李萌 姜恭好 段海燕

摘 要 基因編輯是一種新興的比較精確的能對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)或過程。總結(jié)了近年基因編輯技術(shù)在提升水稻育種速度和效率、實(shí)現(xiàn)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)、載體構(gòu)建和突變體創(chuàng)制、水稻抗病目標(biāo)改變、水稻品質(zhì)提升等遺傳改良方面的應(yīng)用進(jìn)展。簡(jiǎn)要介紹了一代ZFNs基因編輯技術(shù)、二代TALENs基因編輯技術(shù)和三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，重點(diǎn)介紹了CRISPR/Cas9的工作原理、優(yōu)缺點(diǎn)、類型和相關(guān)技術(shù)。最后對(duì)基因編輯技術(shù)在水稻遺傳改良方面的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 基因編輯;CRISPR/Cas9;水稻;遺傳改良;應(yīng)用進(jìn)展

中圖分類號(hào)：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.34.002

基因編輯，又稱基因組編輯或基因組工程，是一種新興的比較精確的能對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)或過程?；蚓庉嫾夹g(shù)通過插入和敲除基因、定點(diǎn)突變和堿基替換等對(duì)基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行一系列的人工修飾，以獲得新的功能或表型，甚至創(chuàng)造新的物種，在基因研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力，尤其是在植物遺傳改良和新品種培育方面應(yīng)用十分廣泛。

1? 基因編輯技術(shù)在水稻遺傳改良中的應(yīng)用進(jìn)展

1.1? 提升水稻育種速度和效率

近年將基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)不斷應(yīng)用于水稻，用來深入研究水稻基因功能和精準(zhǔn)培育水稻品種，而傳統(tǒng)基因組編輯技術(shù)只可對(duì)水稻基因片段隨機(jī)刪除或插入，精準(zhǔn)插入效率不高。Yuming Lu等用硫代修飾和磷酸化修飾供體片段，成功提升敲入靶向的效率，對(duì)約1 400株植株進(jìn)行編輯，成功效率平均值為25%，高者可達(dá)47%;此方法還能夠在4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靶向敲入，改進(jìn)該方法得到重復(fù)片段介導(dǎo)的同源重組方法，能夠精準(zhǔn)有效融合原位標(biāo)簽蛋白并實(shí)現(xiàn)片段的替換，該效率約為11%[1]。覃玉芬等通過CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)編輯水稻品種GXU41中TMS5的兩個(gè)靶點(diǎn)位，獲得純合突變的T0代陽性植株，并在T1代獲得到無外源標(biāo)記的植株[2]。由此證明該技術(shù)能夠提升獲得TGMS系的效率。Yusong Lv等同樣利用該技術(shù)基因編輯定點(diǎn)突變OsPAO5，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域存在天然SNP能夠介導(dǎo)水稻中胚軸性狀的馴化，在提升水稻出苗速率的同時(shí)，為后續(xù)耐直播水稻品種分子育種研究提供重要數(shù)據(jù)支撐[3]。

1.2? 實(shí)現(xiàn)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)

