王韓影，蔣 炎，王晴儀，石 新，牛 田，邢馨丹，沈胤忱，陳 翀，劉 堃

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院眼科，國家眼部疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市眼底病重點實驗室，上海市眼視光及光醫(yī)學工程研究中心，上海市眼科疾病精準診療工程技術研究中心，上海200080

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病引起的主要眼部并發(fā)癥［1］，是工作人群的首要致盲性眼?。?］。根據(jù)DR臨床表現(xiàn)分為非增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜?。╪on-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病（proliferative diabetic retinopathy，PDR）以及糖尿病性黃斑水腫（diabetic macular edema，DME）；其中，PDR及DME被認為是DR最主要的致盲原因［3］。目前已明確的DR危險因素包括糖尿病的類型、病程、高血糖、高血壓以及高血脂狀態(tài)等［3］。

光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）是目前臨床廣泛應用的眼科檢查手段，用于識別DR 形態(tài)學特征，如黃斑水腫、視網(wǎng)膜內囊樣水腫以及視網(wǎng)膜下液等；此外，OCT 可以識別視網(wǎng)膜內層和外層結構的破壞。視網(wǎng)膜外界膜和橢圓體帶的完整性［4-6］、光感受器外層節(jié)段的厚度［7］、視錐細胞外節(jié)末梢的狀態(tài)［5］、視網(wǎng)膜內高反光點［8］以及視網(wǎng)膜下液［9］均可能是與視力相關的因素。視網(wǎng)膜內層結構紊亂（disorganization of retinal inner layers，DRIL）被證明可作為評估DR 患者視力結局的影像學生物標志物［10］。它與視網(wǎng)膜中心凹厚度、血糖水平等相比，與患者視力水平的關系更加密切，并且早期DRIL范圍的變化可用于預測較長期的視力結局。

光學相干斷層掃描血管成像（optical coherence tomography angiography，OCTA）技術可以檢測毛細血管的灌注情況，提供視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡三維圖像。許多OCTA血流檢測指標均已應用于DR 研究，如中心凹無血管區(qū)（foveal avascular zone，F(xiàn)AZ）、血流密度和血管分形維數(shù)（fractal dimension，F(xiàn)D）［11］。有研究［12］發(fā)現(xiàn)FAZ 面積、FD、血流密度和深層毛細血管叢可以預測DR 的發(fā)生，而血流密度和淺層毛細血管叢與DME 的發(fā)生相關。在國內，僅有極少量針對OCTA 標志物與NPDR 或DME 之間關系的研究，且這些研究樣本量較小，考慮因素較為單一［13-14］。

本研究通過對DR 患者影像學數(shù)據(jù)進行分析，尋找不同疾病進程患者之間的影像學差異，并進一步以DME 存在與否為因素進行分組，探究與DME 發(fā)生相關的影像學危險因子，期望找到可以用于預測DME 和DR 發(fā)生、發(fā)展的相關因素，并對其可能的機制進行探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2017 年8 月—2019 年11 月于上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院眼科就診的90 例患者的臨床信息及影像學資料。所有參與研究的患者均確診為糖尿病，并且曾經(jīng)或正在服用至少1種糖尿病藥物。受試者均經(jīng)散瞳眼底檢查后診斷為DR。由臨床技師使用彩色眼底照相（Zeiss Visucam 500 眼底照相機，Carl Zeiss Medite，德國）記錄全部受試者眼底影像（標準七象限彩色眼底照片）；由眼科醫(yī)師進行糖尿病視網(wǎng)膜病變早期治療研究（early treatment of diabetic retinopathy study，ETDRS） 眼底評分［15］。定義雙眼中病程進展較快的一只眼為研究眼。如雙眼病情一致，則隨機選擇任一眼別（Randbetween 函數(shù)生成隨機數(shù)，Microsoft?Excel，版本16.16.8）。排除標準包括非糖尿病性視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜變性、青光眼、活動性眼部炎癥以及影響眼底檢查的角膜疾病和白內障。研究通過上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會審批，審批號為2017KY194。

