李靜 萬(wàn)九生 陳超 鄧衛(wèi)東 岳銳 熊和麗 黎立光

摘要 [目的]探究PPARGC1A基因mRNA在昆明犬、馬里努阿犬、德國(guó)牧羊犬不同肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，為研究犬的肌肉和運(yùn)動(dòng)能力形成機(jī)理提供理論參考。[方法]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)昆明犬、馬里努阿犬、德國(guó)牧羊犬3種警犬在6月齡、1歲齡的臀腿肌肉組織中PPARGC1A基因mRNA表達(dá)量。[結(jié)果]隨著年齡的增長(zhǎng)，PPARGC1A基因在3種警犬肌肉中呈現(xiàn)逐漸上升的表達(dá)趨勢(shì)。馬里努阿犬在6月齡和1歲齡時(shí)臀腿肌中的表達(dá)量極顯著高于昆明犬和德國(guó)牧羊犬（P<0.01）。[結(jié)論]PPARGC1A基因在肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程中起著很重要的作用。該研究結(jié)果可為探索肌肉發(fā)育及肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)研究提供理論參考和研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 犬;昆明犬;PPARGC1A基因;發(fā)育性表達(dá);肌肉組織

中圖分類號(hào) S829.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）04-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.024

Developmental Expression of PPARGC1A Gene in Different Muscles of Three Police Dogs

LI Jing1，2，3， WAN Jiu-sheng1，2， CHEN Chao1，2 et al

（1.Kunming Police Dog Base of the Ministry of Public Security， Kunming， Yunnan 650201;2.Key Laboratory of Police Dog Technology of the Ministry of Public Security， Kunming， Yunnan 650201;3.School of Animal Science and Technology of Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract [Objective]The aim of this study was to investigate the development expression laws of PPARGC1A gene mRNA in different muscle tissues of Kunming Dog， Malinua Dog and German Shepherd Dog， and provide theoretical reference for studying the formation mechanism of muscle and motor ability of dogs.[Method] The expression quantity of PPARGC1A gene mRNA in the gluteal and leg muscles of Kunming Dog， Malinua Dog and German Shepherd Dog at 6 month-age and 1-year-age was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. [Result] PPARGC1A gene was gradually increased in three kinds of muscles with the increase of age. The expression level of gluteal leg muscle in Malinua Dog was significantly higher than that in Kunming Dog and German Shepherd Dog （P< 0.01）. [Conclusion] PPARGC1A gene played an important role in muscle development and intramuscular fat deposition. The results of this study could provide theoretical reference and research basis for the study of muscle development and intramuscular fat deposition.

Key words Dog;Kunming Dog;PPARGC1A gene;Developmental expression;Muscle tissue

基金項(xiàng)目 公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作專項(xiàng)項(xiàng)目（2018GABJC27，2019GABJC29）;云南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（青年項(xiàng)目）（2019FD025）。

作者簡(jiǎn)介 李靜（1989—），女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，助理研究員，博士，從事警犬分子遺傳育種研究。通信作者，副研究員，碩士，從事警犬疾病健康研究。

收稿日期 2020-05-18;修回日期 2020-06-06

1998年P(guān)uigserver等[1]發(fā)現(xiàn)了過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α，該轉(zhuǎn)錄因子作為與自適應(yīng)產(chǎn)熱相關(guān)（PPARγ）和PPARγ共激活因子家族PGC-1。作為核受體PPARG的轉(zhuǎn)錄共激活因子，它是脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)劑。它還可以誘導(dǎo)肌纖維類型從酵解型向有氧代謝型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而改善肉質(zhì);另外，還能夠與肌肉組織的選擇性轉(zhuǎn)錄因子肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)子結(jié)合，控制另一肉質(zhì)候選基因在肌肉組織中的表達(dá)[2]。在具有高能量需求并富含線粒體的組織中發(fā)現(xiàn)了PPARGC1A mRNA，同時(shí)該P(yáng)PARGC1A蛋白的通用功能使其成為肉品質(zhì)性狀的功能候選基因[3]。同時(shí)，在脂肪、肌肉、腎臟、肝臟、大腦、心臟和腎上腺組織中檢測(cè)到該基因的轉(zhuǎn)錄，這與PPARGC1A蛋白在適應(yīng)性產(chǎn)熱方面的功能一致。

