（東北林業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

在現(xiàn)代食品工業(yè)中，人們通常采用各種包裝技術(shù)和方法來保存食物，但是無論采用哪種技術(shù)方法，并不能保證微生物完全不存在，對于大多數(shù)食品通常使用防腐劑作為防御的第二防線，以延長食品的保質(zhì)期。但是部分化學(xué)合成防腐劑具有一定的刺激性甚至致癌性，而天然防腐劑來源廣泛且對人體危害較小。從植物中獲取天然抗菌劑一直是近幾年的研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)天然的植物精油抗菌效果明顯，對多種耐藥性菌株有明顯的抑制作用，這可以進(jìn)一步推進(jìn)我國在天然防腐劑方面的研發(fā)，讓人們不再因為食品防腐安全而擔(dān)憂。

紅松Pinus koraiensis為松科Pinaceae 松屬的常綠喬木，是國家Ⅱ級重點保護野生植物，分布廣，是東北地區(qū)主要的森林樹種之一[1]。紅松資源豐富，在東北東部林區(qū)以及林業(yè)局保存了天然的紅松母樹林。目前，關(guān)于提取方法對精油提取率影響的研究已有報道。包怡紅等[2]采用波輔助-鹽析-水蒸氣蒸餾法提取黑皮油松松針精油，得出精油平均得率為0.388 2%。湯曉鷗等[3]使用復(fù)合酶法提取松針精油，該方法提取率比常規(guī)的方法高出37.9%。另外，徐麗珊等[4]用水蒸氣蒸餾法證實了黃山松和濕地松松針的成分有所不同，但是他們均含有萜烯類化合物，這一點說明了萜類物質(zhì)是大多數(shù)松針精油所共有的物質(zhì)。另外，同一棵松樹不同部位的精油的成分也有所不同。蒙琦等[5]利用氣質(zhì)聯(lián)用和固相微萃取技術(shù)，對松塔揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，松塔中含量較高的是α-蒎烯（44.258%），其次是D-檸檬烯（23.426%）、β-蒎烯（8.674%）、石竹烯（3.462%）等。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對松塔的化學(xué)成分及生物活性展開了大量研究工作，結(jié)果顯示松塔中含有萜類、木質(zhì)素類、多糖等多種化學(xué)成分[6]，并具有抗腫瘤、抗病毒[7]、抗菌、增強免疫力等生物活性，具有重要的藥物開發(fā)前景。通過現(xiàn)代技術(shù)對松針成分分析，發(fā)現(xiàn)松針提取物富含糖類、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和多種礦物質(zhì)元素、維生素、精油、酶及輔酶等活性物質(zhì)[8-9]。松殼中含有木質(zhì)素、芪類、揮發(fā)油、維生素類、棕櫚堿、礦物質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)、脂肪與黃酮類等多種生物活性物質(zhì)[10]?；跉庀嗌V法（GC）、液相色譜法和質(zhì)譜法（MS）的研究已經(jīng)報道了松仁的成分[11]，然而關(guān)于松針、松塔的成分卻鮮有報道[12]。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對紅松不同部位揮發(fā)油的成分進(jìn)行了測定和比較，并對3 種食源性細(xì)菌進(jìn)行了抑菌活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料

紅松松殼、松塔、松針：采于東北林業(yè)大學(xué)校園，將松殼、松塔、松針洗凈、干燥、粉碎，過60 目篩，得到預(yù)處理產(chǎn)物。

1.1.2 儀 器

蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司），生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司），電子天平（丹佛儀器有限公司），電熱恒溫轉(zhuǎn)風(fēng)干燥箱（上海恒科有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 松針、松塔、松殼前處理

選取新鮮無枯萎的紅松松針、松塔、松殼，洗凈后用高速多功能粉碎機將其粉碎，過標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，置于干燥箱中干燥以備用。

1.2.2 精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法[13]提取精油。稱取紅松松針、松塔、松殼粉末各100 g，置于2 000 mL 的圓底蒸餾燒瓶中，按照1:8 的比列加入蒸餾水，每100 g 粉末中加入0.5 g NaCl，連接好揮發(fā)油提取器與冷凝管，打開電熱套開關(guān)進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取得到3 種精油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后稱重，按照精油得率為精油質(zhì)量占粉末質(zhì)量的百分比，計算3 種精油的得率。放置黑暗中4℃保存。

1.2.3 菌懸液的制備

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均來自中國東北林業(yè)大學(xué)實驗室。細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)[14]。

