂能力，在水稻地上部分的形態(tài)發(fā)育中起著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水稻ag1矮桿突變體來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的EMS誘變的M2突變體庫(kù)，其遺傳背景為粳稻品種Kitaake。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)沙和海南實(shí)驗(yàn)基地的多代自交和選擇，突變體表型穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)使用的引物和 LB、N6D、AB、AAM、2N6-AS培養(yǎng)基試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。N6D、AB、AAM、2N6-AS培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[23]。RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶、高保真酶、內(nèi)切酶等購(gòu)自Invitrogen 公司(美國(guó))。q-RT-PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)試劑為SYBR GreenⅠ，購(gòu)自Promega公司(美國(guó))。實(shí)驗(yàn)所用Cas9載體、sg-RNA載體由北京大學(xué)瞿禮嘉教授提供；農(nóng)桿菌EHA105、大腸桿菌TOP10為本實(shí)驗(yàn)室保存。

取顆粒飽滿(mǎn)、活性一致(同時(shí)期種植、同時(shí)收獲)的野生型和突變體種子同期催芽、播種，比較野生型和突變體各個(gè)時(shí)期地上部分的差異，并記錄各個(gè)時(shí)期相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)，主要包括株高、分蘗數(shù)、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬、千粒重、各節(jié)間長(zhǎng)等。將ag1矮桿突變體與野生型雜交，獲得F1代，F(xiàn)1自交后獲得的F2代。材料種植成8行×8株規(guī)格的小區(qū)，行株距為20 cm×20 cm，成熟時(shí)從地面至穗頂測(cè)量株高。節(jié)間縱向細(xì)胞總數(shù)的估算方法為:節(jié)間的平均長(zhǎng)度/細(xì)胞平均長(zhǎng)度。

1.2 MBS全基因組測(cè)序定位

分別以野生型植株20株、自交F2后代中100株正常高度和100株矮桿植株的葉片為材料，構(gòu)建3個(gè)DNA庫(kù)。利用MBS_QTL全基因組測(cè)序?qū)?個(gè)DNA庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，篩選候選基因。將過(guò)濾后的高質(zhì)量reads與參考基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ricedata.cn/gene/)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)篩選出的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)進(jìn)行鑒定與分型，根據(jù)篩選出的SNP位點(diǎn)在3個(gè)DNA庫(kù)中出現(xiàn)的頻率統(tǒng)計(jì)，篩選得到符合比例的SNP位點(diǎn)。測(cè)序和SNP位點(diǎn)篩選由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.3 CRISPR-Cas9基因敲除載體構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下載初步篩選的候選基因的編碼序列(coding sequence，CDS)，按照 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)靶序列設(shè)計(jì)的要求為每個(gè)候選基因設(shè)計(jì)兩個(gè)不同的靶序列[24]，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成靶序列(表1)。將正反向引物稀釋至10 μmol/L后混合，PCR退火后再稀釋成0.1 μmol/L。用BasⅠ酶切sg-RNA原始載體，體系為sg-RNA 2 μL、buffer 2 μL、BasⅠ內(nèi)切酶 2 μL、ddH2O 14 μL，37 ℃酶切過(guò)夜，純化酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶連接sg-RNA和PCR退火產(chǎn)物，體系為ddH2O 6 μL、buffer 1 μL、sg-RNA 酶切產(chǎn)物 1 μL、PCR 退火產(chǎn)物1 μL、T4連接酶1 μL，22 ℃水浴 6～8 h。用42 ℃熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，隨后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含卡那霉素(kanamycin，Kan)的LB平板，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)繁，小量提取質(zhì)粒并與Cas9載體進(jìn)行LR重組反應(yīng)，體系包含ddH2O 7 μL、陽(yáng)性質(zhì)粒 1 μL、Cas9 載體 1 μL、LR mix 1 μL，25 ℃水浴 1 h，隨后加入 1 μL protein K，37 ℃水浴20 min終止反應(yīng)。用42℃熱激法將LR重組反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，隨后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含壯觀(guān)霉素(spectinomycin，Spe)的LB平板，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)繁，小量提取質(zhì)粒，得到CRISPR-Cas9基因敲除載體。