1.2 信息收集

受試者簽署知情同意書后，填寫基本信息，包括姓名、性別、出生日期、身份證號碼、聯(lián)系方式、身高、體質量和疾病病史。糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、C 反應蛋白、血清總膽固醇、三酰甘油、肌酐、尿酸、尿素的測定值均來自每名受試者的電子病歷記錄（最接近填表日期的記錄）。高血壓、冠狀動脈疾病和血脂異常的病史基于對患者的面對面詢問及電子病歷記錄。

1.3 圖像采集

所有圖像均由經(jīng)驗豐富的臨床技師采集。使用OCT（Spectralis OCT，Heidelberg Engineering，Inc.，德國）對受試者雙眼黃斑區(qū)進行掃描（97線掃描模式）。對于每只研究眼，評估黃斑中心凹1 mm 直徑區(qū)域內的視網(wǎng)膜厚度，存在DME、視網(wǎng)膜層內囊樣水腫、視網(wǎng)膜下液及DRIL 則進行記錄。DME 定義為黃斑中心凹1 mm 直徑區(qū)域內的視網(wǎng)膜厚度，男性≥305 μm，女性≥290 μm［16］的黃斑水腫；或黃斑中心凹1 mm 直徑區(qū)域內出現(xiàn)囊樣水腫和/或視網(wǎng)膜下液。DRIL 定義為在黃斑中心凹1 mm 區(qū)域內，有50%的面積無法區(qū)分視網(wǎng)膜內層中任意兩層之間的界限。所有OCT 掃描都要求信號強度至少達到5。運動偽影、中心位置不佳、數(shù)據(jù)丟失或分割錯誤的OCT 掃描不采用。使用OCTA（PTVue XR，Optovue，Inc.，美國）獲得雙眼眼底血管（6 mm×6 mm 掃描模式）掃描圖像，獲得的OCTA 圖像通過內置軟件自動分割淺層毛細血管叢和深層毛細血管叢：淺層毛細血管區(qū)域設定在內界膜至內叢狀層上10 mm 處；深層毛細血管掃描從內叢狀層上10 mm 處開始至外叢狀層下10 mm 結束。圖像需滿足以下條件：①質量評分不低于6分。②組織層分割準確。③圖像清晰，微毛細血管網(wǎng)可區(qū)分。④圖像中心位置無偏離。⑤圖像無運動偽影。⑥深層毛細血管網(wǎng)上無投影偽影。

1.4 數(shù)據(jù)管理

保存所有患者的原始資料，并在病例報告表中記錄有關的影像學檢查數(shù)據(jù)、實驗室檢查數(shù)據(jù)、眼科檢查數(shù)據(jù)等內容。采用電子數(shù)據(jù)捕獲系統(tǒng)（http：//www.linktree.vip/）進行錄入。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用IBM SPSS statistics version 26（IBM 公司，美國）軟件進行統(tǒng)計學分析。定量數(shù)據(jù)采用例數(shù)、均數(shù)（或中位數(shù)）、標準差進行描述。年齡、血清總膽固醇、尿酸、視網(wǎng)膜厚度、FAZ 及血流密度符合正態(tài)分布，以-x±s的形式表示，使用t檢驗進行2組間比較，使用方差分析進行多組間比較；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)（HbA1c、C反應蛋白、血清三酰甘油、尿素、肌酐和黃斑中心凹厚度）以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）的形式表示，通過Wilcoxon 秩和檢驗進行2 組間比較，通過Cruskal-Wallis 秩和檢驗進行多組間比較；糖尿病病程為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，但以-x±s的形式表示。定性數(shù)據(jù)（性別、眼別、用藥和疾病百分比）采用頻數(shù)、構成比或百分比描述，使用χ2檢驗或Fisher 精確概率法等方法分析。采用Logistic 多因素分析模型進行關于DR 嚴重程度的獨立影響因素的篩選。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DR進展相關因素分析