1.2.4 GC-MS 分析3 種精油的物質(zhì)成分

精油的前處理：精確稱取100 mg 的精油，以正己烷為溶劑定容于100 mL 容量瓶，過0.45 μm有機相微孔濾膜至氣相進(jìn)樣瓶。

GC 條件：CP-Sil 88 毛細(xì)管柱（100.0 m×0.25 mm×0.20 μm）；He 載氣；柱流量2 mL/min；進(jìn)樣口溫度260℃；起始溫度140℃；保持5 min；分流比20:1；進(jìn)樣量1 μL；離子源溫度220℃。

MS 條件：EI 電離方式；離子源溫度220℃；接口溫度240℃；溶劑延遲時間4.5 min；分子質(zhì)量掃描范圍50～550 u；掃描時間0.5 s，掃描方式為全掃描；檢索譜庫DATABASE/NIST98.L。

1.2.5 3 種精油成分的定性與定量分析

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀中的NISTI4 譜庫，自動檢索分析組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對全部檢索結(jié)果參考有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)圖譜和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行核對和補充，采用色譜峰面積歸一化法，計算各組分的相對百分含量。

1.2.6 抑菌活性的測定

1）抑菌直徑的測定。采用濾紙片擴散法測定抑菌圈直徑[14]，用打孔器將濾紙片制成直徑為6 mm 的小圓片，然后放入121℃滅菌鍋中15 min殺菌。在超凈工作臺上，將培養(yǎng)基倒入平板中，約2 cm 厚，待其冷卻凝固。用移液槍吸取制備好的菌懸液100 μL，均勻涂布在瓊脂平板上，靜置5 min，將濾紙片平鋪在瓊脂板上，每個培養(yǎng)皿貼3片，濾紙片間保持一定距離。用移液槍吸取10 μL精油滴在濾紙片上，以雙抗作為陽性對照，吸取10 μL 雙抗滴在濾紙片上。另外一個濾紙片滴加無菌蒸餾水作為陰性對照。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。然后將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌直徑的大小，3 次平行，結(jié)果取重復(fù)實驗平均值。

2）最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。參考樊梓鸞、Mirjana 等[16-17]的方法經(jīng)改進(jìn)后采用二倍稀釋法測定紅松揮發(fā)油的最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），對其抑菌活性進(jìn)行定量分析，小試管一共27 只，分成3 組，121℃高壓滅菌20 min，各編號1～9，在無菌條件下，加入4.5 mL 的液體培養(yǎng)基，然后向1～8 號試管中各加入0.5 mL 的菌懸液，用微量移液器分別移取50、25、12.5、6.3、3.2、1.6、0.8、0 μL 加入1～8 號試管中，9 號試管作為空白對照在冰箱中冷藏，其余24 只試管恒溫震蕩培養(yǎng)。從小試管中取50 μL 涂布在平板上，密封培養(yǎng)后拿出，觀察各濃度培養(yǎng)皿上是否有菌生長。MIC值為培養(yǎng)24 h 不長細(xì)菌時的揮發(fā)油濃度[18]，MBC值為培養(yǎng)48 h 不長細(xì)菌時的揮發(fā)油濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中的測試均平行檢測3 次?；A(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Excel 2019 軟件，圖表均采用Origin 9.0 處理完成，顯著性分析采用SPSS 21.0 軟件，圖和表中不同字母表示兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅松不同部位精油的得率分析

圖1列出了來自3 個不同部位（松針、松塔和松殼）的淡黃色精油的質(zhì)量及其相應(yīng)的得率。松針、松塔、松殼精油的得率分別為0.152%、0.243%、0.024%。

圖1 紅松不同部位提取的得率Fig.1 Yield of essential oil from different parts of Korean pine

2.2 紅松不同部位精油GC-MS 定性和定量分析

在全掃描模式下，在GC/MS 上獲得總離子電流（TIC）；紅松不同部位精油樣品的典型TIC如圖2～4 所示。通過比較EI 質(zhì)譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST11）的裂解模式，對大多數(shù)化合物進(jìn)行了明確的鑒定；對于那些沒有充分保證的化合物，鑒定是基于EI 和化學(xué)電離質(zhì)譜的聯(lián)合信息[19]。通過比較EI 質(zhì)譜和我們實驗室或文獻(xiàn)資料中的真實化合物的裂解模式，進(jìn)一步證實了其中的一些。

圖2 紅松松針精油的總離子流Fig.2 Total ion current of essential oils from different parts of Korean pine needle

圖3 紅松松塔精油的總離子流Fig.3 Total ion current of essential oils from different parts of Korean pine cone

圖4 紅松松殼不同部位精油的總離子流Fig.4 Total ion current of essential oils from different parts of Korean pine shell