表1 Os01g0177400基因CRISPR-Cas9的靶位點(diǎn)引物Table 1 Primers used for Os01g0177400 knockout with CRISPR-Cas9 system

1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

電轉(zhuǎn)杯預(yù)先用無(wú)水乙醇浸泡，再依次用超純水清洗5次、無(wú)水乙醇清洗5次，最后在超凈工作臺(tái)內(nèi)置于干凈濾紙上晾干。將EHA105感受態(tài)與CRISPR-Cas9基因敲除載體置于冰上溶解3 min，同時(shí)用手套包住電轉(zhuǎn)杯置于冰上。取1 μL CRISPRCas9基因敲除載體質(zhì)粒(稀釋100倍)混勻于EHA105感受態(tài)中，冰浴5～15 min。在無(wú)菌的EP管中加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，置于37℃水浴鍋中預(yù)熱。將混有質(zhì)粒的感受態(tài)轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯，并于電轉(zhuǎn)儀上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)后加入300 μL已預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，混勻，并將菌液完全吸出至無(wú)菌EP管中，37℃水浴1 h。吸取100 μL菌液涂布于具有Spe抗性的LB平板，30℃倒置培養(yǎng)30～48 h。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將在AB培養(yǎng)基活化3 d的農(nóng)桿菌EHA105(含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒)挑取到100 mL AAM液體培養(yǎng)基(加入1 g/L乙酰丁香酮1.5 mL)中，180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，使其OD600為0.1～0.15。將水稻成熟胚誘導(dǎo)7 d的愈傷組織挑入上述AAM菌液中，輕搖2～3 min，棄菌液，于超凈工作臺(tái)晾干；將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到2N6-AS培養(yǎng)基中(墊一張無(wú)菌濾紙)，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d，隨后用無(wú)菌水洗滌8次，每次3 min，再用羧芐青霉素水洗滌5 min，置于無(wú)菌濾紙上晾干；將晾干的愈傷組織接種到含羧芐青霉素和潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，30℃連續(xù)光照培養(yǎng)至新愈傷出現(xiàn)，將新愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上(篩選和分化過(guò)程中每7～10 d更換一次培養(yǎng)基)，待分化出芽和根即可將其移到生根瓶中培養(yǎng)[23]。7～10 d后，打開(kāi)瓶蓋，加入少量無(wú)菌水繼續(xù)培養(yǎng)1周，然后將其轉(zhuǎn)移到土壤中，使其繼續(xù)生長(zhǎng)。

1.6 石蠟切片的制作與觀(guān)察

石蠟切片的制作參照文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行，主要步驟如下:將材料于卡諾氏固定液固定，隨后用不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水；在通風(fēng)櫥內(nèi)依次用乙醇-二甲苯混合液與純二甲苯進(jìn)行透明，每次30 min；用二甲苯、石蠟的混合液和純石蠟對(duì)材料進(jìn)行逐步浸蠟；向折好的紙盒中倒入含有材料的純石蠟，靜置，待石蠟?zāi)碳纯蛇M(jìn)行常規(guī)切片；將切好的蠟帶用載玻片進(jìn)行展片；將晾干后的載玻片浸泡于純二甲苯中，5 min，重復(fù)兩次；滴加中性樹(shù)膠于載玻片上，用鑷子夾上蓋玻片，制成永久裝片。用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行切片觀(guān)察。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以野生型和突變體分蘗期未伸長(zhǎng)的新葉為材料，利用Trizol試劑提取總RNA。根據(jù)RNA濃度計(jì)算反轉(zhuǎn)錄所需的RNA體積。cDNA第一鏈的合成采用Thermo Fisher Scientific公司的反轉(zhuǎn)錄試劑，全程配戴口罩和乳膠手套。利用Primer 5軟件根據(jù)目的基因CDS序列設(shè)計(jì)引物(表2)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)體積為30 μL，試劑為SYBR GreenⅠ(Promega)，PCR 反應(yīng)在 Quant Studio 5(Life Technologies公司，美國(guó))中完成，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[25]。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 2 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

1.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件進(jìn)行初步處理，采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體地上部分的形態(tài)分析