共采集了90 例DR 患者的臨床信息。根據(jù)入組患眼ETDRS 評分［15］，將所有患者分為輕度、中度、重度NPDR 及PDR 共4 組。除肌酐外，4 組之間在人口統(tǒng)計學或基本臨床特征上比較，差異無統(tǒng)計學意義。PDR 組患者的肌酐值顯著高于輕度、中度、重度NPDR 組（P=0.034，P=0.002，P=0.043），各NPDR 組患者之間的差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 受試者基本臨床資料Tab 1 Basic clinical data of subjects

為初步尋找與DR 嚴重程度相關的因素，應用OCTA檢查中ETDRS 環(huán)內各個區(qū)域（圖1）的視網(wǎng)膜淺層及深層血管血流密度進行統(tǒng)計分析，初步篩選出14 項與DR疾病分期相關因素，如表2 所示。隨DR 的嚴重程度增加，視網(wǎng)膜血流密度整體呈顯著減少趨勢；且與淺層血管相比，深層血管表現(xiàn)出更大范圍的血流密度降低與DR嚴重程度相關。FAZ與DR的嚴重程度無明顯相關性。

圖1 OCTA內的ETDRS環(huán)Fig 1 ETDRS macular grids in OCTA

為進一步篩選與DR 嚴重程度相關的獨立危險因素，將血流密度結合臨床相關危險因子如糖尿病病程、糖尿病發(fā)病年齡、HbA1c、尿酸、尿素、高血壓、高血脂和心血管疾病病史，建立有序Logistic 回歸模型。因組間基線肌酐值有顯著差異，亦將肌酐加入模型，排除其混雜因素。Logistic 回歸模型偽R2（McFadden R2）值為0.105，表示該模型可以解釋DR嚴重程度改變的10.5%。

分析結果顯示：糖尿病發(fā)病年齡低、視網(wǎng)膜深層血流密度降低是DR 嚴重程度的危險因子，而無高血脂為DR進展的保護因素（表3）。

2.2 DME發(fā)生相關因素分析

以DME 存在與否對全部受試者進行分組。90 例患者中，有DME 者57 例，無DME 者33 例。如表4 所示，2組DR 等級的分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004）；在其他人口統(tǒng)計學和基本臨床信息上比較，差異無統(tǒng)計學意義。進一步利用OCT 影像對不同DR 分期的受試眼DME 相關特征進行比較，包括視網(wǎng)膜厚度、視網(wǎng)膜下液及囊樣水腫有無。結果顯示：不同分期DR 中DME 出現(xiàn)比例的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004）；由輕度NPDR 至PDR，黃斑中心凹平均厚度逐漸增加（P=0.033）（表5）。視網(wǎng)膜層間囊樣水腫在4組間的出現(xiàn)頻率比較，差異也有統(tǒng)計學意義，較重的DR（重度NPDR 及PDR）存在囊樣水腫的可能性更大。

表2 影像學特征與DR等級的相關性Tab 2 Correlation between imaging features and DR stages

對受試者OCT 特征進行分析發(fā)現(xiàn)，DRIL 的發(fā)生與DME 具有相關性；視網(wǎng)膜層間囊樣水腫、視網(wǎng)膜下液以及視網(wǎng)膜增厚的發(fā)生率在組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P=0.000）（表6）。利用二元Logistic回歸對視網(wǎng)膜血流分析發(fā)現(xiàn)：淺層、深層視網(wǎng)膜血流密度，圍繞FAZ區(qū)域300 μm 寬度內的中心凹血管密度（FD-300）以及FAZ 面積與DME 均無相關性（表6）。將糖尿病病程、HbA1c、高血壓、高血脂和心血管疾病病史加入Logistic回歸方程，將DR 等級作為混雜因素進行調整后，并未發(fā)現(xiàn)上述因素與DME相關。