定量用峰面積百分比表示。以氣相色譜峰面積計算各組分相對含量，無需校正響應(yīng)因子。從抽提面積看松針、松塔、松殼中揮發(fā)油的組分分別為84.61%、89.14%和81.03%。結(jié)果見表1，3種精油經(jīng)過GC-MS 分析與NIST14 譜庫進(jìn)行了對比，其中化合物選取了相似度90%及以上的物質(zhì)進(jìn)行了定量分析。

2.3 紅松不同部位精油成分分析比較

如表2所示，每種揮發(fā)油的組成均以萜類、醇類、酯類、酮類為主[20]，其中松針、松塔的萜類含量較高，分別為75.93%、66.25%。然而，松殼中萜類含量較少為5.23%。松針中主要的萜類是蒎烯（26.15%），主要的酯類是左旋乙酸冰片酯（13.08%）；松塔中主要的萜類是檸檬烯（22.67%），主要的酯類是5-甲基-2-(1-甲基乙烯基)-4-己烯-1-醇乙酸酯（14.13%）；松塔中主要的酮類是4-羥基-4-甲基-2-戊酮（39.62%），主要的酯類是酞酸二乙酯（12.99%）。其中蒎烯是一種合成香料的重要原料[21]，是無色透明液體，微溶于水，不溶于丙二醇、甘油，溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸等多數(shù)有機溶劑。而檸檬烯[22]是一種植物精油,對引起肉類腐敗的常見致腐菌有較為明顯的抑制作用。此研究紅松松殼成分與宗芳芳等[23]研究結(jié)果相似。

表1 紅松不同部位精油成分的研究?Table 1 Composition of the essential oils from different parts of Korean pine

續(xù)表1Continuation of table 1

續(xù)表1Continuation of table 1

表2 紅松不同部位精油的主要成分Table 2 Main compounds of the essential oils from different parts of Korean pine

2.4 3 種部位精油的抑菌活性

2.4.1 3 種部位精油的抑菌直徑

由表3可得，這3 種不同部位的精油對于各種測試菌種均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，抑菌直徑在9.842～13.887 mm。紅松松針精油對大腸桿菌的抑制效果最好（抑菌直徑為13.887±0.07 mm），高于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，抑菌直徑分別為12.813±0.65 mm、11.961±0.22 mm；松塔精油對大腸桿菌抑制效果最佳（抑菌直徑為12.625±0.09 mm），抑制效果顯著高于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，但兩種測試菌抑菌直徑相差不大，其抑菌直徑分別為10.622±0.33 mm、10.476±0.45 mm；松殼精油對枯草芽孢桿菌抑制效果最佳（抑菌直徑為10.975±0.47 mm），其次是大腸桿菌（抑菌直徑為10.546±0.11 mm），對金黃色葡萄球菌抑制效果最差（抑菌直徑為9.842±0.24 mm）。其中松塔和松針精油抑菌活性為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌，而松殼精油的抑菌活性為枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌。由此可知不同部位精油抑菌效果不同。對于紅松松針精油抑菌效果的結(jié)果與樊梓鸞等[16]研究結(jié)果一致。

2.4.2 3 種部位精油的最低抑菌濃度（MIC）

由表4可知，精油對各測試菌種均有抑菌效果，且MIC 值在1.6～6.4 μL/mL 范圍內(nèi)，不同部位精油作用于同一種供試菌有可能產(chǎn)生相同的抑菌效果。松針精油對大腸桿菌的MIC 值為1.6 μL/mL，抑菌效果最佳，金黃色葡萄球菌的MIC 值為3.2 μL/mL，枯草芽孢桿菌的MIC 值為6.4 μL/mL；松塔精油對大腸桿菌的MIC 值為3.2 μL/mL，另兩種的MIC 值均為6.4 μL/mL；松殼精油對大腸桿菌的MIC 值為3.2 μL/mL，金黃色葡萄球菌的MIC 值為12.5 μL/mL，抑菌效果最差，枯草芽孢桿菌的MIC 值為6.4 μL/mL。

2.4.3 3 種部位精油的最小殺菌濃度（MBC）

由表5可知，松針精油對大腸桿菌的MBC值為3.2 μL/mL，金黃色葡萄球菌的MBC 值為6.4 μL/mL，枯草芽孢桿菌的MBC 值為12.5 μL/mL；松塔精油對大腸桿菌的MBC 值為6.4 μL/mL，另兩種的MBC 值均為12.5 μL/mL；松殼精油金黃色葡萄球菌的MBC 值為12.5 μL/mL，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的MBC 值均為6.4 μL/mL。

表3 紅松不同部位精油的抑菌直徑?Table 3 Antibacterial diameter of essential oil from different parts of Korean pine mm