分蘗期野生型和突變體植株的表型觀(guān)察結(jié)果顯示，野生型和突變體的劍葉長(zhǎng)分別為(23.81±3.51)cm、(10.72±2.42)cm，突變體劍葉長(zhǎng)只有野生型的 45.02%(圖 1A)，而劍葉寬達(dá)到(1.29±0.14)cm，是野生型(1.04±0.13)cm 的 124.04%(圖 1C)；突變體的平均分蘗數(shù)為9.31個(gè)，野生型為6.82個(gè)，突變體的分蘗數(shù)顯著增多(圖1B，D)。此外，成熟期野生型和突變體籽粒千粒重的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，突變體千粒重為(22.72±1.02)g，野生型為(26.21±1.36)g，突變體顯著低于野生型(圖1E)。以上形態(tài)分析結(jié)果表明，AG1基因的突變對(duì)水稻地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育有較大影響。

圖1 野生型和突變體的農(nóng)藝性狀(A)成熟期劍葉；(B)分蘗期植株形態(tài)；(C)劍葉寬；(D)分蘗數(shù)；(E)千粒重。標(biāo)尺=2 cm；數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**表示差異極顯著(P＜0.01)。Fig.1 Agronomic traits of WT and mutant plants(A)Mature flag leaves；(B)Tillering plant morphology；(C)Flag leaf width；(D)Tillering number；(E)1 000-grain weight.Bar=2 cm.Data are presented as mean ± standard deviation.Asterisks indicate significant difference from the WT plants at**P＜0.01 by Student’s t test.

此外，我們分析了不同時(shí)期突變體的株高，發(fā)現(xiàn)幼苗期、分蘗期和成熟期的突變體均表現(xiàn)出極度矮化(圖2A)，其中成熟期野生型的平均株高為(52.43±5.36)cm，而突變體為(18.25±3.12)cm，僅為野生型的34.81%(圖2B)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)成熟期植株的穗長(zhǎng)以及倒一節(jié)間、倒二節(jié)間和倒三節(jié)間的長(zhǎng)度，結(jié)果顯示野生型各部分的平均長(zhǎng)度依次為(10.91±2.32)cm、(17.13±2.12)cm、(9.91±2.36)cm和(3.64±1.27)cm，而突變體各部分的平均長(zhǎng)度依次為(6.12±1.24)cm、(6.91±2.32)cm、(1.11±0.52)cm和(0.37±0.12)cm，均顯著縮短(圖 2C)。通過(guò)計(jì)算各部分長(zhǎng)度所占整株的比例，我們發(fā)現(xiàn)野生型穗長(zhǎng)以及倒一節(jié)間、倒二節(jié)間和倒三節(jié)間的長(zhǎng)度所占整株比例分別為20.81%、32.67%、18.90%和6.94%，而突變體則為33.53%、37.86%、6.08%和2.03%，突變體穗長(zhǎng)和倒一節(jié)間所占比例有所增加，而倒二節(jié)間和倒三節(jié)間所占整株的比例顯著降低。以上數(shù)據(jù)表明AG1基因突變影響穗長(zhǎng)及各節(jié)間的伸長(zhǎng)，導(dǎo)致植株變矮及各節(jié)間變短且占整株比例發(fā)生改變。

圖2 野生型和突變體的植株形態(tài)及各部分長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)(A)幼苗期、分蘗期和成熟期的植株形態(tài)；(B)成熟期植株高度的統(tǒng)計(jì)；(C)穗長(zhǎng)及各節(jié)間長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)。標(biāo)尺=2 cm；數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**表示差異極顯著(P＜0.01)。Fig.2 Morphology of WT and mutant plants and their length statistics(A)Mutant morphology at different stages；(B)Statistics of plant height at maturity stage；(C)Statistics of internode and panicle lengths.Bar=2 cm.Data are presented as mean±standard deviation.Asterisks indicate significant difference from the WT plants at**P＜0.01 by Student’s t test.

