任浩征，潘超，許迎，孫小淏，劉德寶

（天津理工大學 材料科學與工程學院，天津 300384）

近年來，具有生物可降解特性的新一代醫(yī)用金屬材料的研究發(fā)展迅速，這類新型醫(yī)用金屬材料（Mg、Fe、Zn）巧妙地應用在人體環(huán)境中，充分利用其易發(fā)生腐蝕降解的特性，實現在體內逐漸降解直至最終消失的醫(yī)學臨床目的[1-7]。因此，可降解金屬通過材料成分的合理設計，結合生命科學和工程學的研究思路，將會對骨組織工程學產生積極而深遠的影響。

可降解鎂合金材料因表現出優(yōu)異的生物相容性而被廣泛研究。Mg 大量參與人體的各種生理活動，在許多細胞功能中發(fā)揮著重要作用[8]，且其密度與人體骨骼密度接近，同時彈性模量也與人體骨骼相近，減少了應力屏蔽[9]。Singh 等人[10]采用粉末冶金以及鈦編織絲網作為空間支撐材料相結合的方法，成功地制備了一種孔隙率為60%、孔徑大小約為300 μm、孔洞互連的新型Mg-10Zn-4Y 支架材料。其中，鈦編織金屬絲網法保證了拓撲有序多孔結構的形成；鋅和釔作為添加的合金材料，通過提高整體可燒結性來增強多孔鎂的強度；使用L929 細胞對支架材料的細胞相容性進行了研究，證實了其生物相容性良好。然而，Mg 的標準電極電位為-2.37 V，因此，鎂在生理環(huán)境中的腐蝕速率快，并且在腐蝕過程中會產生氫氣包囊[11]。應用到組織工程領域的鎂基多孔支架由于具有更大的表面積，因而腐蝕降解速率會更快。可降解鐵基材料有較好的生物相容性。Fe 是人體必需的金屬元素，參與氧的運輸與儲存，與某些酶的合成和活動密切相關[12]。Carluccio 等人[13]采用選擇性激光熔化（SLM）制備了孔隙率為42%的Fe-35Mn 骨支架，并對其性能進行了深入分析，結果表明，選擇性激光熔化可以制備具有復雜分級結構的材料，這是傳統制造方法無法實現的；支架的微觀結構主要由奧氏體組成，延展性良好；電化學和浸泡測試體現出Fe-35Mn 支架降解速率比純鐵快；植入大鼠顱骨4 周后觀察到新骨形成，表明該支架具有良好的生物相容性。然而，Fe的標準電極電位為-0.44 V，在體內的腐蝕降解速率較慢，鐵基多孔支架如若植入到體內會有較長時間的保留。此外，鐵的腐蝕產物在生理環(huán)境中趨于穩(wěn)定，導致長期滯留，這可能會引起代謝并發(fā)癥[14-15]。另外，鐵基材料本身具有鐵磁性，在植入后的醫(yī)學影像檢測中存在諸多不便。

鋅具有良好的生物相容性，標準電極電位為-0.76 V，介于鎂和鐵之間，降解速率適中。Xiao 等人[16]對Zn-0.05Mg 合金進行了體內外研究。結果表明，在純鋅基礎上添加鎂以后，力學性能得到了改善；合金對L-929 細胞無毒性作用，且對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抗菌作用；將Zn-0.05Mg 植入兔股骨后均勻降解且無炎癥反應，在骨與植入體界面逐漸有新骨形成。目前，對于鋅基多孔支架的研究也在不斷深入[17-23]。Capek 等人[18]采用放電等離子燒結制備了孔隙率約為20%的多孔Zn。結果表明，初始Zn 粉末尺寸顯著影響孔的大小和形狀、機械性能以及腐蝕性能；浸泡實驗證明多孔Zn 表面可以沉積Ca-P 產物，具有良好的生物活性。Xie 等人[19]采用氣壓滲流法制備了孔隙率為59.1%的多孔Zn-1Ag、Zn-3.5Ag 支架。結果表明，降解表面的腐蝕產物主要由ZnO、Ca3(PO4)2和Zn(OH)2組成；多孔Zn-Ag 支架的力學性能高于相同孔隙率的多孔Zn 支架，說明合金元素的添加改善了支架的力學性能；隨著銀含量的增加，多孔鋅銀支架的抗菌能力越來越高。Cockerill 等人[20]采用增材制造技術制備了孔徑為900 μm 和2 mm 的鋅骨支架，制備的多孔鋅支架呈現出完全互連的孔結構，可促進細胞滲透和骨向內生長，且表現出良好的抗菌作用；體外細胞測試和浸泡結果，證實了支架良好的生物相容性和適中的降解速率。上述研究都證明了鋅基多孔支架在骨科領域具有良好的應用前景。