表4 紅松不同部位精油最小抑菌濃度?Table 4 Minimum inhibitory concentration of essential oil from different parts of Korean pine

表5 紅松不同部位精油最小殺菌濃度Table 5 Minimum bactericidal concentration of essential oil from different parts of Korean pine

由上述內(nèi)容可知，紅松3 種精油對供試菌種在試驗濃度范圍內(nèi)均有抑菌效果，但不同部位的精油對不同供試菌的最低抑菌濃度和最小殺菌濃度不同，其MIC、MBC 值之間差異較大，紅松的3 種部位的精油對革蘭氏陰性菌的抑制效果（大腸桿菌）明顯優(yōu)于革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的抑制效果，研究結(jié)果與抑菌圈測定結(jié)果基本一致。

3 討 論

如今，人工添加劑在食品加工中所引發(fā)的安全問題逐漸被人們重視，因此從植物中獲得的天然添加劑如佛手柑精油、柑橘精油和紅松精油等更受到了人們的青睞[24]。此外，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，從高抗菌性植物中提取的藥物可以有效減少或避免抗生素治療細(xì)菌感染性疾病所引起的健康問題。并且長期使用抗生素可能會造成耐藥性而引起功能失調(diào)，而從植物中獲得的新藥可降低該問題發(fā)生概率。因此，紅松作為一種天然的抗菌源，無論從食品領(lǐng)域還是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，都具有廣闊的開發(fā)前景。

利用GC-MS 法分析精油樣品中的成分，從松針、松塔、松殼精油中分別鑒定出28、46、21 種成分，其中松針、松塔中萜類物質(zhì)是松殼中萜類物質(zhì)的11～15 倍。在松針、松塔精油中的酮類化合物含量較低，然而在松殼精油中酮類化合物卻占近60%。并且所鑒定的某些成分的含量因提取的部位不同而有明顯差異[25]。精油對各測試菌種均有抑菌效果，3 種精油的抑菌直徑在9.842～13.887 mm，抑菌直徑范圍屬于產(chǎn)生敏感效果范圍內(nèi)[26]，且MIC 值在1.6～6.4 μL/mL 范圍內(nèi)，不同部位精油對同一種供試菌可能會產(chǎn)生相同的抑菌效果。其中松針精油抑菌效果比松塔精油和松殼精油抑菌效果更佳，并且3 種部位的精油對革蘭氏陰性菌抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽性菌抑制效果。

紅松分布廣泛，藥用價值高，因此具有很好的經(jīng)濟價值。目前，已有很多相關(guān)紅松松針精油抑菌的報道，證明松針精油中的單萜類化合物和倍半萜類化合物具有保藏和殺菌作用。這可能是紅松被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)等領(lǐng)域的原因[27]。另外，已有很多單獨對紅松松殼精油或松塔精油中的成分、抑菌效果等的研究，但是沒有集中對紅松松針、松殼和松塔精油成分及抑菌效果對比分析的研究。首次對紅松不同部位的精油成分和抑菌效果進(jìn)行研究和比較，發(fā)現(xiàn)不同部位精油的成分存在差異，這也決定了紅松不同部位的精油抑菌效果不同[28]?？咕鷮嶒灲Y(jié)果表明3 種精油普遍對大腸桿菌具有很好的抑制效果并且松針精油抑菌效果優(yōu)于松塔精油和松殼精油。但是由于精油化合物組成、測試菌株及測定方法等方面的差異使得研究結(jié)果還需要進(jìn)一步深入研究。紅松作為一種天然的抗菌源，其應(yīng)用還有待于更多領(lǐng)域的探索，由于本研究尚未深入研究紅松精油的抑菌機理，并且精油易揮發(fā)不穩(wěn)定，下一步的試驗中將要對紅松精油進(jìn)行包埋研究，并初步揭示紅松精油的抑菌機理。

4 結(jié) 論

本試驗通過對紅松不同部位的精油成分和抑菌效果進(jìn)行了研究和比較。采用GC-MS 法分析了不同部位精油的成分，結(jié)果表明3 種精油成分差異顯著。通過對抑菌直徑和抑菌最小濃度的分析，精油對于各種測試菌種均表現(xiàn)出良好的抑菌活性，其中紅松松針精油抑菌效果最佳，且對大腸桿菌的抑菌圈直徑最大。通過對紅松的研究，從不同部位的精油成分、提取率、抑菌效果闡述了人工開發(fā)和利用紅松精油作為天然抗菌劑的可能性。因此，下一步有必要對紅松精油在食品添加劑尤其是抑菌方面的應(yīng)用作深入的研究，從而為紅松精油的綜合利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。