馬貴芳 滿夏夏 張益娟 高 豪 孫朝霞,3 李紅英,3 韓淵懷,3侯思宇,3,*

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 農(nóng)業(yè)生物工程研究所, 山西太谷 030801; 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801; 3 雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西太原 030031

葉酸是由蝶呤、對(duì)氨基苯甲酸和多聚谷氨酸組成的一種水溶性B族維生素, 又稱(chēng)維生素B9或維生素 M[1], 作為細(xì)胞中主要的一碳單位供體和受體參與生物體內(nèi)一碳代謝[2]。四氫葉酸(tetrahydrofolate,THF)是一碳單位的主要載體, 在其轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起輔酶作用, 如嘌呤和胸腺嘧啶的合成[3]。在生物界中,植物、真菌和大多數(shù)細(xì)菌能夠從頭合成葉酸, 但高等動(dòng)物包括人類(lèi)卻無(wú)法合成, 完全依賴(lài)日常飲食攝入來(lái)完成體內(nèi)生理生化過(guò)程。葉酸在人體內(nèi)主要以5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate, 5-M-THF)參與代謝過(guò)程時(shí)轉(zhuǎn)化為T(mén)HF形式發(fā)揮作用[4]。在植物中, 葉酸生物合成有明顯細(xì)胞區(qū)域化特征, 分別于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中合成[5]。其中, 蝶呤和對(duì)氨基苯甲酸(p-Aminobenzoate, pABA)在胞質(zhì)和葉綠體中合成; 隨后, THF分子在線粒體中組裝, 并添加谷氨酸尾巴。蝶呤部分的合成始于由鳥(niǎo)苷三磷酸環(huán)化水解酶(GTP cyclohydrolase I, GCHI)催化GTP生成二氫新蝶呤三磷酸(dihydroneopterin triphosphate, DHN-P3), DHN-P3經(jīng)磷酸水解生成二氫新蝶呤(dihydroneopterin, DHN), DHN在二氫新蝶呤醛縮酶(dihydroneopterin aldolase, DHNA)作用下生成羥甲基二氫蝶呤(dihydroneopterin to 6-hydroxymethyldihydropterin, HMDHP)。

植物體合成pABA分為2步, 第1步是由氨基脫氧分支酸合成酶(ainodeoxychorismate synthase,ADCS)作用生成氨基脫氧分支酸(ainodeoxychorismate, ADC), 第 2步由氨基脫氧分支酸裂解酶(ainodeoxychorismate lyase, ADCL)催化ADC生成pABA。最后, 在線粒體中合成葉酸(圖1,參考單齊冀[6], 略作修改)。HMDHP在羥甲基二氫蝶呤焦磷酸激酶(hydroxymethyldihydropterin pyrophospho kinase, HPPK)催化下生成 HMDHP-P2,HMDHP-P2與 pABA 偶聯(lián), 生成二氫蝶呤(dihydropteroate, DHP)。這個(gè)反應(yīng)是由二氫蝶呤合成酶(dihydropteroate synthase, DHPS)介導(dǎo)的, DHPS催化DHP和谷氨酸生成二氫葉酸(dihydrofolate, DHF),經(jīng)二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)催化DHF生成THF; 最后經(jīng)多谷氨酰四氫葉酸合成酶(folylpolyglutamate synthase, FPGS)催化THF加多聚谷氨酸尾巴生成多谷氨酰四氫葉酸(polyglutamic acid tetrahydrofolic acid, THF-Glun), 這種葉酸分子主要參與一碳代謝的葉酸依賴(lài)型酶促反應(yīng)[5]。鳥(niǎo)苷三磷酸環(huán)化水解酶(gamma-glutamyl hydrolase, GGH)的活性可去除多谷氨酸尾巴, 在調(diào)節(jié)葉酸穩(wěn)態(tài)中起重要作用[7]。