2.2 突變體節(jié)間細(xì)胞的特征分析

為了解突變體節(jié)間長(zhǎng)度變化的原因，我們對(duì)倒一節(jié)間和倒二節(jié)間的中部進(jìn)行切片觀(guān)察，并對(duì)細(xì)胞大小和數(shù)目進(jìn)行測(cè)量與統(tǒng)計(jì)。節(jié)間縱切面的分析結(jié)果顯示:突變體和野生型倒一節(jié)間細(xì)胞的平均長(zhǎng)度分別為(109.85±12.21)μm和(126.14±11.24)μm，突變體倒一節(jié)間的細(xì)胞長(zhǎng)度略小于野生型，約為野生型的87.09%(圖3A，D)；突變體倒二節(jié)間的細(xì)胞長(zhǎng)度為(28.32±5.31)μm(n=50)，顯著小于野生型的(106.23±13.42)μm(n=50)，僅為野生型細(xì)胞長(zhǎng)度的26.66%(圖3B，E)。倒二節(jié)間縱列細(xì)胞總數(shù)目的估算結(jié)果顯示，突變體縱向細(xì)胞數(shù)目顯著減少，約為453個(gè)，但野生型約為1 178個(gè)?？v切面的細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果說(shuō)明，AG1突變不僅導(dǎo)致倒二節(jié)間細(xì)胞長(zhǎng)度變短，而且縱向細(xì)胞數(shù)目也顯著減少。節(jié)間的橫切結(jié)果顯示:突變體的莖稈壁厚度顯著大于野生型(圖3G)；突變體倒二節(jié)間橫向薄壁細(xì)胞的平均層數(shù)為16層，顯著多于野生型的11層(圖3C，F(xiàn))。這些結(jié)果表明，AG1基因的突變顯著抑制倒二節(jié)間細(xì)胞的伸長(zhǎng)和縱向分裂，促進(jìn)倒二節(jié)間細(xì)胞的橫向分裂，從而導(dǎo)致倒二節(jié)間顯著縮短，莖稈壁顯著增厚。

圖3 野生型與突變體倒一節(jié)間和倒二節(jié)間的細(xì)胞形態(tài)(A)倒一節(jié)間縱切面細(xì)胞形態(tài)；(B)倒二節(jié)間縱切面細(xì)胞形態(tài)；(C)倒二節(jié)間橫切面細(xì)胞形態(tài)；(D)倒一節(jié)間縱向細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度統(tǒng)計(jì)；(E)倒二節(jié)間縱向細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度統(tǒng)計(jì)；(F)倒二節(jié)間薄壁細(xì)胞層數(shù)的統(tǒng)計(jì)；(G)倒二節(jié)間橫切面莖厚度的統(tǒng)計(jì)。標(biāo)尺=100 μm；**表示差異極顯著(P＜0.01)。Fig.3 The peduncle and penultimate internode sections of the WT and mutant plants(A)Cell morphology of the peduncle internode in longitudinal section；(B)Cell morphology of the penultimate internode in longitudinal section；(C)Cell morphology of the penultimate internode in transverse section；(D)Cell length and width statistics of the peduncle internode in longitudinal section；(E)Cell length and width statistics of the penultimate internode in longitudinal section；(F)Cell layer statistics of the penultimate internode；(G)Stem thickness statistics of the penultimate internode.Bar=100 μm.Asterisks indicate significant difference from the WT plants at**P＜0.01 by Student’s t test.

2.3 突變體劍葉細(xì)胞的特征分析

由于ag1突變體和野生型的劍葉寬度具有明顯差異，因此對(duì)野生型和突變體劍葉中部的橫切面進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示:突變體劍葉中維管束數(shù)目顯著增加，其中橫切面大維管束數(shù)目平均比野生型多2.43個(gè)，小維管束數(shù)目平均增加9.52個(gè)(圖4A)，但突變體中維管束周?chē)目v向薄壁細(xì)胞數(shù)目顯著減少(圖4B)。

圖4 野生型和突變體的劍葉中部橫切面細(xì)胞形態(tài)(A)劍葉中部橫切面，黑色箭頭標(biāo)示兩個(gè)大維管束之間的小維管束；(B)葉片中間大葉脈的放大圖，紅色箭頭標(biāo)示葉脈中的薄壁細(xì)胞。標(biāo)尺=500 μm。Fig.4 Cell morphology of the transverse section at the middle part of flag leaves of the WT and mutant plants(A)The transverse section of the middle part of flag leaves.The black arrow marks the small vascular bundles between two large vascular bundles；(B)The enlarged picture of the large vascular in the middle of the leaves.The red arrow marks the parenchyma cells in veins.Bar=500 μm.

