胡新元，賈小霞，劉石，陳曉艷，黃偉，齊恩芳*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；

3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；4.農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅渭源748201；5.哈密市伊州區(qū)種業(yè)研究開(kāi)發(fā)中心，新疆維吾爾自治區(qū)哈密839001）

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，宜糧、宜菜、宜飼、宜做工業(yè)原料，很多國(guó)家都非常重視馬鈴薯生產(chǎn)。種薯退化一直是制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要問(wèn)題，病毒侵染是引起馬鈴薯種性退化的主要原因。馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）和 馬 鈴 薯S病 毒（Potato virus S，PVS）在中國(guó)分布廣泛、危害嚴(yán)重，是造成馬鈴薯種性退化的主要病毒[1,2]。而且在田間馬鈴薯病毒病發(fā)生比較復(fù)雜，經(jīng)?；旌细腥荆?種甚至多種病毒混合侵染帶來(lái)的損失遠(yuǎn)大于各病毒單獨(dú)侵染。病毒侵染造成馬鈴薯種質(zhì)退化，產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣。

目前在世界上還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)較成功的化學(xué)方法來(lái)防治病毒病，利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)脫毒，工作量大，成本偏高，由于病毒的田間再侵染，能保持無(wú)病毒或低含量病毒的有效期限很短，脫毒2～3年后因再侵染問(wèn)題產(chǎn)量又會(huì)嚴(yán)重降低。用常規(guī)育種方法改良品種抗性，由于馬鈴薯栽培種是同源四倍體作物，育種周期長(zhǎng)，天然抗病毒基因資源缺乏，雜交后代遺傳分離廣泛，使得常規(guī)育種效率很低。

在自然界中，一種植物往往是多種病毒的寄主，病毒的共存會(huì)造成更嚴(yán)重的危害。將不同種類(lèi)病毒的基因片段整合成融合基因，轉(zhuǎn)化獲得具有多重抗病性的轉(zhuǎn)基因植物，是解決這一問(wèn)題的有效途徑。1986年，Abel等[3]首次成功地將煙草花葉病毒（tmv）的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化到煙草植物中。此外，外殼蛋白基因介導(dǎo)的抗病毒基因工程還在西瓜[4]、小麥[5]、水稻[6]、百合[7-10]等多種植物中成功，獲得病毒抗性。在馬鈴薯抗病毒基因工程研究中，宋艷茹等[11]用PVX和PVY雙價(jià)外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化了馬鈴薯‘虎頭’和‘克新4號(hào)’，張鶴齡等[12]對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗病性鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的多數(shù)株系的平均病毒含量均明顯低于非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株，一些株系病毒積累較慢，發(fā)病時(shí)間延遲。說(shuō)明轉(zhuǎn)PVX和PVY雙價(jià)外殼蛋白基因的馬鈴薯，對(duì)PVX和PVY復(fù)合侵染發(fā)生不同程度的抗性和保護(hù)作用。進(jìn)而有些學(xué)者把不同病毒的基因或基因片段構(gòu)建成融合基因?qū)胫参?，亦獲得了雙抗轉(zhuǎn)基因植株[13-15]。

為了培育同時(shí)抗PVX、PVY、PLRV和PVS 4種病毒的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，本試驗(yàn)克隆了4種病毒CP基因300 bp左右較保守的基因片段并構(gòu)建了融合基因的轉(zhuǎn)化載體，試驗(yàn)旨在通過(guò)基因工程使馬鈴薯獲得對(duì)多種病毒的抗性，探索一條獲得多抗病毒轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的有效途徑，解決馬鈴薯種性退化問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以馬鈴薯品種‘隴薯3號(hào)’的脫毒試管苗為供試材料（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室提供），馬鈴薯PVX、PVS、PVY和PLRV病毒株，采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院會(huì)川馬鈴薯育種試驗(yàn)站。