季新等根據(jù)CRISPR這項(xiàng)技術(shù)的基本原理，對(duì)水稻光敏色素互作因子OSPIL15的CRISPR表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建，創(chuàng)制OS0ZI5突變體并研究其對(duì)光信號(hào)調(diào)控的作用，將所獲得的10種OS0ZI5突變體與野生型進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)突變型的粒長(zhǎng)明顯變長(zhǎng)，株高明顯變矮，實(shí)驗(yàn)表明該技術(shù)能夠證明光信號(hào)對(duì)其突變體生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用[4]。楊柳等通過該技術(shù)及反向遺傳學(xué)方法，針對(duì)OsMADS56基因設(shè)計(jì)特異性敲除靶位點(diǎn)，并構(gòu)建該基因敲除載體，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得野生粳稻9522背景的轉(zhuǎn)基因苗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明9株OsMADS56轉(zhuǎn)基因苗具有3種純合突變類型，對(duì)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)3種類型突變都能夠造成移碼突變和蛋白翻譯提前終止，引起保守結(jié)構(gòu)域的缺失。因此判斷水稻OsMADS56與擬南芥SOC1功能保守，能夠調(diào)控水稻的花發(fā)育及開花時(shí)間[5]。賈辰昊等設(shè)計(jì)1對(duì)sgRNA序列并運(yùn)用自然降溫以獲得雙鏈sgRNA，并運(yùn)用T4連接酶的作用與載體pHSN401相連，進(jìn)行菌落PCR測(cè)序后，將成功構(gòu)建的CRISPR基因編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，獲得水稻OsSAUR23基因的基因編輯突變體材料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CRISPR/Cas9技術(shù)作用下的OsSAUR23基因在生長(zhǎng)素響應(yīng)信號(hào)通路中扮演重要角色[6]。楊平等運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻W(wǎng)x、Badh2基因進(jìn)行編輯，從而獲得能夠穩(wěn)定遺傳且直鏈淀粉含量較低的突變體，使此類稻米更受青睞，同時(shí)這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也為后續(xù)進(jìn)一步開展稻米品質(zhì)研究提供參考依據(jù)[7]。

1.3? 實(shí)現(xiàn)載體構(gòu)建和突變體創(chuàng)制

陳強(qiáng)等首先將水稻的多胚基因OsPE運(yùn)用基因編輯技術(shù)進(jìn)行載體構(gòu)建，將模板OsU6a進(jìn)行兩次PCR，成功構(gòu)建表達(dá)盒，通過T4連接酶將表達(dá)盒連接至載體中，通過PCR反應(yīng)、酶切和測(cè)序后，得到pYLCRISPR/Cas9-gRNA的多胚基因載體，為深入研究多胚基因提供參考[8]。

王荃等研究發(fā)現(xiàn)DUFs蛋白對(duì)生物成長(zhǎng)有很大作用，運(yùn)用基因編輯技術(shù)構(gòu)建OsDUF393的載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將待轉(zhuǎn)化品種中花11進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得T0代水稻植株100株，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在堿基的變化，實(shí)驗(yàn)創(chuàng)制了基因突變體，并表明通過基因編輯技術(shù)確實(shí)使得OsDUF393基因得到了定向編輯效果[9]。同樣運(yùn)用該技術(shù)，惠索禎等將粳稻品種沈農(nóng)265作為赤霉素2氧化酶基因OsGA2oxlO進(jìn)行基因編輯的遺傳背景，將獲得的突變體進(jìn)行PCR后發(fā)現(xiàn)突變體基因的表達(dá)量相對(duì)于野生型表現(xiàn)出很明顯的下降趨勢(shì)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)基因在水稻幼穗部的表達(dá)程度相較于在葉鞘、根部、莖葉的表達(dá)程度不同。實(shí)驗(yàn)明確了該基因的功能，表明基因編輯技術(shù)確實(shí)能夠調(diào)控GA2oxl0基因功能[10]。

為研究生長(zhǎng)素對(duì)水稻生長(zhǎng)的參與過程，王道洋等運(yùn)用基因編輯技術(shù)對(duì)OsARF8靶點(diǎn)位進(jìn)行設(shè)計(jì)并對(duì)其進(jìn)行敲除。首先構(gòu)建載體，然后運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻品種9522進(jìn)行轉(zhuǎn)入，隨后篩選得到28株轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步對(duì)OsARF8鑒定得到6株在外顯子174的區(qū)域內(nèi)發(fā)生了堿基的缺失，而對(duì)堿基突變深入探究得到第7個(gè)氨基酸發(fā)生變化，進(jìn)而使得亮氨酸變化成為色氨酸，由該處及以后的氨基酸序列均發(fā)生移碼的突變，發(fā)現(xiàn)在第123的氨基酸發(fā)生提前終止，由此證明此突變體中的DBD功能域無法全部表達(dá)，ARF8蛋白的功能也同時(shí)受到影響[11]。本實(shí)驗(yàn)證明運(yùn)用基因標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)⑺净騉sARF8敲除，為后續(xù)研究提供范本。陶英瑜等研究發(fā)現(xiàn)水稻種子的發(fā)芽率對(duì)直播影響較大，ABI5的含量下降會(huì)使種子萌發(fā)速度和效率更高。通過基因編輯技術(shù)對(duì)OsABI5突變體進(jìn)行構(gòu)建，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將所構(gòu)建的OsABI5敲除質(zhì)粒導(dǎo)入愈傷組織，得到osabi5-2突變體，觀察后得出運(yùn)用基因編輯技術(shù)確實(shí)能夠?qū)λ痉N子萌發(fā)加以調(diào)控[12]。