為了獲得綜合性能優(yōu)異的鋅基多孔支架，對其進行合金化是很有必要的。銅是鋅合金的主要合金化元素之一，也是人體必需的微量元素，可改善機械性能和生物醫(yī)學功能，如增強鋅基多孔支架的力學性能和抗菌效果[24-26]。Hou 等人[25]采用熱壓燒結來制備氯化鈉模板，將熔化的金屬滲流到氯化鈉模板中，凝固后去除氯化鈉，得到多孔純Zn 和Zn-3Cu 支架。由于銅在鋅基體中的固溶和鋅銅第二相的析出，添加銅顯著提高了鋅支架的力學性能和腐蝕速率。Tang 等人[26]系統研究了擠壓態(tài)Zn-xCu（x=1,2,3,4）合金的顯微組織、力學性能、細胞毒性和抗菌性能。結果表明，Zn-Cu二元合金具有良好的強度和延展性、可接受的細胞毒性和良好的抗菌性能。此外，由于人體細胞存在于組織液中，組織液以水溶液為基礎，支架材料優(yōu)良的親水性能有利于組織液浸潤，也有利于促進細胞的快速粘附和快速生長[27-28]。在醫(yī)用金屬材料表面改性的研究中發(fā)現，在Ti 基體表面制備了Hep/ Chi 功能涂層，在Mg 基體表面制備了PDA/HA 功能涂層，改善了表面的潤濕性，顯著地提高了材料的生物相容性[29]。在Zn-Cu 組織工程支架表面進行ZnO 表面修飾可改善支架表面潤濕性，促進親水性，且ZnO 也具備一定的抗菌作用[30-31]，對Zn-Cu 組織工程支架進行ZnO表面修飾，有望達成ZnO 與富銅相的協同抗菌作用，進一步提高Zn-Cu 組織工程支架的抑菌、抗菌性能。在合金支架表面制備ZnO 的方法有固相法、氣相法和液相法。固相法在反應中會引入雜質粒子，氣相法的制備過程較復雜。液相法效率高，成本較低，其中水熱法制備ZnO 過程相對簡單，易于控制，速度快且制備的ZnO 形貌可控均勻。所以，水熱法是目前制備ZnO 最常見的方法[32]。

在本研究中，利用氣壓滲流鑄造法制備出理論孔隙率為60%且孔徑尺寸為100～500 μm 的Zn-xCu（x=0,1,2,3）合金組織工程支架。通過水熱法對Zn-Cu組織工程支架進行ZnO 表面修飾，從而改善其表面潤濕性。對所制備支架的宏觀、微觀形貌，ZnO 表面修飾后支架表面的微觀形貌、相結構以及表面親水性能進行了系統表征，并且評價了ZnO 表面修飾后的Zn-Cu 組織工程支架的抑菌、抗菌性能。本研究可以對開發(fā)新一代Zn 基組織工程支架材料提供借鑒與參考。

1 試驗

1.1 材料制備方法

1.1.1 Zn-Cu 支架的制備

本研究中制備Zn-Cu 合金組織工程支架所用的材料包括高純鋅錠（純度99.995%）、高純銅粉（純度99.99%）、50～100 目NaCl 顆粒。Zn-Cu 合金組織工程支架的制備采用氣壓滲流鑄造法，其鑄造模具示意圖如圖1 所示。具體制備步驟為：首先在坩堝中將鋅錠加熱至560 ℃，保溫1 h，之后將配比好的銅粉加入坩堝，繼續(xù)保溫1 h，在此過程中通入N2作為保護氣氛；將氯化鈉顆粒放入模具中，一起放入電阻爐中330 ℃保溫至澆鑄；然后迅速將熔融好的合金撇渣后澆鑄到模具中，冷卻后脫模；在超聲環(huán)境中清洗去除氯化鈉顆粒，得到鋅銅合金支架。

圖1 鑄造模具示意圖 Fig.1 Schematic diagram of the casting mould

1.1.2 表面ZnO 涂層的制備

將Zn-Cu 合金組織工程支架采用線切割的方法加工成φ10 mm×3 mm 圓柱體試樣，用去離子水、無水乙醇超聲清洗，然后充分干燥。將干燥后的試樣置于200 g/L 的氯化鈉溶液中，在80 ℃下保溫5 h。到預定時間后，取出試樣放置到真空干燥箱中充分干燥。