1.2 菌株與質(zhì)粒

供試菌株LBA4404，含有質(zhì)粒pART27-XSYV-rh（由本試驗(yàn)室構(gòu)建）[16]，pART27-XSYV-rh含4種病毒（PVX、PVS、PVY和PLRV）CP基因片段，抗性標(biāo)記為卡拉霉素（Kan）。

1.3 馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化與植株再生

采用“固體+液體”試管薯誘導(dǎo)方法獲得‘隴薯3號(hào)’試管薯[17]。以誘導(dǎo)10周、直徑為0.5 cm的‘隴薯3號(hào)’試管薯為外植體，參照張寧等[18]方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將試管薯切成厚度為1 mm的薄片，接種于試管薯片分化培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基1L、吲哚乙酸（Indole-3-aceticacid，IAA）1.0mg、6-芐氨基嘌呤（6-benzyl-aminopurine，6-BA）1.0 mg、玉米素核苷（Zeatinriboside，ZT）2.0 mg]上，暗培養(yǎng)2 d后將試管薯薄片轉(zhuǎn)移到含50 mg/L Kan、500 mg/L Crb的分化培養(yǎng)基上，25℃、16 h/d光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗性芽，長(zhǎng)至1.5 cm左右時(shí)剪下接入含50 mg/L Kan、500 mg/L Crb的1/2 MS培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，然后進(jìn)行生根篩選，能正常生根及生長(zhǎng)的小苗為抗性植株。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的篩選

1.4.1 PCR檢測(cè)

用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株及非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株總DNA，以pART27-XSYV-rh質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯為陰性對(duì)照，以4種病毒融合基因的引物：X1（5'-CGGACTAGT Spe I GCAACTCCTGCCACGGCTT-3'），V2（5'-CGAGCTC Sac I CTAATTTGGAATTTGTTGACGTAG-GACTG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 200 bp。

1.4.2 PCR-Southern檢測(cè)

參照于鳳麗等[19]的方法，質(zhì)粒pART27-XSYV-rh PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳回收的1 200 bp片段，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以地高辛標(biāo)記后作為探針進(jìn)行雜交。采用瑞士Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記、膜雜交和顯色處理。

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè)

分別提取DNA檢測(cè)呈陽(yáng)性植株的總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以馬鈴薯Ef1α基因（Ef1α-F：5'-ATT GGAAACGGATATGCTCCA-3'和Ef1α-R：5'-TCCTTACCT GAACGCCTGTCA-3'）為內(nèi)參，用X1/V2為特異性引物，根據(jù)RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒（TIANGEN），ABI QuantStu 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，USA）進(jìn) 行qRT-PCR分 析。95℃2 min；95℃10 s，60℃34 s，72℃，30 s；45個(gè)循環(huán)。同時(shí)進(jìn)行熒光值變化曲線和溶解曲線分析，并根據(jù)公式2-ΔΔCT算出融合基因在轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定

將繁殖獲得的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯無(wú)性系和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯‘隴薯3號(hào)’脫毒苗移栽到營(yíng)養(yǎng)盆中，苗齡約為6葉期左右接種病毒。PVX、PVY、PVS采用機(jī)械摩擦接種[每株接種2片中上部葉片，取毒源葉片分別按1∶10（w/v）比例用磷酸緩沖液（PB，pH 7.4）進(jìn)行研磨，取汁液摩擦接種]；PLRV采用蚜蟲(chóng)接種（將無(wú)毒桃蚜在感染PLRV的馬鈴薯植株上飼毒3 d，然后用帶毒桃蚜接種，每株10頭，接種5 d后殺蚜）。接種方式為PVX、PVY、PVS、PLRV依次接種（間隔3 d，每份材料分別接10株）。接種20 d后，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附鑒定法（Double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay，DAS-ELISA）檢測(cè)病毒含量，檢測(cè)過(guò)程按DAS-ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束后用IMARK型酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國(guó)）測(cè)定405 nm處的吸光值。接種病毒的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯‘隴薯3號(hào)’脫毒苗為陽(yáng)性對(duì)照，未接種病毒的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯‘隴薯3號(hào)’脫毒苗為陰性對(duì)照，測(cè)試樣品吸光值等于或大于2倍陰性對(duì)照吸光值，判斷為陽(yáng)性。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用DPS v13.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的獲得