谷子[Setaria italica(L.) P.Beauv.]距今已有八千年的栽培歷史[8], 是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的雜糧作物[9]; 其籽粒脫殼后為小米, 富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)、維生素, 以及鈣、磷、鐵等人體所必需的微量元素。糧食類(lèi)作物的葉酸含量在 0.39～2.63 μg g-1DW之間, 其中小米中總?cè)~酸含量為1.53 μg g-1DW,遠(yuǎn)高于燕麥、苦蕎、薏米和水稻, 但與人體每日攝取推薦量日常推薦攝入標(biāo)準(zhǔn)(400～500 μg)相比, 差距較大[10]。目前谷子葉酸的研究尚停滯在葉酸提取及含量測(cè)定方法優(yōu)化和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等方面, 如邵麗華等[11]利用磷酸二氫鉀溶液恒溫水浴浸提葉酸,并通過(guò)高錳酸鉀氧化-間接熒光法測(cè)定245份谷子資源的葉酸含量發(fā)現(xiàn), ‘晉谷21’為高葉酸含量品種。侯思宇等[12]利用改良三酶法結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定2年同一環(huán)境下種植的45份谷子資源葉酸含量發(fā)現(xiàn), ‘晉谷 21’總?cè)~酸含量為(2.00±0.02) μg g-1DW, 在所有測(cè)試品種最高。為達(dá)到生物強(qiáng)化的目的,在水稻[13]、玉米[14]、小麥[15]等作物中已做了一些葉酸代謝特征及相關(guān)基因表達(dá)模式的研究。Storozhenko等[16]報(bào)道, 通過(guò)強(qiáng)化pABA和蝶呤支路獲得了比對(duì)照品種葉酸含量提升 100倍的水稻種子。汪冉冉[17]利用基因槍法將GCHI與ADCS基因轉(zhuǎn)入小麥幼胚愈傷組織中, 收獲的 T1代小麥籽粒中葉酸含量顯著提升。盡管前人對(duì)谷子葉酸提取及含量測(cè)定等進(jìn)行了相關(guān)研究, 但針對(duì)其代謝物種類(lèi)及代謝分子機(jī)制方面的研究尚屬空白。因此, 本研究擬通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS), 初步揭示谷子穗發(fā)育過(guò)程中葉酸代謝物積累的動(dòng)態(tài)規(guī)律; 結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析挖掘葉酸代謝物與相關(guān)基因表達(dá)模式的相關(guān)性, 找到潛在的葉酸強(qiáng)化靶基因, 以期為谷子葉酸生物強(qiáng)化奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘晉谷21’于2019年4月中旬種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧基地(東經(jīng) 112°28′, 北緯 37°12′)。分別對(duì)灌漿中前期(S1, 抽穗后 25 d)、灌漿中后期(S2, 抽穗后39 d)和收獲期(S3, 抽穗后53 d)的穗中部進(jìn)行取材。每個(gè)時(shí)期收集 10個(gè)單穗相同部位的小穗混合為測(cè)試材料, -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葉酸代謝物提取與LC-MS法測(cè)定

參考Wan等[18]方法提取葉酸。5 g樣品粉末沸水浴 10 min, 迅速轉(zhuǎn)移至冰上; 加入 15 μL α-淀粉酶(30 min, 37℃)和 20 μL 蛋白酶(60 min, 37℃)后離心(4℃, 10,000×g, 20 min), 取上清液20 μL過(guò)濾后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLCMS/MS)分析。使用 Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)和Agilent分析柱(Poroshell 120 SB-C18, 2.1 mm×75.0 mm, 2.7 μm)進(jìn)行色譜分析, 在 4℃下進(jìn)樣 15 μL, 柱溫箱溫度保持在 25℃。流動(dòng)相為 0.1% (v/v)水甲酸和0.1% (v/v)乙腈甲酸, 流速0.3 mL min-1, 梯度程序?yàn)?0 min。使用Agilent 6420三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)與電子噴霧電離界面進(jìn)行葉酸的分析和定量。質(zhì)譜儀(MS)在陽(yáng)離子模式下運(yùn)行, 使用Agilent Mass Hunter軟件采集并分析數(shù)據(jù), 12種葉酸化合物作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析(測(cè)定參數(shù)見(jiàn)附表1)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