筆者以3種國(guó)內(nèi)常用的警犬品種為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)PPARGC1A基因在6月齡、1歲齡警犬臀腿肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，從基因表達(dá)水平上探討PPARGC1A與肌肉發(fā)育和骨骼肌對(duì)葡萄糖攝取能力，旨在為研究PPAR家族通過(guò)抑制葡萄糖氧化和增加葡萄糖吸收來(lái)補(bǔ)充肌糖原貯備等機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)以昆明犬（KM）、馬里努阿犬（MQ）、德國(guó)牧羊犬（DM）公犬為研究對(duì)象。樣品采集于公安部昆明警犬基地。將犬只麻醉后，分別在6月齡和1歲齡時(shí)臀大肌和股二頭肌各取一小塊組織塊，立即置于液氮中速凍保存，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于RNA的提取。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑。qPCR試劑TSE202（2×T5 Fast qPCR Mix SYBR Green I，北京擎科生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑（TSK302S）RT6 cDNA Synthesis Kit Ver 2（北京擎科生物科技有限公司），無(wú)水乙醇、氯仿以及異丙醇等均為分析純國(guó)藥試劑。所有槍頭以及EP管全部使用AXGEN公司提供的一次性無(wú)RNase/DNase耗材。

1.2.2 儀器。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI Prism 7500）;超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000C）;逆轉(zhuǎn)錄儀器（郎基A300PCR）;凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad GelDoc XR）;凝膠電泳系統(tǒng)（Bio-Rad PowerPac 300）;冷凍離心機(jī)（Thermo）;漩渦振蕩儀（Labnet）;微量移液器（Eppendorf）。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中PPARGC1A（實(shí)時(shí)熒光定量?jī)?nèi)參基因）基因cDNA引物，使用NCBI網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)引物，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）。引物濃度為10 μmol/L，引物序列見(jiàn)表1。

1.4 總RNA的提取

①取適量液氮研磨成粉的樣品置于1.5 mL Eppendorf管，加入1 mL Trizol試劑，混勻;

②按Trizol∶氯仿5∶1的比例加入氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min;4 ℃，12 000 r/min，離心15 min;

③吸取上清置于另一新的1.5 mL eppendorf管，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置20 min;

④4 ℃12 000 r/min離心10 min后，去上清;加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀;

⑤ 4 ℃10 000 r/min離心5 min，棄上清;4 ℃10 000 r/min再次離心5 min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）;

⑥加入20 μL RNase-free水，直至完全溶解，取1 μL用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA產(chǎn)物

進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣：混勻后42 ℃孵育2 min，60 ℃孵育5 min，迅速置于冰上冷卻，短暫離心后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)組分進(jìn)行加樣。混勻后，25 ℃孵育10 min，50 ℃孵育30 min，85 ℃孵育5 min，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上或冷藏備用。

1.6 實(shí)時(shí)RT-PCR

將10 μL ddH2O稀釋至30 μL，作為qPCR模板，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增體系加樣。擴(kuò)增體系按以下擴(kuò)增程序擴(kuò)增、熔解：

95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃10 s，65 ℃5 s，74 ℃10 s，40個(gè)循環(huán);

95 ℃15 s;60 ℃1 min，95 ℃15 s，0.3 ℃/20 s。以上擴(kuò)增循環(huán)階段在72 ℃下采集熒光信號(hào)。

1.7 PCR產(chǎn)物鑒定 使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR電泳結(jié)果并拍照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

將RT-PCR結(jié)果導(dǎo)出，計(jì)算內(nèi)參、外參以及目的基因的平均Ct值，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組織樣品中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)不同品種、不同階段PPARGC1A基因的表達(dá)量進(jìn)行比較。使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)同一品種、同一組織中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯法進(jìn)行多重比較，對(duì)2個(gè)品種間的差異分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用GraphPadPrism5軟件進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA與反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

由圖1可知，從馬里努阿犬、昆明犬、德國(guó)牧羊犬提取的RNA在電泳中顯示28S和18S兩條帶。

2.2 目的基因標(biāo)準(zhǔn)品的制備

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到PPARGC1A基因133 bp的目的片段。最后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖2所示。

