周靜月 蘇陽(yáng)2 張小凡 張銘 趙鵬3 邢廣群

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266555 1 腎內(nèi)科； 2 心內(nèi)科； 3 檢驗(yàn)科)

矽肺病是由于肺部吸入大量游離的SiO2顆粒所引起，以肺部炎癥、肺纖維化和肺功能障礙為特征[1]。進(jìn)入肺內(nèi)SiO2顆粒無(wú)法排出，引起肺部持續(xù)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致免疫平衡紊亂，因此矽肺患者常常伴有肺部腫瘤、肺結(jié)核和自身免疫性疾病等并發(fā)癥[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是目前最有效的促纖維化細(xì)胞因子，主要由肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞分泌，刺激成纖維細(xì)胞增殖和激活，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞形成，是參與肺纖維化發(fā)展的關(guān)鍵因子[3]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，可能參與致炎和致纖維化等過程[4]。BRINKMANN等[5]于2004年首次提出，中性粒細(xì)胞受病原體激活可釋放網(wǎng)狀物質(zhì)來殺滅病原菌，并將這種網(wǎng)狀物質(zhì)命名為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)。NETs是以DNA為骨架的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，除包裹著髓過氧化物酶(MPO)以及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶以外，還含有瓜氨酸化組蛋白H3(CitH3)、組織蛋白酶G、防御素、殺菌/通透性增強(qiáng)性蛋白，其中CitH3是NETs的標(biāo)志物。MPO是含血紅素輔基的過氧化物酶，存在于髓系細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是髓系細(xì)胞發(fā)揮固有免疫功能的重要標(biāo)志物[6]。研究顯示MPO參與了矽肺肺組織的炎癥反應(yīng)，過量的MPO產(chǎn)生的氧化劑可誘導(dǎo)肺組織發(fā)生氧化性損傷[7]。本研究擬采用氣管內(nèi)注入SiO2顆粒的方法建立矽肺纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接慍itH3、MPO、IL-6和TGF-β1在矽肺發(fā)生中的作用及其機(jī)制，以期為矽肺患者的治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Wistar-Kyoto大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，隨機(jī)分為矽肺組和對(duì)照組，每組15只大鼠，飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠的處理規(guī)程獲得青島大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)認(rèn)證，動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)操作程序符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》倫理標(biāo)準(zhǔn)及動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)方針。

1.2 主要試劑

SiO2顆粒(S817558，上海麥恪林生化科技有限公司)，CitH3抗體(Ab219406，英國(guó)Abcam公司)，MPO單克隆小鼠抗體(Ab90810，英國(guó)Abcam公司)，Alex Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔抗體(GB25303，武漢賽維爾生物科技有限公司)，Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(GB210301，武漢賽維爾生物科技有限公司)；EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)液、大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒、DAPI染液、IL-6 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；將SiO2顆粒和生理鹽水混合配置成濃度為50 g/L的SiO2混懸液，經(jīng)高壓滅菌后加入青霉素2 000 U備用。

1.3 方法

1.3.1大鼠矽肺模型的建立及兩組的處理 參照程燚等[8]的方法制備大鼠矽肺模型。大鼠麻醉固定后，消毒頸部皮膚，沿頸部正中線切開5～7 mm，暴露氣管。矽肺組大鼠氣管內(nèi)一次性注入預(yù)配好的SiO2混懸液1 mL，對(duì)照組大鼠氣管內(nèi)一次性注入等體積的高壓蒸汽滅菌的生理鹽水1 mL，縫合傷口，待大鼠蘇醒后置于動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)。兩組大鼠均于第28天時(shí)麻醉后采集腹主動(dòng)脈血，以3 000 r/min離心10 min收集血清；然后處死大鼠剝離出肺臟，用生理鹽水清洗以后，觀察肺臟形態(tài)同時(shí)稱肺臟濕質(zhì)量，計(jì)算肺臟器系數(shù)，肺臟器系數(shù)=肺組織濕質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.3.2肺組織病理組織學(xué)觀察 將大鼠的肺組織以40 g/L的多聚甲醛固定，石蠟包埋后，制作5 μm厚切片，行HE染色，由青島大學(xué)附屬醫(yī)院高年資病理醫(yī)師于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理情況。

1.3.3ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TGF-β1、IL-6以及CitH3水平 采用ELISA試劑盒按照雙抗夾心法檢測(cè)大鼠血清中TGF-β1、IL-6以及CitH3的水平，并于酶標(biāo)儀上在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及對(duì)應(yīng)的吸光度值計(jì)算出TGF-β1、IL-6及CitH3的水平。

1.3.4免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠肺組織中CitH3和MPO的表達(dá) 肺組織切片脫蠟至水后，置于抗原修復(fù)緩沖液中，微波爐內(nèi)行抗原修復(fù)，自然冷卻后置于PBS中，然后于脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。稍甩干后置于濕盒中，加入自發(fā)熒光淬滅劑中5 min，流水沖洗10 min，再滴加山羊血清封閉組織中非特異性抗原60 min。然后輕輕甩掉封閉液，在切片上滴入稀釋好的CitH3(1∶50)以及MPO(1∶50)，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。然后將切片置于PBS中，然后在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。稍甩干后滴加Alex Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶400)以及Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶300)覆蓋組織，避光室溫孵育50 min，染色完成以后在搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。待切片稍干后，滴加DAPI染液，避光孵育10 min。切片于PBS中洗滌3次，每次5 min。干燥后，用抗熒光淬滅封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察切片并采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠肺臟器系數(shù)比較