如1.2所述材料, 每個(gè)時(shí)期設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),提取總RNA。RNA-seq由派森諾生物科技有限公司(上海)完成, 在Illumina Hi Seq 2500平臺(tái)上構(gòu)建了9個(gè)文庫(kù)并對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行雙末端(Paired-end, PE)測(cè)序, 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控后過(guò)濾掉低質(zhì)量測(cè)序Reads,使用HISAT2 (http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)軟件將過(guò)濾后的 Reads比對(duì)到參考基因組(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Sitalica)上。使用HTSeq計(jì)算基因表達(dá)量,用FPKM值表示。DESeq軟件分析基因表達(dá)差異, 設(shè)置參數(shù)為: 表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|＞1, 顯著性P-value＜0.05。對(duì)差異表達(dá)基因(difference expression genes, DEGs)進(jìn)行 KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。

1.4 基因可變剪切、共相關(guān)分析及差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

采用 String Tie (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml)對(duì) Hisat2比對(duì)結(jié)果拼接, 通過(guò)ASprofile (http://ccb.jhu.edu/software/ASprofile/)軟件獲取每個(gè)樣品可變剪接類(lèi)型。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行雙變量分析, Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。利用 STRING 網(wǎng)站(http://string-db.org/)構(gòu)建谷子不同代謝路徑基因間蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子穗發(fā)育期穗部葉酸組分特征

由圖2可知, 12種葉酸標(biāo)準(zhǔn)物中可檢測(cè)到9種化合物, 分別是 5-M-THF、5-M-THFGlu3、5-M-THFGlu4、5,10-CH=THF、10-F-FA、5-F-THF、5-F-THFGlu2、5-F-THFGlu4和 FA。整個(gè)穗發(fā)育期, 對(duì)葉酸含量貢獻(xiàn)最大的為 5-M-THF和 10-F-FA, 尤其在S1, 二者含量分別達(dá)到1.27 μg g-1FW和1.64 μg g-1FW, 顯著高于其他時(shí)期的其他葉酸組分。其次為5-F-THFGlu2, 在S1～S3期含量分別為1.22、0.78和0.56 μg g-1FW。而 5-M-THFGlu3和 5-M-THFGlu4只在S2和S3期被檢測(cè)到, 5,10-CH=THF只在S2期被檢測(cè)到。相比其他葉酸組分, 5-F-THFGlu4整體含量最低,尤其在S1期含量?jī)H為0.0014 μg g-1FW。而在S1～S3期, 并未檢測(cè)到 THF、5-M-THFGlu2和 5-F-THFGlu3的積累。同時(shí), 本研究發(fā)現(xiàn)總?cè)~酸含量隨谷穗發(fā)育時(shí)期呈下降趨勢(shì), S1～S3含量分別為3.77、3.21和1.89 μg g-1FW, 與10-F-FA和5-M-THF含量隨穗發(fā)育期下降趨勢(shì)相一致。其他組分如 FA含量在穗發(fā)育不同階段整體差異不顯著。表明10-F-FA和5-M-THF含量是影響谷穗不同發(fā)育階段葉酸總含量的主要組分。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝與樣品相關(guān)性分析

RNA-seq結(jié)果顯示, 相同生物重復(fù)的樣本間相關(guān)性較好, 相關(guān)性范圍在 0.982～1.000; 不同時(shí)期小穗樣品間相關(guān)性在0.011～0.803之間, 表明不同樣品之間有明顯差異(附圖1)。對(duì) 9個(gè) RNA-Seq文庫(kù)測(cè)序過(guò)濾后分析得Clean Reads在93.47%～94.91%定位到參考基因組上且各樣品Q(chēng)30堿基百分比平均不小于 93.27% (附表2), 證明我們樣本選擇的合理性和試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.3 谷穗發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因分析