2.4 水稻AG1基因的定位與功能驗(yàn)證

在ag1突變體和野生型雜交獲得的F1代中，全部植株的高度均正常，但在F1自交后獲得的F2群體中，高、矮植株數(shù)量分別為354株和116株，符合3︰1分離比，表明該突變體矮桿性狀是由單基因控制的隱性遺傳。為了確定矮桿性狀的控制基因，利用MBS全基因組測(cè)序?qū)ν蛔兓蜻M(jìn)行定位，共篩選到6個(gè)導(dǎo)致蛋白質(zhì)可讀框發(fā)生改變的SNP位點(diǎn)，這6個(gè)SNP位點(diǎn)分別分布于1號(hào)染色體的Os01g0156000基因和Os01g0177400基因、8號(hào)染色體的Os08g0352100基因和Os08g-0447100基因、9號(hào)染色體的Os09g0337300基因以及11號(hào)染色體的Os11g0200000基因(表3)。參考中國(guó)水稻網(wǎng)(http://www.ricedata.cn/gene/)數(shù)據(jù)，從6個(gè)基因中篩選出與下胚軸伸長(zhǎng)功能相關(guān)的Os01g0156000基因和與GA合成功能相關(guān)的Os01g0177400基因作為候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)Os01g0156000和Os01g0177400兩個(gè)候選基因分別進(jìn)行基因編輯，在Os01g0156000和Os01g0177400兩個(gè)基因的外顯子區(qū)域分別設(shè)計(jì)兩個(gè)靶序列，構(gòu)建CRISPRCas9基因敲除載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別得到Os01g0156000和Os01g0177400基因敲除的純合體植株?；蚯贸?yáng)性植株的表型顯示，Os01g-0156000基因敲除的陽(yáng)性植株中沒(méi)有出現(xiàn)矮稈性狀的植株，而Os01g0177400基因敲除的陽(yáng)性植株中存在大量的矮化植株。將Os01g0177400基因敲除的純合陽(yáng)性植株分別命名為ag1-2(圖5A)、ag1-3a和 ag1-3b(圖 5B)，ag1-2、ag1-3a和 ag1-3b均表現(xiàn)出與ag1類(lèi)似的矮桿性狀(圖5C)，因此，確定AG1位于1號(hào)染色體的Os01g0177400基因座，該基因編碼一個(gè)赤霉素3β-羥化酶，參與GA的合成代謝。

圖5 Os01g0177400基因靶序列位點(diǎn)及陽(yáng)性植株形態(tài)(A)第一個(gè)靶序列位點(diǎn)；(B)第二個(gè)靶序列位點(diǎn)；(C)基因敲除陽(yáng)性植株形態(tài)。標(biāo)尺=2 cm。Fig.5 Target sequence loci for the gene Os01g0177400 and morphology of positive plants(A)Firsttargetsequencelocus；(B)Secondtargetsequenceloci；(C)Themorphologyofpositiveplantsthroughgeneknockout.Bar=2cm.

2.5 突變體中與細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)量分析

為了了解AG1基因突變后突變體節(jié)間和劍葉細(xì)胞大小與數(shù)目變化的原因，我們進(jìn)一步對(duì)野生型和突變體地上部分細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。根據(jù)已知基因的功能，選取影響細(xì)胞數(shù)目的細(xì)胞周期相關(guān)基因 OsCDKB2；1[26]、CYCA3；1[27]和 CYCB2；2[26]及與細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)的 OsE2Fl、OsMCM3[28]、OsEXPA16[29]和OsXTH28[30]基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。圖6結(jié)果顯示，OsCDKB2；1、OsE2Fl、OsMCM3、OsEXPA16和OsXTH28基因的表達(dá)量在突變體中顯著降低，說(shuō)明AG1的突變對(duì)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)都有一定的影響。

圖6 突變體和野生型中與細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)相關(guān)的部分基因的表達(dá)量變化*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)。Fig.6 Expression levels of genes related to cell division and elongation in the mutant and WT plantsAsterisks indicate significant difference from the WT plants at*P＜0.05 and**P＜0.01 by Student’s t test.

