王立萍，葉 展，張亞群，王巧欣，李恒德

（1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京 100141）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國近海水域常見的一種暖溫性大型底層魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜愛，是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類。半滑舌鰨性別決定系統(tǒng)為（ZW♀-ZZ♂）型［1-3］，在苗種期，部分遺傳雌性會(huì)逆轉(zhuǎn)為表型雄性，即偽雄魚（ZW♂），這種性別轉(zhuǎn)變是不可逆的［4］。半滑舌鰨成年雌性的體質(zhì)量是成年雄性的2～4倍［5］，雄性和偽雄性則存在著個(gè)體小、生長速度慢等缺點(diǎn)［6］。雖然半滑舌鰨剛孵化出的仔魚的遺傳雌、雄性別比例接近1∶1［7-9］，但是由于性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，導(dǎo)致雌性比例過低，從而增加了飼養(yǎng)和管理成本，影響整體養(yǎng)殖產(chǎn)量，嚴(yán)重阻礙了半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

在魚類中，具有明顯兩性性征的物種，可利用鰭條特征、生殖孔形態(tài)［10］、產(chǎn)卵管［11］、雄性體表的追星［12］和婚姻色有無［13］等特征鑒別性別，但對于外觀特征不明顯的物種，則可通過解剖觀察、組織切片［14］、超聲波［15-16］、強(qiáng)光照射［17］等方法鑒定，或從其基因組DNA中篩選出性別特異標(biāo)記基因，采用PCR技術(shù)準(zhǔn)確鑒定魚體遺傳性別，如黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［18］、半滑舌鰨［19-22］、哲羅魚（Hucho taimen）［23］、金錢魚（Scatophagus argus）［24］、 鰻鱺 （Anguilla japonica）［25］、翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）［26］等。雖然同批次半滑舌鰨成體的雌、雄、偽雄性體質(zhì)量差別較大，較易辨別，但在幼魚期不同性別間差異則較小，不易辨別，需要養(yǎng)殖較長時(shí)間后才能依據(jù)體型大小差異基本辨別性別，這會(huì)在很大程度上增加養(yǎng)殖成本。在半滑舌鰨生產(chǎn)中，魚苗一般在70日齡左右出售，此時(shí)魚苗全長約5 cm左右。為了獲得客戶認(rèn)可，育苗人員常常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，將全長較短、體高較窄的貌似雄魚個(gè)體淘汰，以期提高所售苗種的雌性率。但由于這個(gè)時(shí)期的魚苗正處于性別分化時(shí)期，一些可能發(fā)育為偽雄魚的遺傳雌魚還未完成性別逆轉(zhuǎn)過程，這種經(jīng)驗(yàn)式的篩選方式是否可靠，還缺少相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

通過測量大量樣本的魚體形態(tài)和框架指標(biāo)，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行性別判定是一種較為簡便、實(shí)用、有效的方法。目前已有多種水產(chǎn)魚類通過測量魚體各形態(tài)特征指標(biāo)，運(yùn)用主成分分析、判別分析等方法較為準(zhǔn)確地判別雌、雄。如對大黃魚（Larimichthys crocea）形態(tài)特征的主成分分析和判別分析發(fā)現(xiàn)，雌魚較雄魚變異大，雌雄個(gè)體間體長／體厚差異最大［27］；翹嘴鱖的全長和體高對體質(zhì)量的影響最大［28］；金錢魚的雌雄差異主要體現(xiàn)在頭部和體型［29］；紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）雄性較雌性體型寬、體周長［30］。而目前有關(guān)半滑舌鰨形態(tài)指標(biāo)的研究很少，且大都集中于成魚，如利用相關(guān)性分析和通徑分析方法判斷半滑舌鰨形態(tài)性狀與個(gè)體體質(zhì)量的關(guān)系［31］，以及對半滑舌鰨的生長和形態(tài)參數(shù)方面進(jìn)行研究［32］等。因此，本研究通過測量半滑舌鰨幼魚雌、雄、偽雄個(gè)體的形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)，進(jìn)行主成分分析和判別分析，檢驗(yàn)通過形態(tài)特征對半滑舌鰨幼魚進(jìn)行早期性別判定的可行性和準(zhǔn)確性，以期為半滑舌鰨生產(chǎn)中幼魚的性別鑒定提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