表3 有序Logistic回歸分析結果Tab 3 Results of ordinal Logistic regression analysis

表4 有無DME的受試者的基本資料比較Tab 4 Comparison of basic data of subjects with and without DME

表5 DME相關影像學特征與DR分期的相關性Tab 5 Correlation between DME-related imaging features and DR stages

表6 影像學特征與DME的相關性Tab 6 Correlation between imaging features and DME

3 討論

本研究通過對90 例DR 患者的基本臨床信息及OCT、OCTA數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病發(fā)病年齡、視網(wǎng)膜深層血流密度與DR 進展的嚴重程度呈負相關；而高血脂與DR的嚴重程度呈正相關；未發(fā)現(xiàn)OCTA 血流變化與DME 的發(fā)病有相關性；DRIL 的出現(xiàn)與DME 密切相關，且DME發(fā)生的概率隨著DR嚴重程度增大而增加。

目前已有大量關于DR 危險因子的臨床研究，其中，糖尿病的發(fā)病年齡與DR 有密切關系。在1 型糖尿病中，關于發(fā)病年齡對DR 患病率的影響，有多種結論。有研究認為DR 發(fā)生概率與糖尿病的患病年齡呈負相關［17］，15歲以上發(fā)病的患者更易發(fā)展至晚期DR［18］；Hietala 等［19］認為15～40歲發(fā)生1型糖尿病的人群比5～14歲發(fā)病人群的PDR 風險更高；而Kullberg 等［20］報道，15～19 歲發(fā)生糖尿病的人群DR 的發(fā)病率為48%，但在30～35 歲發(fā)病則DR 發(fā)病率下降至30%。相比之下，研究［21］發(fā)現(xiàn)對于2型糖尿病，31～45 歲確診的患者較其他年齡段患DR 的風險更高。在本研究中，未對患者糖尿病的分型進行篩選，全部受試者的平均糖尿病確診年齡為35.7～55.7 歲，且并未涉及未成年受試者。我們發(fā)現(xiàn)在這個范圍內，糖尿病發(fā)病年齡越低，則患者進展為晚期DR 的可能性越大，該結果與以上關于1 型和2 型糖尿病患者DR 患病率的研究結果一致。研究［22-24］顯示，其他因素包括HbA1c、糖尿病病程、高血壓和高血脂均為DR 以及DME 的危險因子。在本研究中，發(fā)現(xiàn)高血脂與DR 的病情加重相關，但并未識別出其他因素對DR 以及DME 的影響。一方面這些患者均已在入組前接受糖尿病治療，HbA1c 濃度已在控制中；另一方面，部分患者糖尿病病程、高血壓和高血脂有無是根據(jù)患者回憶或自述進行記錄，回憶偏倚可能對結果造成一定的影響。

在OCTA 的成像中，視網(wǎng)膜淺層毛細血管叢位于視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細胞層，中間毛細血管叢和深層毛細血管叢分別位于內核層的內、外邊界處［25-26］，而中間毛細血管叢和深層毛細血管叢由于在結構上距離極其微小且血管形態(tài)相近，經(jīng)常同歸類為深層毛細血管復合體［27］。本研究中關于深層血管的分析，準確描述應為對深層毛細血管復合體的研究。早前通過眼底熒光血管造影進行的研究發(fā)現(xiàn)DR患者FAZ面積擴大，并認為該特征是DR 發(fā)生與發(fā)展的危險因素［28］。一項利用OCTA 指標對DR 的進展和DME 的發(fā)生進行探索的前瞻性研究［12］表明，F(xiàn)AZ 面積、視網(wǎng)膜深層血管叢的血流密度減小可以預期DR 的進展，而淺層血管叢的血流密度減小與DME 發(fā)生密切相關。相同的是，本研究也發(fā)現(xiàn)了OCTA中視網(wǎng)膜深層血流密度減少可能是DR 進展的危險因子。也有臨床研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜淺層血流密度與深層血流密度同時隨著DR 的進展而減少，且深層血管的血流密度變化在分辨患者的進展程度中敏感度更高。Onishi 等［29］也觀察到DR 中深層的血流急劇下降而淺層的血流相對維持的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，與淺層血管相比，與DR 嚴重程度相關的血流密度下降在深層血管中涉及的范圍更大。若將本研究中較重的DR（重度NPDR 和PDR）人群與較輕的DR（輕度NPDR 和中度NPDR）人群相比較，僅有深層血流密度的減小有顯著差異（P=0.028），而淺層血流密度在2組人群中的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.057）。這也從側面證實了深層血流密度改變對DR 進展的指示更具敏感性，深層血流的改變可能是導致DR 發(fā)展的主要原因。這一結果在組織學研究［27］中亦得到證實，80%的微血管瘤位于視網(wǎng)膜的內核層，即視網(wǎng)膜深層血管發(fā)生損傷的概率更大。

