陳慧穎 馬石霞

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州 730124）

腸道微生物區(qū)系是大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)不可或缺的組成部分，它影響一系列生物功能，包括生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)、繁殖、消化、免疫和信息素產(chǎn)生[1,2]。在這些微生物中，細(xì)菌是昆蟲(chóng)腸道內(nèi)微生物群的重要組成部分，其中一些細(xì)菌還與其他微生物及其宿主形成共生關(guān)系。昆蟲(chóng)的消化道在形態(tài)和物理、化學(xué)上的性質(zhì)影響了內(nèi)源微生物群落結(jié)構(gòu)[3-5]。這類腸道微生物還有待進(jìn)一步的研究和開(kāi)發(fā)。白蟻幼蟲(chóng)以新鮮或分解的植物材料為食，腸道微生物以具有高度多樣性的細(xì)菌群落和發(fā)酵物為主。

在本研究中，以植物纖維為食的黃翅土白蟻?zhàn)鳛槔ハx(chóng)源，用于分離和表征腸道纖維素降解細(xì)菌。

1 材料和方法

1.1 收集和解剖

黃翅土白蟻采自河南南陽(yáng)的地瓜田，保存在裝有無(wú)菌土壤的塑料容器（200 mL）中。用70%乙醇滅菌的地瓜塊莖喂養(yǎng)白蟻。解剖前，將10 只白蟻饑餓24 h 以清理腸道，然后用70%乙醇進(jìn)行表面滅菌以去除所有污染物。隨后，在無(wú)菌蒸餾水中洗滌并風(fēng)干1 min。

1.2 培養(yǎng)基

所有化學(xué)品都是購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：3 g 牛肉膏、5 g 蛋白胨、5 g NaCl、20 g 瓊脂和1 000 mL蒸餾水。羧甲基纖維素培養(yǎng)基（CMC培養(yǎng)基）：15 g CMC-Na、1 g NH4NO3、1 g 酵母膏、0.5 g MgSO4·7H2O、1 g KH2PO4和蒸餾水1 000 mL。兩種培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂。糖發(fā)酵試劑盒購(gòu)自上海威正翔禹生物科技有限公司。

1.3 纖維素分解細(xì)菌的分離和篩選

在無(wú)菌條件下切開(kāi)內(nèi)臟放入9 mL 無(wú)菌蛋白胨水中，渦旋勻漿，并按1：10 進(jìn)行稀釋，然后劃線接種于無(wú)鹽培養(yǎng)基，分離單菌落，再采用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行純種培養(yǎng)。用8 mm 無(wú)菌圓形木塞在CMC 固體培養(yǎng)基輕輕壓出培養(yǎng)孔，將0.1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液接種于圓孔中心，在30 ℃孵育48 h，然后加入0.1%剛果紅溶液孵育15 min，再用1 M NaOH 浸泡10 min，每個(gè)孔周圍產(chǎn)生的透明區(qū)域表明纖維素降解。分離菌的纖維素分解指數(shù)通過(guò)以下方法測(cè)定。

纖維素分解指數(shù)＝（透明區(qū)域直徑－培養(yǎng)孔直徑）/培養(yǎng)孔直徑。

1.4 16 S rDNA 的提取及PCR 擴(kuò)增

目的纖維素分解細(xì)菌培養(yǎng)物以8 000 g 離心6 min，棄去上清液。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用通用引物16 S 5’-TGGTAGTCCACCCCCCTAAAC-3’和5’-CTGGAAAGTCCGTGGAGT-3 從基因組DNA 中擴(kuò)增16 S rRNA。PCR 反應(yīng)體系為：10 μL DNA, 1×Taq Buffer, 1.25 mM MgCl2, 0.5 mM dNTPs, 0.5 mM 引物，AND 0.1U of Taq DNA polymerase。熱循環(huán)條件是在94 ℃下初始變性5 min，在94 ℃下變性30 s，在50 ℃下退火30 s，在72 ℃下引物延伸1 min，在72 ℃下最終延伸10 min。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物采用1% w/v 瓊脂糖凝膠分離，用溴化乙錠(10 mg·mL-1)染色，并用凝膠提取試劑盒回收測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用NCBI 的BLAST-N 搜索程序，將16 S rDNA 基因序列數(shù)據(jù)與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 纖維素分解細(xì)菌的形態(tài)特征