基于 RNA-seq兩兩組合比較分析, 共鑒定出4700個(gè)DEGs。其中S1 vs.S2鑒定出2263個(gè)DEGs,包含1213個(gè)表達(dá)上調(diào)和1050個(gè)表達(dá)下調(diào)基因; S1 vs.S3鑒定出3480個(gè)DEGs, 上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)為1370個(gè)和2110個(gè); S2 vs.S3中鑒定出1577個(gè)DEGs,包含737個(gè)和840個(gè)表達(dá)上調(diào)和下調(diào)基因(圖3-a)。

S1 vs.S2和 S1 vs.S3、S1 vs.S2和S2 vs.S3、S1 vs.S3和S2 vs.S3的兩兩組合之間交集分析發(fā)現(xiàn),分別存在 1381、372、1045個(gè) DEGs, 其中 688個(gè)DEGs特異的存在于S1 vs.S2, 1232個(gè)DEGs特異的存在于S1 vs.S3, 338個(gè)DEGs特異存在于S2 vs.S3,三者共有的DEGs為178個(gè)(圖3-b)。

對(duì)上述DEGs進(jìn)行功能注釋, 共有7121個(gè)可注釋到 NR數(shù)據(jù)庫(kù), 占比 99.3%; 接下來(lái)依次為eggNOG、Swiss-ProtGO和KEGG (附圖2)。KEGG注釋分析表明, 兩兩比較得到的 DEGs可注釋到生物體系統(tǒng)、新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過(guò)程, 共計(jì)五大類(lèi)(附圖3-a～c)。其中涉及新陳代謝類(lèi)的基因數(shù)量最多, 在 S1 vs.S2、S1 vs.S3、S2 vs.S3中分別占總注釋基因數(shù)量的81.8%、81.9%和79.2%。同時(shí)發(fā)現(xiàn), 苯丙烷類(lèi)物質(zhì)的生物合成、淀粉和蔗糖代謝和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)這 3個(gè)代謝通路中差異表達(dá)基因數(shù)目較多, 其中S1 vs.S2分別達(dá)到42、31和23個(gè); S1 vs.S3分別為75、43和31個(gè); S2 vs.S3分別有21、22和13個(gè)。

2.4 谷子穗發(fā)育時(shí)期基因的可變剪切類(lèi)型及數(shù)目變化

在 S1～S3期共檢測(cè)到 19,017個(gè)基因, 包含54,297處可變剪切, 根據(jù)剪切方式不同劃分為 5種類(lèi)型, 分別為外顯子跳躍型(exon skipping, ES)、內(nèi)含子滯留型(intron retention, IR)、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域可變剪切(transcription start site, TSS)、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域可變剪切(transcription terminal site, TTS)和可變 5′或 3′端剪切(alternative exon ends, AE)。其中, TTS和TSS為主要可變剪切類(lèi)型, 占比均為37.2%; 其次為IR、AE和ES, 分別占15.8%、5.0%和4.8%?？勺兗羟袛?shù)目在穗發(fā)育時(shí)期呈動(dòng)態(tài)變化, 如S1、S2、S3 TTS類(lèi)型可變剪切發(fā)生的數(shù)目分別為 20,744、19,969和20,066個(gè)(圖4)。葉酸生物合成途徑上有 16個(gè)關(guān)鍵基因發(fā)生可變剪切且類(lèi)型具有明顯差異, 如只有ADCL1、DHFR1、DHFR2基因發(fā)生ES剪切, AE剪切只出現(xiàn)在ADCS、DHFR2、FPGS1、FPGS2基因中, 而 IR 剪切僅在ADCS、DHFS、DHFR1、DHFR2、FPGS1中被預(yù)測(cè)到。同時(shí)各時(shí)期可變剪切數(shù)目呈動(dòng)態(tài)變化, 如DHFS基因在S1、S2、S3可變剪切發(fā)生數(shù)目分別為3、2、4個(gè)(附表3)。