關于DR 血流密度改變的研究發(fā)現(xiàn)，DR 伴隨DME 患者較DR 不伴隨DME 患者深層及淺層血流密度均顯著減?。?9］，且伴有FAZ的明顯擴大［30］。在正常情況下，淺層血管產(chǎn)生的液體分布于視網(wǎng)膜間質組織內，Müller細胞進行水轉運并主要由深層血管叢吸收，當液體的產(chǎn)生與流出不平衡時即出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管性的黃斑水腫［31］。因此，如果淺層血管的血-視網(wǎng)膜屏障破壞導致產(chǎn)生超過排出能力的液體量，或Müller 細胞功能異常、深層血管損傷造成水轉運障礙均可以導致DME的產(chǎn)生。有橫斷面研究［12］發(fā)現(xiàn)DME 患者的深層血管血流密度顯著減少，支持了深層血管損傷的理論。但前瞻性研究［12］表明，OCTA 中淺層血管灌注顯著減少是DME 的危險因子。Fayed等［32］發(fā)現(xiàn)全視網(wǎng)膜激光光凝后，淺層血管的FD 明顯提高，血管彎曲度下降，側面反映了淺層血管在DME 中的重要性。但在本研究中，并未發(fā)現(xiàn)與DME 相關的視網(wǎng)膜血流改變指標，2組患者FAZ面積也無顯著差異。國內已有的相關研究也并未發(fā)現(xiàn)DME 與無DME 人群之間深層、淺層毛細血管血流密度有顯著差異［14］。因此，目前考慮該結果可能與樣本人群選擇及研究樣本量有關。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)DRIL 與DME 密切相關。DRIL 是視網(wǎng)膜結構（內叢狀層、內核層和外叢狀層）的紊亂，即位于這些區(qū)域的無長突細胞、雙極細胞和/或水平細胞的軸突和細胞核結構紊亂或遭到破壞。當視網(wǎng)膜水腫，厚度超過彈性極限，雙極細胞軸突斷裂，而這種雙極細胞的破壞可能不是完全可逆的，可能可以解釋部分患者DME消退但視力仍恢復不理想［33］。

本研究分析了患者基礎情況對DR 影像學結果的影響，在排除了潛在混雜因素影響的基礎上，篩選出與DR相關的特征性影像學改變，局限性在于考察的OCTA 檢測指標較少。今后，可以進一步細化分析深、淺層血管FAZ 的區(qū)別，納入更多指標如FD、血管彎曲度等，更全面地探索與DR 嚴重程度以及DME 相關的潛在的影像學生物標志物。未來可擴大樣本量，考慮更多因素與影像學改變之間的關系，如DR 患者的視力、微視野、全身代謝性因素等。

綜上所述，本研究主要利用OCT和OCTA探究DR及DME 相關的結構特征，并發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)病年齡、高血脂以及視網(wǎng)膜深層血流密度減少可能為預測DR 進展的獨立危險因子，但并未發(fā)現(xiàn)OCTA 中血流密度變化與DME的發(fā)生相關。