依據(jù)伯杰的系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)對(duì)分離菌落的形態(tài)特征進(jìn)行分類。通過(guò)革蘭氏染色分析菌落特征。根據(jù)性質(zhì)、形狀、色素沉著和革蘭氏染色對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行評(píng)估。

1.7 纖維素分解菌的生化特性

使用糖發(fā)酵試劑盒檢測(cè)分離株的糖代謝能力。將單菌落在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)72 h。將50 μL 培養(yǎng)物接種在試劑盒中，并在35 ±2 ℃孵育18～24 h，根據(jù)試劑盒提供的圖表計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 纖維素分解菌的篩選和分離

從腸道勻漿中共分離到27 株細(xì)菌，其中5 株細(xì)菌具有纖維素代謝活性，命名為CDB3、CEB2、FB6、FB7 和EB2。其中纖維分解活性最高的是CDB3 見(jiàn)表1。

表1 分離菌的纖維素分解指數(shù)

2.2 纖維素分解菌16 S rDNA 基因的染色體組型和序列分析

通過(guò)16 S rDNA 多重序列比較構(gòu)建5 種纖維素分解菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。在5 個(gè)分離株中，F(xiàn)B7 和EB2 親緣關(guān)系較近，而B(niǎo)2B 和B1B 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這些分離株與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他細(xì)菌菌株顯示出95～100%的核苷酸同源性（見(jiàn)表2）。

圖1 16 S rDNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖

表2 纖維素分解菌16 S DNA 的BLAST-N 結(jié)果

2.3 纖維素分解細(xì)菌的形態(tài)特征

分離細(xì)菌的菌落在大小、形狀、邊緣和高度上各不相同，但是染色特點(diǎn)和菌落顏色具有相似性。5 種分離菌均為革蘭氏陰性菌，CDB3 和EB2 為棒狀革蘭氏陰性菌，菌落較小，突起，邊緣呈凸?fàn)钔黄?；FB6 和FB7 在形狀和革蘭氏染色上相似，前者菌落小，邊緣呈扁平狀突起，而后者較大，圓形突起，邊緣呈波狀；CDB3 分離株是一種球形革蘭氏陰性細(xì)菌，在大小、邊緣和高度上有明顯差異（見(jiàn)表3）。

表3 纖維素分解細(xì)菌特征

2.4 纖維素分解細(xì)菌的生化特性

這些細(xì)菌菌株均能發(fā)酵果糖、葡萄糖、海藻糖、肌醇、核糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、檸檬酸鹽、半乳糖、已六醇、纖維二糖、七葉苷，但對(duì)棉子糖、蜜二糖等利用情況有所差異（見(jiàn)表4）。

表4 纖維素分解細(xì)菌分離物的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

3 討論

纖維素廢料是地球上最豐富的可再生資源[6,7]，它在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和城市垃圾中廣泛存在。然而，纖維素廢物具有異質(zhì)性和難處理性，它是常規(guī)能源生產(chǎn)和環(huán)境恢復(fù)轉(zhuǎn)化過(guò)程的主要障礙。利用生物體開(kāi)發(fā)纖維素酶解系統(tǒng)是最佳的研究方法之一[8-10]。因此，嗜熱纖維素降解細(xì)菌及其用于生物能轉(zhuǎn)化過(guò)程的酶，是開(kāi)發(fā)纖維素降解和生產(chǎn)包括糖和生物乙醇在內(nèi)的替代燃料的關(guān)鍵[11-13]。本研究從中原地區(qū)白蟻腸道內(nèi)分離培養(yǎng)纖維素分解菌，通過(guò)16S RNA 測(cè)序，與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。同時(shí)初步研究了分離菌的菌落特點(diǎn)和菌體特性以及分離菌的糖發(fā)酵生化反應(yīng)特點(diǎn)等。這些研究為采用生物策略分離纖維菌分解菌，以及其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?？傊?，我們從白蟻腸道中篩選出的5 株易于繁殖和培養(yǎng)、高降解纖維素能力的菌株，分離篩選和鑒定這些可降解纖維素的微生物，可以為實(shí)現(xiàn)白蟻腸道來(lái)源的微生物資源的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并能夠?yàn)橹参飶U棄物的生物降解提供技術(shù)支持。