2.5 葉酸合成途徑相關(guān)基因表達(dá)與葉酸代謝物共相關(guān)分析

通過(guò)對(duì)葉酸代謝相關(guān)17個(gè)基因在穗發(fā)育期的表達(dá)特征分析發(fā)現(xiàn), 有11個(gè)和6個(gè)基因分別在S2和S3期表達(dá)水平較低, 根據(jù)其基因表達(dá)模式可將上述基因聚為 2類(lèi)(Group 1和Group 2)(圖5)。在Group 1中ADCL3和GGH在S2表達(dá)量最高, 可達(dá)37.52和37.32;ADCS、ADCL1、GGH、DHFR1、DHFR2表達(dá)隨著穗發(fā)育整體呈下降的趨勢(shì), 如ADCS在 3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量分別為11.85、5.61、6.33。Group 2中基因又可分為2個(gè)亞類(lèi)(I和II), I類(lèi)中包含F(xiàn)PGS1、FPGS2、DHFS、ADCL2、DHPS1、DHPS2、HPPK1、HPPK2和DHNA1共9個(gè)基因, 呈現(xiàn)出S1、S3期高表達(dá)的特點(diǎn); 在II類(lèi)中包含DHNA2和GCHI, 僅在S3期表達(dá)水平較高(附表4)。葉酸合成與葉酸類(lèi)化合物的相關(guān)性分析表明, 5-M-THF的含量與DHNA2呈顯著負(fù)相關(guān)(r= -0.999,P＜0.05), 與GCHI呈極顯著負(fù)相關(guān)(r= -1.000,P＜0.01); 10-F-FA和5-F-THFGlu2的含量分別與GGH和DHFR2基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.999,P＜0.05); FA的含量與ADCS呈顯著正相關(guān)(r=1.000,P＜0.05) (附表5)。其他葉酸化合物與葉酸代謝相關(guān)基因表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性。

2.6 葉酸偶聯(lián)相關(guān)途徑的基因表達(dá)與葉酸代謝物共相關(guān)分析

對(duì)葉酸偶聯(lián)的一碳代謝相關(guān)基因表達(dá)聚類(lèi)發(fā)現(xiàn),21個(gè)基因在 3個(gè)時(shí)期內(nèi)據(jù)表達(dá)量可以聚為三大類(lèi),Cluster A1中包含10個(gè)基因, 在S1期表達(dá)量較高,如SHMT3(serine hydroxymethyltransferase 3, 絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶 3), 在 3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量分別為205.75、48.45和38.44; Cluster A2內(nèi)5個(gè)基因在S2期達(dá)到最高表達(dá), 如CMT1(methyltransferase, 甲基轉(zhuǎn)移酶)的表達(dá)量為3.03、12.54和10.17。Cluster A3內(nèi) 6個(gè)基因在 S3期表達(dá)較高, 如SHMT1(serine hydroxymethyltransferase 1, 絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶1),穗發(fā)育期表達(dá)量分別為 69.80、69.14和 80.02 (圖6-a)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), Cluster A1中基因與主要葉酸化合物呈正相關(guān)關(guān)系, 如10-F-FA與MET3呈顯著正相關(guān)(r=1.000,P＜0.05); Cluster A2中SHMTI與主要葉酸化合物 5-F-THFGlu2呈顯著負(fù)相關(guān)(r= -0.998,P＜0.05)(附表6)。

激素傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)聚為 3類(lèi), 其中Cluster B1中的 4個(gè)基因在 S2表達(dá)較高, 如ABF(ABRE binding factor, ABRE結(jié)合因子), 表達(dá)量分別為22.19、24.55和22.34; Cluster B2中16個(gè)基因在S3期高表達(dá), 且整體表達(dá)呈逐漸升高趨勢(shì), 如ETR(ethylene receptor, 乙烯受體, 表達(dá)量為 0.01、6.91和15.92); Cluster B3中17個(gè)基因在S1高表達(dá), 且在穗發(fā)育后期整體表達(dá)量降低, 如COI1(coronatine-insensitive protein 1, 冠氨酸不敏感蛋白1, 表達(dá)量為 110.88、49.70和 68.77)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),Cluster B2中基因與主要葉酸化合物呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,如BRI1(protein brassinosteroid insensitive 1, 油菜素內(nèi)脂膜受體)與 5-F-THFGlu2呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.998,P＜0.05); Cluster B3中基因與主要葉酸化合物呈正相關(guān)關(guān)系, 如基因ARF(auxin response factor,生長(zhǎng)素響應(yīng)因子)與 FA呈顯著正相關(guān)(r=0.999,P＜0.05)(圖6-b 和附表7)。