攜帶pART27-XSYV-rh質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染‘隴薯3號(hào)’試管薯薯片，在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周后，從薄片上直接再生出抗性小芽，待抗性芽長(zhǎng)到1 cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)3周Kan抗性篩選，轉(zhuǎn)基因植株生根并正常生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)化植株不能正常生根，共獲得10株抗性轉(zhuǎn)化植株（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的分子生物學(xué)鑒定

以抗性苗總DNA為模板，質(zhì)粒pART27-XSYV-rh為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照，利用融合基因的2個(gè)特異引物X1/V2對(duì)部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照和10株抗性苗擴(kuò)增出約1 200 bp的特異性擴(kuò)增條帶，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶（圖2）。初步證明再生植株為轉(zhuǎn)基因植株。為了排除假陽(yáng)性的存在，進(jìn)一步鑒定PCR產(chǎn)物是1 200 bp的融合基因片段，將PCR產(chǎn)物電泳轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Southern雜交，雜交結(jié)果（圖3，部分植株檢測(cè)結(jié)果）顯示，非轉(zhuǎn)基因植株、空白對(duì)照無(wú)雜交帶，而陽(yáng)性對(duì)照和各轉(zhuǎn)基因植株有雜交帶，檢測(cè)結(jié)果與前期PCR檢測(cè)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步證明這些株系是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。qRT-PCR結(jié)果分析表明（圖4），轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株有典型的熒光擴(kuò)增曲線和溶解曲線，而非轉(zhuǎn)基因植株和空白對(duì)照的熒光擴(kuò)增曲線和溶解曲線是一條直線。在轉(zhuǎn)pART27-XSYV-rh株系中能檢測(cè)到融合基因的表達(dá)，但基因表達(dá)水平在不同植株中存在一定的差異。基因表達(dá)量最高為S3-13，其次為S3-14，表達(dá)量最低的是S3-15。

圖1 抗性苗誘導(dǎo)過(guò)程Figure 1 Induction of resistant seedlings

圖2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定Figure 2 PCR analysis of transgenic plants

圖3 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的PCR-Southern檢測(cè)Figure 3 PCR-Southern analysis of transgenic potato

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(cè)Figure 4 qRT-PCR analysis of transgenic potato

2.3 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯抗性鑒定

對(duì)經(jīng)過(guò)qRT-PCR檢測(cè)的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（S3-13、S3-14和S3-15）經(jīng)切段快繁后移栽到營(yíng)養(yǎng)缽，以非轉(zhuǎn)基因‘隴薯3號(hào)’為對(duì)照，培養(yǎng)至6葉期時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照進(jìn)行病毒接種。接種20 d后各無(wú)性系的抗病性鑒定結(jié)果（表1中僅列出了經(jīng)PCR-Southern和qRT-PCR分析的轉(zhuǎn)基因植株的ELISA檢測(cè)結(jié)果）表明：轉(zhuǎn)pART27-XSYV-rh株系中，S3-13、S3-14的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)4種病毒均具有抗性；S3-15的PVS、PVX和PVY檢測(cè)結(jié)果為陰性，PLRV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但檢測(cè)數(shù)值低于陽(yáng)性對(duì)照。

表1 轉(zhuǎn)基因植株的ELISA檢測(cè)（OD405）Table 1 ELISA analysis of transgenic potato plants(OD405)