飼養(yǎng)期間兩組大鼠均無(wú)意外死亡。大體觀察可見，對(duì)照組大鼠肺組織呈粉紅色，柔軟有彈性；矽肺組大鼠肺組織表面呈灰白色，質(zhì)地堅(jiān)硬且彈性差，切面有磨砂感。對(duì)照組和矽肺組大鼠肺組織濕質(zhì)量分別為(3.07±0.64)、(4.01±0.40)g，肺臟器系數(shù)分別為3.88±1.44、6.37±2.81，與對(duì)照組相比，矽肺組肺組織濕質(zhì)量以及肺臟器系數(shù)均顯著高于對(duì)照組(t=-4.10、-3.06,P<0.05)。

2.2 兩組大鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果比較

HE染色切片顯示，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)；矽肺組大鼠肺組織可見各種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和增生，肺泡間隔增厚，正常肺泡結(jié)構(gòu)明顯減少(圖1B)。

A：對(duì)照組大鼠肺組織，B：矽肺組大鼠肺組織，HE染色，200倍

2.3 兩組大鼠血清中TGF-β1、IL-6及CitH3表達(dá)水平比較

矽肺組大鼠血清中CitH3、TGF-β1及IL-6水平與對(duì)照組比較明顯升高(t=-29.85～-3.22，P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠血清中CitH3、IL-6和TGF-β1表達(dá)水平比較

2.4 兩組大鼠肺組織中CitH3和MPO比較

熒光顯微鏡下觀察顯示，矽肺組肺組織中紅色熒光免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物MPO和綠色熒光免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物CitH3較對(duì)照組明顯增加(圖2)。

3 討 論

矽肺通常是由于長(zhǎng)期吸入大量游離性的SiO2顆粒所引起，以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主要特征。目前，矽肺的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此探討其發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療藥物非常重要。RADA[9]研究發(fā)現(xiàn)，SiO2顆?？纱碳ね庵苎行粤＜?xì)胞產(chǎn)生大量的NETs，且與SiO2顆粒的濃度具有劑量相關(guān)性，提示NETs在SiO2顆粒所致矽肺發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期暴露于SiO2顆粒環(huán)境中時(shí)，SiO2顆粒易經(jīng)氣道沉積于肺組織中，激活肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能，產(chǎn)生大量的炎癥因子與氧化應(yīng)激產(chǎn)物[10-11]。大量因子的持續(xù)增加進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的持續(xù)招募，繼而產(chǎn)生過量的膠原和纖維連接蛋白，促進(jìn)肺組織纖維化[12]。矽肺患者與矽肺動(dòng)物模型肺泡灌洗液中均發(fā)現(xiàn)有大量的中性粒細(xì)胞，當(dāng)降低肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞水平后，矽肺損傷程度隨之減輕，提示NETs可能參與了SiO2顆粒誘導(dǎo)的小鼠矽肺模型肺部炎癥損傷與纖維

CitH3染色呈綠色，MPO染色呈紅色，DAPI染色呈藍(lán)色，免疫熒光染色，200倍

化的過程[13-14]。

中性粒細(xì)胞在受到細(xì)胞因子、病原微生物或一些化合物的刺激時(shí)，會(huì)形成以染色質(zhì)DNA為骨架、包裹著顆粒蛋白(如MPO和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶)的NETs網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有抵抗病原菌入侵的作用，但NETs過度產(chǎn)生時(shí)可致組織細(xì)胞損傷和強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[15]。本研究以氣管內(nèi)注入SiO2混懸液的方法建立大鼠矽肺模型，免疫熒光染色法檢測(cè)顯示，大鼠肺組織中CitH3和MPO表達(dá)水平均顯著升高，說明CitH3和MPO可能參與了大鼠矽肺纖維化的過程。本研究結(jié)果顯示，矽肺組大鼠的部分肺組織發(fā)生實(shí)變，HE染色切片顯示肺組織內(nèi)有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)充滿炎性滲出物，出現(xiàn)明顯的肺纖維化，與先前的研究結(jié)果一致[16]。同時(shí)ELISA方法檢測(cè)顯示矽肺組大鼠血清中CitH3、TGF-β1及IL-6水平較對(duì)照組明顯升高。IL-6是一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分泌，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、創(chuàng)口修復(fù)[17]。同時(shí)IL-6還具有促進(jìn)膠原蛋白聚集和肺成纖維細(xì)胞增殖的作用[18]。TGF-β1是組織纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過激活其下游的Smad信號(hào)通路，引發(fā)促纖維化基因過表達(dá)，致瘢痕組織形成。已研究證實(shí)，TGF-β1/Smad通路失調(diào)是組織纖維化的重要致病機(jī)制[19]。有研究發(fā)現(xiàn)矽肺病患者支氣管肺泡灌洗液中NETs含量越高，患者病情越重，肺功能損害越重[20]。研究發(fā)現(xiàn)NETs促進(jìn)纖維化發(fā)生的機(jī)制可能與促進(jìn)纖維母細(xì)胞分化以及加速細(xì)胞外基質(zhì)合成有關(guān)[21]。以上研究均表明CitH3、MPO、TGF-β1及IL-6可能參與大鼠肺組織纖維化的過程。

綜上所述，SiO2顆?？赡芡ㄟ^激活中性粒細(xì)胞釋放CitH3和MPO以及促進(jìn)TGF-β1、IL-6等相關(guān)因子的表達(dá)來加重矽肺大鼠肺組織炎癥與纖維化的發(fā)生。CitH3和MPO、TGF-β1和IL-6水平的升高可能是致肺組織炎癥和纖維化的重要因素。