半滑舌鰨樣品2019年采集于天津某養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖水溫23℃左右，隨機(jī)撈取同批次的70日齡半滑舌鰨苗種，共計(jì)349尾，作為測量分析樣本。由于部分半滑舌鰨雌性苗種在50～120日齡期間會(huì)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，采用性腺組織切片的方法不能準(zhǔn)確判定生理性別，故采用已知的半滑舌鰨性別特異基因位點(diǎn)的方法來準(zhǔn)確鑒定各樣本生理性別。對各樣本分別取尾鰭提取基因組DNA，運(yùn)用半滑舌鰨的特異微衛(wèi)星標(biāo)記SCAR進(jìn)行初步的遺傳性別鑒定［20］，區(qū)分出遺傳雄性、遺傳雌性，由于遺傳雌性中可能含有會(huì)性逆轉(zhuǎn)的生理性別為偽雄性的個(gè)體，之后通過半滑舌鰨遺傳雌魚Z染色體上兩個(gè)與性逆轉(zhuǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)［21-22］，擴(kuò)增測序以準(zhǔn)確辨別偽雄性和雌性。測序結(jié)果顯示，本次樣品中雌性116尾、雄性180尾、偽雄性53尾。雌性體長為3.154～7.959 cm，雄性體長為3.108～7.569 cm，偽雄性體長為3.569～6.489 cm。

1.2 形態(tài)學(xué)性狀測量

取實(shí)驗(yàn)用魚置于白色實(shí)驗(yàn)盤中，旁邊放置鋼尺，逐尾標(biāo)號標(biāo)記，水平拍照后，采用Motic Images Plus 2.0軟件測量全長（吻端到尾鰭末端，F(xiàn)L）、體高（垂直于魚體側(cè)線最寬的部位，BH）、尾巴角度（CA）、背部與水平線角度（DA）等形態(tài)性狀指標(biāo)，精確至0.001 cm（圖1）。

圖1 半滑舌鰨幼魚各形態(tài)測量指標(biāo)Fig.1 Morphologicalmeasurement indexes of Cynoglossus sem ilaevis seed ling

1.3 數(shù)據(jù)處理

對收集到的349尾半滑舌鰨幼苗進(jìn)行有效可量性狀測量并統(tǒng)計(jì)。為消除個(gè)體差異對形態(tài)數(shù)據(jù)的影響，也便于差異比較，將測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及標(biāo)準(zhǔn)化，考慮到數(shù)據(jù)連續(xù)性的問題，把角度值用正切轉(zhuǎn)換為長度后再分析，共得到5項(xiàng)性狀，包括全長（FL）、體高（BH）、全長／體高（FL／BH）、尾部角度正切值（CT）、背部與水平角度正切值（DT）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究應(yīng)用Excel2016及R軟件（R4.0.0），對樣本各項(xiàng)形態(tài)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。首先，將5項(xiàng)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行分布檢驗(yàn)，明確各項(xiàng)數(shù)據(jù)是否基本呈現(xiàn)正態(tài)分布，并檢驗(yàn)各項(xiàng)數(shù)據(jù)的方差齊性。以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。運(yùn)用方差分析，將樣本的雌、雄、偽雄3種性別類別作為因子，對各項(xiàng)形態(tài)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析各性別間的差異顯著性。之后，運(yùn)用R中軟件princomp（）函數(shù)對各項(xiàng)形態(tài)性狀進(jìn)行主成分分析，分析半滑舌鰨幼魚不同性別群體間的形態(tài)變異特征和程度。然后運(yùn)用R軟件中l(wèi)da（）函數(shù)進(jìn)行Fisher判別分析，根據(jù)各變量對模型貢獻(xiàn)的大小，建立70日齡半滑舌鰨雌、雄、偽雄個(gè)體判別方程式，并根據(jù)所建立的方程，對照鑒定的遺傳性別信息，檢驗(yàn)判別的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 半滑舌鰨幼魚雌、雄、偽雄形態(tài)性狀分析