3 討論

PVX、PVY、PLRV和PVS 4種病毒分布廣泛，為害嚴(yán)重，且多由蚜蟲(chóng)傳播，自然條件下難以控制。由于馬鈴薯病毒病往往同時(shí)發(fā)生，單一抗性的品種改良已不能滿足需要，而傳統(tǒng)育種方法很難將4個(gè)抗性基因通過(guò)四倍體遺傳集中到一個(gè)品種中。利用基因工程方法，將構(gòu)建在不同載體上的多個(gè)基因轉(zhuǎn)入同一受體，因?yàn)檩d體間的相互影響，致使效率大大降低[20]。對(duì)于多病毒抗性，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展諸多有關(guān)馬鈴薯轉(zhuǎn)外殼蛋白基因抗病毒方面的研究[21-23]，但主要針對(duì)PVX、PVY、PLRV 3種病毒復(fù)合侵染以及這3種病毒的兩兩復(fù)合侵染開(kāi)展。PVS也是影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病毒之一，且分布廣泛，在世界各馬鈴薯種植區(qū)均有發(fā)生，PVS單獨(dú)侵染時(shí)可減產(chǎn)10%～15%，與其他病毒復(fù)合侵染時(shí)可造成減產(chǎn)11%～38%[24]，齊恩芳等[25]對(duì)甘肅省馬鈴薯主要病毒病發(fā)生情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PVS發(fā)生比例最高，且易和其他病毒混合侵染。該病毒不易覺(jué)察，主要靠接觸傳毒，通過(guò)熱處理及莖尖脫毒技術(shù)較難脫除干凈，因此，也應(yīng)加強(qiáng)針對(duì)PVS抗性的品種改良。

本研究將含PVX、PVY、PLRV和PVS 4種病毒外殼蛋白基因片段的融合基因，通過(guò)一次轉(zhuǎn)化獲得多抗轉(zhuǎn)基因植株，可大大提高育種效率，對(duì)馬鈴薯的多基因轉(zhuǎn)化可行性及馬鈴薯的抗病毒的研究具有重要的意義。

‘隴薯3號(hào)’是甘肅省生產(chǎn)主栽品種，且易受病毒感染，所以選為供試品種。因馬鈴薯是無(wú)性繁殖植物，轉(zhuǎn)基因植株無(wú)性后代不發(fā)生分離，給轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)、鑒定帶來(lái)諸多方便。從試驗(yàn)結(jié)果分析來(lái)看，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究中，分子檢測(cè)證明融合基因已整合到‘隴薯3號(hào)’馬鈴薯基因組中，并在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抗病性鑒定結(jié)果也反映了某些轉(zhuǎn)基因植株對(duì)4種病毒均具有抗性。

本試驗(yàn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附鑒定法（DAS-ELISA）檢測(cè)病毒含量，用ELISA讀數(shù)所顯示的病毒滴度來(lái)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)病毒的抗性，轉(zhuǎn)pART27-XSYV-rh株系中，S3-13、S3-14的4種病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，雖然PVY、PVS、PLRV的檢測(cè)數(shù)值高于陰性對(duì)照，但對(duì)4種病毒均具有抗性；S3-15的PVS、PVX和PVY檢測(cè)結(jié)果為陰性，PLRV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但檢測(cè)數(shù)值也低于陽(yáng)性對(duì)照，造成PLRV為陽(yáng)性的原因也可能與接種病毒方法有關(guān)，PLRV采用蚜蟲(chóng)傳毒，有一定的隨機(jī)性。試驗(yàn)結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)4價(jià)CP基因株系的抗性程度不同，因此有必要篩選抗性株系。引起抗性差異的原因可能和轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)外源基因水平有關(guān)，也可能和病毒在植株體內(nèi)增殖條件和癥狀發(fā)育條件不同有關(guān)。后續(xù)研究中將對(duì)抗病植株抗病性與目的基因RNA的累積關(guān)系開(kāi)展進(jìn)一步研究，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的表型、癥狀發(fā)育、田間表現(xiàn)、品質(zhì)及產(chǎn)量也進(jìn)行鑒定和分析，最終篩選出對(duì)4種病毒同時(shí)具有抗性的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯新種質(zhì)，從而為馬鈴薯抗病育種工程提供良好的親本材料。