3 討論

Os01g0177400編碼赤霉素3β-羥化酶，該酶是植物體內(nèi)催化產(chǎn)生活性GA的關(guān)鍵酶，在GA的合成過(guò)程中具有重要的作用。早在2001年，人們就在水稻基因組中克隆到兩個(gè)赤霉素3β-羥化酶基因OsGA3ox1和OsGA3ox2[31]，研究表明這兩個(gè)基因具有完全不同的表達(dá)模式，分別主要在植物的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中表達(dá)。這兩個(gè)基因的表達(dá)方式可能與植物營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)生物活性GA的差異有關(guān)[14，32]，其通過(guò)調(diào)控營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中不同形式的活性GA從而調(diào)控植株不同部位的生長(zhǎng)和發(fā)育。

表3 MBS_QTL全基因組篩選的SNP位點(diǎn)Table 3 SNP loci screened from MBS_QTL

在前期研究中，我們將野生型粳稻品種Kitaake用EMS進(jìn)行誘變，在誘變的M2代群體中發(fā)現(xiàn)了超矮桿突變體ag1(圖1A)。將突變體ag1與野生型雜交，獲得的F1代群體全部表現(xiàn)為高桿，而F1自交后代F2群體中高桿和矮桿的數(shù)量比為3︰1，說(shuō)明此矮桿性狀為單基因控制性狀。通過(guò)MBS_QTL技術(shù)篩選到6個(gè)候選的突變基因，進(jìn)一步通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)6個(gè)候選基因進(jìn)行基因敲除驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)只有Os01g0177400基因敲除的后代中出現(xiàn)矮桿性狀的植株(圖5C)，由此確定突變基因?yàn)镺s01g0177400。本研究的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，突變體成熟期的高度只有野生型的34.81%，突變體倒二節(jié)間和倒三節(jié)間的長(zhǎng)度僅占整株高度的6.08%和2.03%，所占整株比例顯著低于野生型，是突變體株高變矮的主要原因(圖2C)。同時(shí)，突變體劍葉變寬，分蘗數(shù)也顯著增加。通過(guò)對(duì)倒一節(jié)間、倒二節(jié)間和劍葉的中部進(jìn)行切片分析發(fā)現(xiàn)，突變體倒一節(jié)間細(xì)胞的長(zhǎng)度有所變短，但較野生型沒(méi)有顯著差異；而倒二節(jié)間細(xì)胞的長(zhǎng)度較野生型顯著變短；倒二節(jié)間縱向細(xì)胞總數(shù)目和劍葉中大維管束周?chē)目v向薄壁細(xì)胞數(shù)目都顯著減少，從而導(dǎo)致突變體倒二節(jié)間長(zhǎng)度顯著縮短、劍葉大維管束變小。同時(shí)，突變體劍葉中小葉脈的數(shù)目和倒二節(jié)間橫向薄壁細(xì)胞層數(shù)較野生型都顯著增多，從而導(dǎo)致突變體劍葉變寬、倒二節(jié)間的莖壁厚度增加(圖3～4)。細(xì)胞形態(tài)的觀(guān)察結(jié)果說(shuō)明，AG1基因突變不僅影響了倒二節(jié)間細(xì)胞的伸長(zhǎng)，而且對(duì)倒二節(jié)間和劍葉細(xì)胞的縱向和橫向分裂能力也具有一定影響。

已有研究表明，GA與其他的生長(zhǎng)物質(zhì)之間存在相互作用并共同調(diào)控植株的發(fā)育，如與CK的拮抗作用等。因此，水稻ag1突變體倒二節(jié)間和劍葉的細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)的變化可能與OsGA3ox2的表達(dá)模式有關(guān)，OsGA3ox2的突變導(dǎo)致不同部位的活性GA含量發(fā)生改變，從而影響相互作用的其他生長(zhǎng)物質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和分裂能力都發(fā)生變化。在本研究的超矮桿突變體ag1中，與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因OsCDKB2；1、OsE2Fl、OsMCM3以及與細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)的基因OsEXPA16和OsXTH28的表達(dá)量都較野生型發(fā)生了明顯的變化，說(shuō)明AG1基因在影響GA合成的同時(shí)，還可能與其他生長(zhǎng)物質(zhì)交叉互作從而嚴(yán)重影響植株的形態(tài)變化，因此，研究GA與其他生長(zhǎng)物質(zhì)的交叉互作，將為闡明植物形態(tài)發(fā)育提供重要的線(xiàn)索。