對349尾半滑舌鰨70日齡幼魚雌、雄、偽雄性別樣本的形態(tài)測量性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1）。經(jīng)檢驗(yàn)，樣本中半滑舌鰨雌、雄、偽雄的各項(xiàng)測量數(shù)值均為正態(tài)性分布，且符合方差齊性（P＞0.05）。雌性群體的全長（FL）和體高（BH）大于雄性，全長／體高（FL／BH）小于雄性，且均有顯著差異（P＜0.05）；雌、偽雄群體間，只在全長／體高（FL／BH）方面差異顯著（P＜0.05）；雄魚和偽雄魚的形態(tài)性狀則無顯著差異。從以上統(tǒng)計(jì)可以得知，雌魚的整體輪廓較同期雄魚和偽雄魚更為寬大。

2.2 主成分分析

對半滑舌鰨早期幼魚樣本的5個(gè)形態(tài)測量性狀，運(yùn)用R軟件princomp（）函數(shù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，前3個(gè)主成分（PC1、PC2、PC3）的特征值較大，它們的貢獻(xiàn)率分別為39.011%、27.976%、19.045%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到86.032%（表2）。其中PC1負(fù)荷量較大的有全長（FL）和體高（BH），主要反映半滑舌鰨整體輪廓大小特征；PC2負(fù)荷量較大的為尾巴角度正切值（CT）和全長體高比（FL／BH），反映了魚體的寬度大小以及尾巴角度的影響；PC3主要負(fù)荷量較大的為背部與水平線角度（DT）和全長體高比（FL／BH），主要反映視覺上魚體的長寬比。

根據(jù)主成分分析的結(jié)果，繪制半滑舌鰨早期個(gè)體樣本的主成分得分散點(diǎn)圖。如圖2所示，盡管分散不明顯，但仍表現(xiàn)出分離態(tài)勢，雌性個(gè)體整體得分較高，趨于圖的上部分，雄性個(gè)體得分趨于圖的下部，偽雄性個(gè)體分散于圖片中部。

2.3 判別分析

由于主成分分析只能揭示半滑舌鰨不同性別群體間形態(tài)變異的特征和程度，無法判別單一半滑舌鰨的性別，因此需要進(jìn)行判別分析。進(jìn)一步對349尾半滑舌鰨個(gè)體的5項(xiàng)形態(tài)測量性狀進(jìn)行判別分析，根據(jù)各變量對模型的貢獻(xiàn)率，所建立的判別模型方程為：

第一判別式LD1對區(qū)分雌、雄、偽雄的貢獻(xiàn)率大小為0.813 7，第二判別式LD2對區(qū)分各性別組的貢獻(xiàn)率為0.186 3，誤判率為0.435 5。判別函數(shù)的顯著性檢驗(yàn)顯示P＜0.01，達(dá)到極顯著水平。利用所建立的判別方程，對349尾半滑舌鰨雌、雄、偽雄個(gè)體性別進(jìn)行判別檢驗(yàn)。其中，雄性個(gè)體判別準(zhǔn)確率較高，為85.000%；雌性個(gè)體判別準(zhǔn)確率較低，為37.069%；偽雄魚個(gè)體判別準(zhǔn)確率極低，為1.887%，偽雄魚形態(tài)特征不明顯且更易判為雄魚；綜合判別準(zhǔn)確率為56.447%（表3）。

3 討論

分析不同性別魚體間的形態(tài)特征差異，建立形態(tài)指標(biāo)體系，進(jìn)行雌雄差異判別，是一種可行、有效的方法［33-35］。本研究針對生產(chǎn)中通過觀察半滑舌鰨幼魚形態(tài)來判斷性別的科學(xué)性問題，建立了3種性別判別模型方程進(jìn)行判別檢驗(yàn)，相關(guān)結(jié)果對能否通過體型差異淘汰雄性和偽雄性個(gè)體，以提高商品苗的雌性率提供了重要的理論依據(jù)。

表1 半滑舌鰨雌、雄、偽雄形態(tài)性狀的參數(shù)統(tǒng)計(jì)（N=349）Tab.1 Statistics ofmorphological characters of female，male and pseudomale in Cynoglossus sem ilaevis

表2 主成分貢獻(xiàn)率及各指標(biāo)負(fù)荷量Tab.2 Contribution rate of principal com ponents and load capacity of each index

本研究發(fā)現(xiàn)，雌性幼魚整體輪廓較雄性和偽雄性大，且腹部較寬，而雄魚和偽雄魚在形態(tài)上較為相似，這與其成體的外部形態(tài)也較為一致［7］。雌、雄、偽雄性個(gè)體間存在的這種形態(tài)差異，與其體內(nèi)性激素水平、性成熟時(shí)間有關(guān)，卵巢和精巢的細(xì)胞學(xué)分化通常不同步，雄魚較雌魚成熟所需時(shí)間短［36］。