1.4? 實(shí)現(xiàn)水稻抗病目標(biāo)改變

楊海河等使用CRISPR/Cas9技術(shù)為患稻瘟病水稻的Pi21基因進(jìn)行針對(duì)性地定點(diǎn)突變，從而能夠得到抗稻瘟病的植株，在T0代即達(dá)到約87%的基因存在靶序列堿基的缺失?；疾≈晗蹬c抗病的株系在同樣接種病菌情況下，表現(xiàn)出突變植株的抗性更強(qiáng)[13]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果成功獲得抗病植株，為開展稻瘟病研究提供數(shù)據(jù)支持。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)獲得具有廣譜抗病性的時(shí)間較長(zhǎng)，而運(yùn)用CRISPR技術(shù)能使水稻對(duì)抗白葉枯病的廣譜性得到提升。運(yùn)用CRISPR技術(shù)長(zhǎng)時(shí)期監(jiān)管水稻的白葉枯病獲得許多專家教授的肯定。在T2代中突變型的水稻品質(zhì)表現(xiàn)出蠟質(zhì)狀，并且直鏈淀粉含量呈大幅度降低，約降低為2%左右。實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了白葉枯病的廣譜抗病性，也體現(xiàn)出運(yùn)用CRISPR技術(shù)確實(shí)能夠在對(duì)Wx基因進(jìn)行編輯后達(dá)到糯性品質(zhì)的改良效果。

1.5? 實(shí)現(xiàn)水稻品質(zhì)提升

隨著生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)水稻口感等品質(zhì)方面的需求標(biāo)準(zhǔn)逐漸提升，香糯口感和長(zhǎng)粒更符合市場(chǎng)需求。直鏈淀粉含量是一種研究判斷水稻稻米品質(zhì)的理化指標(biāo)，而新的基因編輯技術(shù)使得快速高質(zhì)量達(dá)到該目標(biāo)成為可能，能夠?qū)⒍喾N品質(zhì)性狀同時(shí)加以改良，將控制水稻口感粒長(zhǎng)的直鏈淀粉含量調(diào)控到適合的程度。

周鑫等運(yùn)用CRISPR技術(shù)對(duì)Wx基因進(jìn)行分析以獲得優(yōu)質(zhì)糯稻，將靶點(diǎn)位分別設(shè)置在該基因的7、8、11、12、2和10外顯子的區(qū)域內(nèi)，用基因編輯技術(shù)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建，并運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將設(shè)計(jì)好的載體導(dǎo)入至準(zhǔn)備好的水稻品種中，獲得多株再生基因的植株。進(jìn)一步分析表明，突變率整體走低，多數(shù)為小于30%，都位于2、11、7外顯子區(qū)域內(nèi)部，多數(shù)小于2 bp的缺失或者插入，并且大多是純合基因型或者是雙等位的突變[14]。該研究發(fā)現(xiàn)在糯稻的新品種培育時(shí)，應(yīng)多培育突變體并篩選合適的靶點(diǎn)位，以期達(dá)到糯性水稻標(biāo)準(zhǔn)。

東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)Wx基因的不同靶點(diǎn)位分別設(shè)計(jì)PBE-TS2、1、3載體，將其導(dǎo)入至目標(biāo)水稻品種，突變型表現(xiàn)出其直鏈淀粉含量均有小幅度降低，TS2尤為明顯，下降幅度約為4%，且水稻收獲后保持為透明狀態(tài)[15]。同樣的方法，對(duì)黑龍江省內(nèi)水稻種植比例最大的品種進(jìn)行基因編輯后發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量的下降幅度與前面實(shí)驗(yàn)保持一致。