2.7 差異表達(dá)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

葉酸合成基因DHFR1、DHFR2與葉酸偶聯(lián)一碳代謝相關(guān)甲基化基因DDM1、DDM2、MET1、MET3之間存在共表達(dá)和互作關(guān)系(圖7-a); 相關(guān)性分析表明,DHFR2與MET3之間呈極顯著正相關(guān)(附表8)。在葉酸合成相關(guān)基因與激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn),DHFR1與DHFR2并沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)到激素類(lèi)蛋白, 而是通過(guò)免疫相關(guān)蛋白elf8、HSP90、SGT1來(lái)連通互作, 其中激素相關(guān)蛋白FLS2、MPK6、MAPK1/3、COI1、EDS1、RAR1 與免疫蛋白也存在互作(圖7-b); 同時(shí)發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)基因SGT1與激素途徑關(guān)鍵基因MPK6呈顯著正相關(guān)(附表9)。

3 討論

3.1 谷穗發(fā)育過(guò)程中葉酸合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)影響葉酸代謝物組成特征

谷子籽粒富含葉酸, 可作為人們?nèi)粘z入天然葉酸的來(lái)源之一。深入探討其籽粒中葉酸代謝譜分布特征及相關(guān)基因表達(dá)模式, 為挖掘葉酸代謝關(guān)鍵基因, 獲得高穩(wěn)定性葉酸材料, 培育高品質(zhì)谷子品種提供思路。Lian等[19]在研究玉米籽粒發(fā)育過(guò)程葉酸含量發(fā)現(xiàn), 隨著生育期的推進(jìn), 葉酸含量呈下降趨勢(shì), 這與本研究中谷穗葉酸含量變化規(guī)律一致。成熟小穗鮮樣中所測(cè)得的葉酸總含量為1.89 μg g-1FW, 與本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定干樣含量存在差異(2.02 μg g-1DW)[12], 這是含水量差異所致。此外, 本研究?jī)H用12個(gè)葉酸標(biāo)準(zhǔn)代謝物進(jìn)行分析, 無(wú)法檢測(cè)到谷穗中所有葉酸衍生物種類(lèi)及含量, 也是導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果差異的原因。

結(jié)合葉酸合成基因探討葉酸含量變化與基因表達(dá)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn), 穗發(fā)育 3個(gè)時(shí)期, 葉酸合成起始基因GCHI的表達(dá)整體呈上升趨勢(shì), 而分支酸途徑葉酸合成起始基因ADCS的表達(dá)量呈下降趨勢(shì),同時(shí)總?cè)~酸和主要葉酸代謝物含量隨穗發(fā)育成熟均呈下降趨勢(shì), 推測(cè)這可能是由于穗發(fā)育后期ADCS基因低表達(dá)降低了 pABA的合成量, 導(dǎo)致總?cè)~酸含量下降。韓娟英等[20]研究結(jié)果也表明, 只有葉酸合成基因GCHI和ADCS同時(shí)高表達(dá), 總?cè)~酸含量才可提升。