本研究應(yīng)用主成分分析方法，對可能反映半滑舌鰨不同性別形態(tài)差異的多維空間相關(guān)變化的數(shù)據(jù)集，降維轉(zhuǎn)化為少量且相互獨(dú)立的新綜合指標(biāo)，從而簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并包含原指標(biāo)中的主要信息。由主成分分析結(jié)果可知，提取的3個(gè)主成分（PC1、PC2、PC3）的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)86.032%，表明該方法既可保留變量間的大部分信息，又能夠保證較高的預(yù)測準(zhǔn)確度。根據(jù)主成分分析得分情況可知，對性別分離作用較大的主要是全長、體高及其比值方面，表明半滑舌鰨雌、雄、偽雄性個(gè)體間的差異主要集中在整體輪廓大小的指標(biāo)方面，這與其形態(tài)性狀差異顯著性分析的結(jié)果相符，可為半滑舌鰨幼魚性別判別、篩選培育高雌群體提供重要理論參考。

同時(shí)，判別分析是一種實(shí)用性很強(qiáng)的統(tǒng)計(jì)判別和分組技術(shù)，已有多種魚類通過本方法有效區(qū)分不同性別群體，如長江口鰻鱺的雌雄判別準(zhǔn)確率為88.59%［37］，金錢魚的雌雄綜合判別準(zhǔn)確率為85.96%［29］，紅鰭東方鲀的性別綜合判別準(zhǔn)確率為 81.90%［30］，河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）雌雄綜合判別準(zhǔn)確率為71.0%［33］，翹嘴紅鮊（Eryghroculter ilishaeformis）群體的識別正確率達(dá)91.0%［38］，翹嘴鱖雌、雄綜合判別準(zhǔn)確率為61.7%［28］。本研究的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，半滑舌鰨70日齡幼魚雄性判別準(zhǔn)確率為85%，可篩選淘汰大部分雄魚，雌性個(gè)體判別準(zhǔn)確率為37%，偽雄魚個(gè)體易判為雄魚，偽雄魚的生長速度雖較雄魚稍快，但較正常雌魚慢，由于需要淘汰偽雄魚，因此盡管其判定準(zhǔn)確性低，但是并不影響實(shí)際應(yīng)用。本研究顯示，雌性判別率較低，相當(dāng)一部分雌性個(gè)體存在易錯(cuò)判為雄性個(gè)體而被淘汰掉，從而造成一定程度的苗種浪費(fèi)，但由于生理雄魚的判別率較高，因而更容易被淘汰掉。所以總體上看，根據(jù)形態(tài)學(xué)性狀建立的判別方法可在70日齡左右區(qū)別并淘汰雄魚及偽雄魚，從而在一定程度上提高苗種的雌性率，但同時(shí)也會(huì)把一部分雌魚淘汰掉。

表3 70日齡半滑舌鰨性別判別結(jié)果Tab.3 Discrim inant results of sexual discrim ination of 70 days Cynoglossus sem ilaevis

綜上，本研究利用70日齡半滑舌鰨雌、雄、偽雄性別的形態(tài)差異建立判別模型，其雄魚判別準(zhǔn)確率達(dá)85%，較之前通過強(qiáng)光照射方法肉眼判斷雄魚54.7%的準(zhǔn)確率［17］有了較大提高，為生產(chǎn)上通過觀察幼魚形態(tài)指標(biāo)、篩選淘汰雄性個(gè)體、提高商品苗的雌性率提供了科學(xué)依據(jù)。各性別魚體在生長過程中，由于體型的增大，全長／體高的比值會(huì)隨之變化，所以不易固定量化。但對于同一批次魚而言，大致符合雄魚比雌魚全長較短、體高較窄的特點(diǎn)。早期淘汰雄魚和偽雄魚會(huì)使一定比例的雌魚淘汰掉。由此建議半滑舌鰨早期苗種的篩選時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐七t，如120日齡，此時(shí)魚體性別已完全分化，但同時(shí)也會(huì)增加苗期的養(yǎng)殖成本，因此在實(shí)際生產(chǎn)中需綜合權(quán)衡，以達(dá)到養(yǎng)殖效益最大化。