2.3 擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線

該試驗(yàn)采用3個(gè)樣本重復(fù)，對(duì)PPARGC1A進(jìn)行定量分析，擴(kuò)增動(dòng)力曲線見(jiàn)圖3。

2.4 部分樣品的擴(kuò)增溶解曲線

圖4為部分樣品擴(kuò)增溶解曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值都是單一的峰，沒(méi)有雜峰，無(wú)二聚體或者多聚體產(chǎn)生。

2.5 不同階段3種警犬體重和臀肌重的比較

隨著日齡的增長(zhǎng)，3種警犬的體重、臀肌重均逐漸增加。其中，3種警犬的體重在0～6月齡增長(zhǎng)速度最快。隨日齡的增長(zhǎng)，3種警犬的臀肌重與體重的增長(zhǎng)趨勢(shì)一致（圖5A、B）。3種警犬的體重和臀肌重差異不顯著（P>0.05）。

2.6 PPARGC1A基因在不同年齡3種警犬臀腿肌中的相對(duì)表達(dá)量

不同年齡3種警犬臀腿肌中PPARGC1A基因的表達(dá)規(guī)律如圖6所示。從圖6可以看出，1歲齡時(shí)3種警犬臀腿肌中PPARGC1A基因的表達(dá)量與6月齡間差異不顯著（P>0.05）;6月齡時(shí)馬里努阿犬（MQ）臀腿肌中PPARGC1A基因的表達(dá)量極顯著高于昆明犬（KM）和德國(guó)牧羊犬（DM）（P<0.01）。1歲齡馬里努阿犬臀腿肌中PPARGC1A基因的表達(dá)量極顯著高于昆明犬和德國(guó)牧羊犬（P<0.01），其中PPARGC1A基因在昆明犬肌肉中的表達(dá)量最低，德國(guó)牧羊犬次之。

3 討論

RT-PCR是一種靈敏且準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，常用于檢測(cè)基因的表達(dá)程度，通過(guò)樣本進(jìn)行相對(duì)定量RT-PCR，可以比較不同時(shí)期樣本mRNA表達(dá)的差異[4]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體1α（PPARGC1A）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，可以參與機(jī)體代謝的多種生物學(xué)反應(yīng)，主要包括線粒體啟動(dòng)、通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)運(yùn)輸和葡萄糖氧化[5-6]。 PPARGC1A和PPARα在分解脂肪酸的組織中，特別是肝臟、骨骼肌中表達(dá)水平較高。在人類中PPARGC1A和PPARα基因作為調(diào)節(jié)基因，主要通過(guò)表達(dá)編碼參與脂肪酸氧化的幾種關(guān)鍵酶和控制氧化磷酸化。研究也表明，耐力訓(xùn)練會(huì)增加PPARGC1A的 mRNA水平，因此通過(guò)PPARα調(diào)節(jié)基因表達(dá)量可以增強(qiáng)骨骼肌的氧化能力[7-8]。目前，對(duì)PPARGC1A基因的研究主要集中于肌纖維類型對(duì)肌肉品質(zhì)的影響研究[9-10]。然而，PRARGC1A在犬肌肉中的表達(dá)量及不同發(fā)育階段不同品種犬骨骼肌中的表達(dá)規(guī)律研究較少。該試驗(yàn)利用RT-PCR對(duì)PPARGC1A基因在不同發(fā)育階段馬里努阿犬、昆明犬、德國(guó)牧羊犬肌肉中的表達(dá)量差異進(jìn)行研究。在該研究中1歲齡時(shí)3種警犬臀腿肌中PPARGC1A基因的表達(dá)量與6月齡間差異不顯著（P>0.05）;6月齡時(shí)馬里努阿犬（MQ）臀腿肌中PPARGC1A基因的表達(dá)量極顯著高于昆明犬（KM）和德園牧羊犬（DM）（P<0.01）。1歲齡馬里努阿犬臀腿肌中PPARGC1A基因的表達(dá)量極顯著高于昆明犬和德國(guó)牧羊犬（P<001）。其中，PPARGC1A基因在昆明犬肌肉中的表達(dá)量最低，德國(guó)牧羊犬次之。