本研究發(fā)現(xiàn), 在S1期, 11個(gè)葉酸合成基因處于高表達(dá)水平, 預(yù)示著葉酸代謝物在穗發(fā)育初期大量合成。結(jié)合葉酸含量測(cè)定, S1期5-M-THF的含量占總5-M-THF含量的46%, S2期占41%, 而S3期僅占13%。一碳代謝甲基化相關(guān)基因的表達(dá)也是影響葉酸代謝物含量變化的重要因素, 即THF大量合成后被甲基化, 葉酸代謝物穩(wěn)定存在, 即可保持高含量的葉酸, 反之則含量降低, 這也是成熟谷穗中葉酸含量降低的重要原因。Lian等[19]對(duì)玉米籽粒中葉酸含量的研究發(fā)現(xiàn), 在未成熟籽粒中的5-M-THF的含量高于成熟玉米籽, 進(jìn)一步推測(cè)5-M-THF在穗發(fā)育前期高含量可能是由于籽粒發(fā)育早期一碳循環(huán)更活躍造成; Blancquaert等[21]在水稻pABA含量上也觀察到類(lèi)似的情況。除此之外, 葉酸介導(dǎo)所有生物必需的一碳轉(zhuǎn)移反應(yīng), 如 10-F-THF和 5,10-CH=THF衍生物的代謝參與嘌呤和胸苷酸的產(chǎn)生[22],SHMT1通過(guò)參與羥甲基轉(zhuǎn)移為生物合成提供一碳單位, 并影響葉酸代謝;DHFR2作為一碳途徑和葉酸合成途徑的關(guān)鍵基因, 與葉酸主要化合物之間聯(lián)系緊密。在擬南芥中, THF合成的倒數(shù)第2個(gè)步驟是由雙功能二氫葉酸還原-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)催完成[23-24]。在這類(lèi)雙功能酶中, DHFR酶位于N端, 將經(jīng)過(guò)TS形成的 DHF還原為 THF[25]。此外, 在本研究中發(fā)現(xiàn),GGH基因在S3期表達(dá)量降低, 這可能是由于GGH在葉酸代謝通路中所在的位置決定的, 已有研究表明, 當(dāng)GGH基因過(guò)表達(dá)時(shí),DHFR基因表達(dá)量下降,這是由于GGH過(guò)表達(dá)催化葉酸由聚谷氨酰胺化水解為單谷氨酰胺化(葉酸在循環(huán)中存在的唯一形式),生成大量的 THF, 從而抑制了 DHFR酶的活性; 當(dāng)GGH表達(dá)被抑制時(shí), DHFR酶的活有所上升[26]。上述結(jié)果暗示,ADCS、DHFR2和GGH基因可作為通過(guò)遺傳改良提升葉酸含量的關(guān)鍵靶基因, 為創(chuàng)制高葉酸含量新種質(zhì)提供可能。

3.2 可變剪切事件可能影響葉酸代謝物含量變化

可變剪切是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要手段, 提高真核生物有遺傳水平的多樣性, 研究表明可其在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn), 16個(gè)葉酸合成關(guān)鍵基因發(fā)生了不同類(lèi)型的可變剪切, 且在穗發(fā)育不同時(shí)期可變剪切數(shù)目不同。研究表明, IR的發(fā)生可在轉(zhuǎn)錄本中插入提前終止密碼子, 使基因表達(dá)下調(diào)[28]。本研究中,FPGS1的表達(dá)量遠(yuǎn)低于FPGS2, 比較發(fā)現(xiàn),FPGS1在 S1～S3期均發(fā)生了IR剪切, 而FPGS2并未發(fā)生此類(lèi)型剪切。另有研究證實(shí)AE與ES剪切類(lèi)型更易改變蛋白質(zhì)的結(jié)合性質(zhì)、活性和穩(wěn)定性, 產(chǎn)生功能變化的蛋白質(zhì)[29-31]。在本研究中DHFR1在3個(gè)時(shí)期發(fā)生這2種類(lèi)型剪切數(shù)目分別為0、1和2個(gè), 相應(yīng)時(shí)期基因表達(dá)量分別為36.48、28.58和13.51;DHFR2基因剪切數(shù)目分別為4、5和3個(gè), 表達(dá)量為18.50、13.69和11.73,通過(guò)剪切數(shù)目與表達(dá)量的差異推測(cè)DHFR2的氨基酸順序發(fā)生了改變, 從而使基因表達(dá)降低, 蛋白活性改變[32]。這些結(jié)果暗示這種高頻率可變剪切的發(fā)生可能與穗發(fā)育不同時(shí)期的葉酸含量動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān), 葉酸代謝相關(guān)基因的可變剪切事件可能直接影響葉酸化合物代謝, 但其具體影響機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 谷穗葉酸代謝參與植物激素和免疫途徑協(xié)同調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