1.2 顯微形貌觀察與物相分析方法

使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM, Quanta FEG 250）對φ10 mm×3 mm 的Zn-Cu 支架圓柱體試樣進行顯微形貌觀察。使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡對φ10 mm×3 mm 的表面制備有ZnO 層的圓柱體試樣進行顯微形貌觀察。使用X 射線衍射儀（XRD，Rigaku D/max/2500PC），在掃描范圍2θ 為10°～80°、掃描速度為5 (°)/min 的條件下，對表面制備有ZnO 層的圓柱體試樣進行物相分析。

1.3 Zn-Cu 支架表面接觸角測定方法

材料表面與水的接觸角采用光學接觸角測量儀進行測量。將平整的待測試樣放置在實驗臺上，然后通過滴定針管將5 μL 去離子水滴在樣品表面，用相機拍攝液滴與樣品表面接觸圖像，最后經圖像分析得到材料與水的接觸角。

1.4 ZnO 表面修飾前后的Zn-3Cu 支架細胞粘附性能評價

對ZnO 表面修飾前后的Zn-3Cu 合金組織工程支架的細胞粘附性能進行評價。將MC3T3 大鼠成骨細胞置于α-MEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，將Zn-3Cu 合金組織工程支架輻照滅菌之后，每片材料接種相同數量的細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗掉殘留的培養(yǎng)基，之后用Hoechst染色劑染色細胞核20 min，最后用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM，Nikon A 1）觀察細胞的粘附情況。

1.5 ZnO 表面修飾前后的Zn-3Cu 支架抗菌性能評價

評價材料抑菌、抗菌性能所用菌種為金黃色葡萄球菌與大腸桿菌。將金黃色葡萄球菌置于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的細菌懸液接種于平板，充分涂抹，將ZnO 表面修飾前后的Zn-3Cu 支架小圓片貼于平板中間，16 h 后觀察測定材料周邊抑菌圈的大小，抑菌圈越大，材料的抑菌抗菌性能越好。

將大腸桿菌置于LB 瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將配制好的有ZnO 表面修飾的Zn-3Cu 支架材料浸提液涂于此培養(yǎng)基上，干燥后將培養(yǎng)好的細菌懸液分別涂布與劃線，16 h 后與空白試樣形成對照，觀察細菌數量的變化情況。細菌數量若減少，進一步證明ZnO 表面修飾后的Zn-3Cu 支架材料具有抗菌性能。

2 結果及分析

2.1 Zn-Cu 支架的微觀形貌

本研究制備的Zn-3Cu 合金組織工程支架的宏觀和微觀形貌如圖2 所示。計算分析得出支架的平均孔徑尺寸為237 μm，實際孔隙率為(71.13±0.90)%。從圖2a 中的宏觀形貌照片可以看出，支架材料底面和側面的孔洞均勻分布。以圖2b 中的SEM 照片可看出，支架體孔洞分布均勻，孔的連通性良好，孔洞之間的孔壁相對完整。

圖2 Zn-3Cu 合金組織工程支架形貌 Fig.2 Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) macrostructures; b) scanning electron microscope (SEM) image

2.2 ZnO 表面修飾的Zn-Cu 支架表面微觀形貌及相組成

Zn-Cu 合金組織工程支架表面ZnO 層的微觀形貌如圖3 所示?？梢钥闯?，在同一溫度、相同時間的處理條件下，在純鋅支架體表面，ZnO 多為一些絮狀顆粒。 添加Cu 合金元素的Zn-xCu（x=1,2,3）支架表面均被針狀或者棒狀聚集的團簇均勻覆蓋，并且隨著Cu 添加量的增加，支架表面針狀、棒狀ZnO 的大小逐漸變大。圖4 為帶涂層支架體表面XRD 相結構分析譜圖。從圖4 中可以發(fā)現，支架體表面有Zn、CuZn5、ZnO 相，說明經過改性后的材料表面生成了棒狀、針狀的ZnO 產物。

圖3 Zn-Cu 合金組織工程支架表面修飾后的微觀形貌 Fig.3 Microstructures of coated Zn-Cu alloy tissue engineering scaffolds

圖4 支架體表面修飾后的XRD 相結構分析圖譜 Fig.4 XRD phase structure analysis of coated scaffolds surface