昆明犬是我國(guó)唯一一個(gè)自主選育的工作犬品種，體型方正，體尺較高，適應(yīng)能力廣泛，具有狼青、黑背、草黃3種毛色，被廣泛用于軍警用多種工作犬使用領(lǐng)域。馬里努阿犬又稱比利時(shí)馬里努阿犬、馬犬，無(wú)論因其被毛極短，肌肉發(fā)達(dá)，爆發(fā)力強(qiáng)，工作能力優(yōu)秀，服從性好，目前在美國(guó)、德國(guó)、澳大利亞、中國(guó)等國(guó)家作為通用的軍警犬、保鏢犬、護(hù)衛(wèi)犬。德國(guó)牧羊犬，別名德牧，也就是人們常說(shuō)的德國(guó)狼犬，原產(chǎn)德國(guó)一戰(zhàn)、二戰(zhàn)時(shí)期犬已經(jīng)在德國(guó)各地固定下來(lái)作為軍警犬使用，行動(dòng)敏捷，且適用于多種工作環(huán)境。德國(guó)牧羊犬肌肉組織勻稱，臀部長(zhǎng)，略微向下傾斜，與水平的夾角為23°。從外型來(lái)看，馬里努阿犬較昆明犬、德國(guó)牧羊犬肌肉結(jié)構(gòu)更加緊湊。馬里努阿犬皮下脂肪含量較昆明犬、德國(guó)牧羊犬更低。該研究也表明隨著日齡的增長(zhǎng)，3種警犬體重、臀腿肌重呈線性增長(zhǎng)，其中體重在0～6月齡增長(zhǎng)速度最快。隨日齡的增長(zhǎng)，3種警犬臀腿肌的增長(zhǎng)與體重增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，3種警犬體重和臀肌重差異不顯著（P>0.05）。但馬里努阿犬臀腿肌肉比例略高于其他2個(gè)警犬品種，1歲齡時(shí)德國(guó)牧羊犬和昆明犬的體重略大于馬里努阿犬。

Li等[9]研究了過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ-輔活化子1-α（PPARGC1A）基因在豬肌肉纖維中表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)水平，結(jié)果表明PPARGC1A基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最高，肝臟次之，背部脂肪最低。在背最長(zhǎng)肌組織中，大白豬與滇南小耳豬、藏豬相比具有較高的mRNA和蛋白表達(dá)，基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。PPARGC1A在大白豬肝臟和背部組織中的表達(dá)量比滇南小耳豬和藏豬更高，蛋白質(zhì)水平差異顯著（P<0.05），肝臟、背部中脂肪含量差異極顯著（P<001）。滇南小耳豬為本土品種，產(chǎn)自云南省南部，具有肌內(nèi)脂肪（IMF）含量高、肉質(zhì)嫩等特點(diǎn)。藏豬是青藏高原特有的豬種，主要分布于林芝、昌都（西藏）、甘肅、迪慶（云南）、阿壩和甘孜（四川）。除了能很好地適應(yīng)嚴(yán)酷的環(huán)境外，藏豬也具有很高的IMF含量。大白豬是一種引進(jìn)的豬品種，在生長(zhǎng)率、瘦肉率等方面具有較好的性狀，但I(xiàn)MF含量較低。該研究表明豬脂肪性狀的表型不同，背膘厚度和IMF含量與不同水平的PPARGC1A表達(dá)（mRNA或蛋白）相關(guān)。PPARGC1A的表達(dá)是影響肌纖維類型的重要因素[11-16]。3種警犬中PPARGC1A的表達(dá)量不同，結(jié)合肌纖維類型及運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行綜合分析，進(jìn)一步揭示該基因在調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體、糖、脂和能量代謝方面的生物重要性，尋找有意義的分子標(biāo)記，為進(jìn)一步加快警犬的分子輔助育種工作提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

該研究分析了3個(gè)警犬品種中PPARGC1A的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，PPARGC1A基因在3種警犬肌肉中的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。馬里努阿犬在6月齡和 1歲齡時(shí)臀腿肌中的基因表達(dá)量極顯著高于昆明犬和德國(guó)牧羊犬（P<0.01）。這揭示PPARGC1A基因在肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程中起著重要的作用，結(jié)合警犬的警用耐力性能和有氧運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為加快警犬分子輔助育種提供了理論依據(jù)。

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