葉酸代謝與一碳代謝途徑密切相關(guān), 并通過(guò)免疫途徑來(lái)調(diào)節(jié)激素信號(hào)傳導(dǎo)。已有研究發(fā)現(xiàn), 葉酸代謝途徑通過(guò)調(diào)節(jié)蛋氨酸合酶控制的 DNA甲基化來(lái)干擾植物免疫[33]。葉酸在甲基化反應(yīng)中提供S-腺苷蛋氨酸, 是甲基化反應(yīng)的關(guān)鍵因素[34]。本研究發(fā)現(xiàn), 一碳代謝甲基化關(guān)鍵酶基因DDM1、DDM2、MET1、MET3與葉酸合成基因DHFR1、DHFR2之間有直接關(guān)系, 但葉酸代謝基因與甲基化相關(guān)基因之間具體調(diào)控關(guān)系尚不明確。Wang等[35]發(fā)現(xiàn), 高水平的 THF誘導(dǎo)MET1介導(dǎo)的擬南芥開(kāi)花調(diào)節(jié)基因(FWA)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性, 從而導(dǎo)致花期延遲, 且呈劑量依賴(lài)性。本研究中晉谷21為春播晚熟品種, 整個(gè)生育期需要130 d左右, 而從S1到S3期需要50～60 d,相比其他谷子品種生育期較長(zhǎng), 我們推測(cè)這可能與穗部早期葉酸大量合成, 啟動(dòng)甲基化基因表達(dá), 抑制相關(guān)開(kāi)花基因的轉(zhuǎn)錄活性, 從而延遲了穗發(fā)育時(shí)期和生育期有關(guān)。

激素信號(hào)傳導(dǎo)在植物的生命活動(dòng)中有著重要作用。水稻中葉酸含量的升高可誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá), 如胞內(nèi)免疫受體RPM1[21], 增強(qiáng)抗病的能力。本研究中 FLS2、MPK6、MAPK1/3、COI1、EDS1、RAR1等激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白與葉酸途徑關(guān)鍵蛋白之間通過(guò)抗病蛋白相互作用。這暗示著免疫途徑關(guān)鍵蛋白elf8、HSP90、SGT1可能是葉酸途徑與激素途徑偶聯(lián)的關(guān)鍵蛋白。同時(shí), Finni等[36]研究發(fā)現(xiàn), 高葉酸可增強(qiáng)擬南芥對(duì)黑斑病菌的抗性, 但這種抗性的產(chǎn)生依賴(lài)于水楊酸的生物合成。肖熙歐等[37]研究表明, EDS1是調(diào)控水楊酸合成基因ICS1和水楊酸下游信號(hào)基因表達(dá)的重要因子, 在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究通過(guò)蛋白網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn), EDS1通過(guò)免疫蛋白SGTI與葉酸合成基因蛋白DHFR1和DHFR2有互作關(guān)系, 這進(jìn)一步證明葉酸對(duì)激素信號(hào)傳導(dǎo)和抗病機(jī)制調(diào)控有一定的影響,但機(jī)制尚不明確。

4 結(jié)論

首次解析‘晉谷 21’穗發(fā)育期葉酸組分特征, 鑒定出 9種葉酸化合物, 發(fā)現(xiàn)隨谷穗成熟葉酸總含量逐漸下降, 其中5-M-THF和10-F-FA是谷穗主要的葉酸組分。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進(jìn)一步揭示葉酸合成關(guān)鍵基因表達(dá)與葉酸組分代謝相關(guān)發(fā)現(xiàn),ADCS、DHFR2和GGH基因是谷穗葉酸積累的關(guān)鍵基因。同時(shí), 葉酸合成基因在穗發(fā)育期存在著可變剪切的類(lèi)型可能影響谷穗葉酸代謝, 明確了葉酸合成基因DHFR1/2與一碳代謝及激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因之間存在的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究單子葉植物葉酸積累的分子規(guī)律提供了新思路。

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