從圖3 可以看出，相同水熱反應條件下，純鋅支架體表面生成的ZnO 為顆粒狀，處于生長的初級階段，有逐漸形成與長大的趨勢。而添加Cu 以后，由XRD 相結構分析可知，Zn-2Cu、Zn-3Cu 支架體表面會有金屬間化合物CuZn5相的形成，并且隨著Cu 添加量的增加，CuZn5相的含量也增加?；wZn 的腐蝕電位低于第二相CuZn5相的腐蝕電位，二者之間會形成腐蝕微電池，Zn 在Zn-Cu 合金中充當陽極，發(fā)生電偶腐蝕[26]，鋅基體的腐蝕速率顯著增加，Zn 離子釋放量增加，從而使ZnO 晶體的生成與長大速率變快，因此隨著合金元素Cu 含量的增加，Zn-Cu 支架材料表面生成的ZnO 晶體尺寸逐漸增加。

Zn-Cu 合金組織工程支架在80 ℃的NaCl 溶液中生成ZnO 相的反應方程式如(1)—(3)所列[33-35]。

支架置于NaCl 溶液后，鋅的溶解和氧的還原開始進行，Zn2+和OH-通過擴散作用相互接觸，反應生 成Zn(OH)2，再進一步轉化為ZnO，當ZnO 在NaCl 溶液中的濃度達到過飽和時，則會在試樣表面逐漸沉積。雖然ZnO 層在Cl-的作用下會發(fā)生分解生成可溶性物質ZnCl2[36]，但依據表面均被ZnO 層均勻覆蓋的實驗結果可以推斷，ZnO 層的沉積速率大于其分解速率。其原因可能是NaCl 電解質溶液具有良好的導電性，加速了鋅的溶解和氧的還原過程的進行。此外，試樣附近溶液中的OH-會隨著反應的進行而逐漸增多，pH 值進而大于7，溶液呈堿性，而ZnO 易于在堿性環(huán)境中穩(wěn)定存在。制備的ZnO 納米棒大多呈現六棱柱形態(tài)。六棱柱ZnO 的生長過程主要包括三個階段[37]：

1）六方薄片的形成。Zn2+與OH-發(fā)生反應生成ZnO，為降低表面能，ZnO 聚集在一起形成六方薄片。

2）二維方向形核。在低能量的{0001}晶面族上不斷形成新晶核，溶液中Zn2+與OH-數量逐漸增多，ZnO 二維形核速率也相應變快。

3）晶核側向長大。晶核將主要沿二維方向側向長大，以降低晶核六個側面的高表面能。隨著不斷的形核與長大，ZnO 六方薄片逐層生長并最終生長為六棱柱ZnO 納米棒。

2.3 ZnO 表面修飾對Zn-Cu 支架表面接觸角的影響

圖5 ZnO 表面修飾前后的Zn-Cu 合金組織工程支架接觸角測定結果 Fig.5 Water contact angles of the surface of Zn-Cu alloy tissue engineering scaffolds with or without ZnO coating

Zn-Cu 合金組織工程支架和ZnO 表面改性的Zn-Cu 合金組織工程支架的接觸角測試結果如圖5 所示。從圖5 中可以看出，表面沒有制備ZnO 層的Zn-Cu支架對水的接觸角均為90°～180°，即水對材料均表現為不潤濕。而ZnO 表面改性的Zn-Cu 合金組織工程支架表面接觸角則表現出明顯差異：純鋅支架的接觸角為112.21°，大于90°，表現為不潤濕，即純鋅支架經5 h 的水熱處理后，表面涂層并不能夠改善其潤濕性。這可能是因為純鋅支架為純金屬，成分單一，制備 的表面ZnO 層厚度較薄、局部覆蓋，造成對水的吸引力較弱。Zn-1Cu、Zn-2Cu、Zn-3Cu 支架材料表面的接觸角分別為46.44°、46.48°、0°，均小于90°，都表現為潤濕。結合ZnO 的尺寸和形貌，Zn-Cu 材料表面的ZnO 多生長為針狀或者棒狀，且形態(tài)多為聚集的團簇，導致表面的粗糙度變大，對水的吸引力變大，接觸角變小。Zn-3Cu 支架材料表面的ZnO 分布均勻且相對致密，粗糙度較大，對水的吸引力較強，潤濕效果最佳，表現為完全潤濕。材料表面與水的接觸角大小可以顯示出材料表面潤濕性的差異[38-39]，通過測定材料表面對水的接觸角可反映支架材料表面的親疏水性能。接觸角越小，代表材料的親水性能越好，有利于組織液的浸潤，從而促進細胞快速粘附；相反，接觸角越大，表示支架材料表面的潤濕性越差，越不利于組織液的浸潤，從而減緩細胞在支架表面粘附。

2.4 ZnO 表面修飾對Zn-Cu 支架細胞粘附性的影響

圖6 Zn-3Cu 合金組織工程支架細胞粘附 Fig.6 Cell adhesion on Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) without ZnO coating, b) with ZnO coating

結合Zn-Cu 合金組織工程支架的接觸角大小，說明了材料表面的ZnO 能夠改善材料的親水性，促進了細胞在組織工程支架表面的快速粘附，從而實現支架材料表面功能化，對于組織工程支架的臨床應用十分有意義。

2.5 ZnO 表面修飾前后的Zn-3Cu 支架抗菌性能評價

圖7 為未經ZnO 表面修飾和ZnO 表面修飾后的Zn-3Cu 支架與金黃色葡萄球菌接觸培養(yǎng)16 h 后的細菌菌落鋪板數碼照片。從圖7 中可以看出，未經ZnO表面修飾的Zn-3Cu 合金支架有效滅菌空白區(qū)域的最長距離為7.8 mm，說明其合金本身Zn-3Cu 材料存在抗菌活性，ZnO 表面修飾后的Zn-3Cu 合金支架有效滅菌空白區(qū)域的最長距離為9.8 mm，說明ZnO 表面修飾后的Zn-3Cu 合金支架的抑菌、抗菌效果優(yōu)于未經ZnO 表面修飾的Zn-3Cu 合金支架。圖7 中沒有完整抑菌環(huán)的存在，可能是因為微觀孔隙結構存在毛細現象，孔與孔之間的結構存在差異，合適的孔結構對菌落有一定的吸附作用，從而會有一部分菌落貼附于材料周圍，導致抑菌環(huán)不完整。

圖7 Zn-3Cu 合金組織工程支架抑菌圈照片 Fig.7 Antibacterial circle photograph of Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) without ZnO coating; b) with ZnO coating

圖8、圖9 分別為菌液劃線圖與涂布圖。圖8a與圖9a 為空白菌液，圖8b 與圖9b 為ZnO 表面修飾后的Zn-3Cu 支架浸提液與大腸桿菌共培養(yǎng)后的菌液?？梢钥闯?，分別將菌液劃線與涂布后，作為空白對照的菌落生長狀態(tài)良好，菌落與菌落之間致密緊湊排列，稠密分布，肉眼無法分辨出菌落狀態(tài)；而Zn-3Cu 支架材料浸提液處理過的菌液與空白菌液相 比，菌落數量減少，清晰可見點狀細菌菌落，分布稀疏，松散排列。這進一步說明了ZnO 表面修飾后的Zn-3Cu 支架材料具有抑菌、抗菌性能。

圖8 Zn-3Cu 合金組織工程支架抑菌劃線照片 Fig.8 Antibacterial line photograph of Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) blank; b) with ZnO coating

細菌細胞壁和細胞膜會被ZnO 顆粒溶解釋放的Zn2+破壞，導致細菌內容物流出，從而嚴重抑制其活性，最終導致細菌死亡。并且有研究發(fā)現，ZnO 中溶解的Zn2+的質量濃度約為10 μg/mL 時，細胞活性降低到50%[40]。除Zn2+的作用外，ZnO 顆粒對細胞的機械損傷也可導致其抑菌、抗菌。細菌的細胞表面存在羧基等一些帶負電荷的基團，ZnO 納米顆粒帶正電荷，在靜電力的作用下，細菌細胞與ZnO 顆粒相互吸引，緊密結合，針狀或者棒狀聚集的團簇ZnO 對細菌細胞壁和細胞膜造成破壞，從而使細菌失去活性[41]。此外，ZnO 顆粒的取向也能影響其抗菌性能，隨機取向的ZnO 顆粒的抗菌效果優(yōu)于規(guī)則取向的ZnO 顆粒[42]。

圖9 Zn-3Cu 合金組織工程支架抑菌涂布照片 Fig.9 Antibacterial coated photograph of Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) blank; b) with ZnO coating

3 結論

1）制備的Zn-xCu（x=0,1,2,3）支架體孔洞分布均勻，連通性良好。

2）ZnO 表面修飾后的Zn-Cu 組織工程支架的表面潤濕性得到改善，有利于細胞快速粘附，提高了支架材料的細胞相容性。

3）ZnO 表面修飾后的Zn-Cu 組織工程支架具有良好的抑菌、抗菌性能。