Yongjie Kuang等培育出能夠抑制雜草生長(zhǎng)的水稻品種[16]。王海明等利用水稻基因NRR是調(diào)控根系生長(zhǎng)的多效基因，同樣運(yùn)用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因敲除，發(fā)現(xiàn)被敲除后的植株根系鮮重比野生型的植株更重[17]。

2? 基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

2.1? 前兩代基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)通過插入和敲除基因、定點(diǎn)突變和堿基替換等對(duì)基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行一系列的人工修飾，包括了先后發(fā)展的三代技術(shù)，分別為一代的ZFNs基因編輯技術(shù)、二代的TALENs基因編輯技術(shù)和三代的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。三者原理和方式存在差異，但同樣需要人工進(jìn)行改造的序列特異性核酸內(nèi)切酶的支持，在相應(yīng)的目標(biāo)基因組位置進(jìn)行DNA切割并引發(fā)雙鏈的斷裂。

ZFNs是基因編輯歷史上的第一代技術(shù)[18]，是多種蛋白質(zhì)中普遍存在的蛋白基序，通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)、核酸、小分子及其他蛋白質(zhì)發(fā)揮特異相互作用。運(yùn)用ZFNs技術(shù)能夠進(jìn)行基因敲除或者將目標(biāo)基因?qū)耄钄嗷虻募せ?，使基因序列得到改造。同時(shí)ZFNs存在一些不足之處，如ZFNs在每次對(duì)DNA片段進(jìn)行剪切時(shí)無法充分依靠同源二聚體的形成，存在異源二聚體，極可能會(huì)造成脫靶效應(yīng)，使得DNA序列發(fā)生改變或者出現(xiàn)錯(cuò)配的情況，甚至產(chǎn)生較強(qiáng)細(xì)胞毒性和導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。引外，ZFNs對(duì)DNA的特異性識(shí)別度較低，篩選出能夠成功構(gòu)建特異性且切割速度較高的ZFNs基因編輯技術(shù)無疑需要投入大量成本。

TALENs是基因編輯歷史上的第二代技術(shù)，由TAL效應(yīng)因子的DBD及FokI核酸內(nèi)切酶的DNA切割出來的結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu)成。其中TALEN又由3部分構(gòu)成，分別為核定位信號(hào)的N端結(jié)構(gòu)域、能夠較為準(zhǔn)確識(shí)別特定DNA序列的串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域及具有Fokl核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域。該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是TALENs的TAL效應(yīng)物為串聯(lián)重復(fù)的識(shí)別堿基單元，較低的脫靶概率和較高的特異性、較為簡(jiǎn)單的載體構(gòu)建方式和較低的成本，使得該技術(shù)更受青睞。

2.2? 第三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

2.2.1? 技術(shù)原理

CRISPR/Cas是一種適應(yīng)性的免疫系統(tǒng)。追溯發(fā)現(xiàn)其存在于古細(xì)菌和原核生物細(xì)菌中，通過自身進(jìn)化來抵抗入侵DNA和病毒。該系統(tǒng)能夠?qū)ν庠碊NA進(jìn)行識(shí)別、特異性切割，同時(shí)能夠沉默外源基因表達(dá)。該系統(tǒng)由CRISPR序列元件及Cas基因家族蛋白兩部分構(gòu)成。構(gòu)成CRISPR序列元件的是高度保守的重復(fù)序列、位于重復(fù)上游的引導(dǎo)序列及間隔序列相間排列。位于相同位點(diǎn)的重復(fù)序列高度保守，而具有較高多樣性的是位于不同位點(diǎn)間的重復(fù)序列。CRISPR位點(diǎn)附近存在著具有內(nèi)切酶活性和核酸酶的Cas基因家族蛋白酶，使得DNA系列特異性得以修復(fù)。

通過轉(zhuǎn)錄加工成的crRNA和反式激活tracrRNA共同形成雙元復(fù)合體結(jié)構(gòu)sgRNA，進(jìn)而由sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白酶的HNH，與crRNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)的模板鏈可以被特異性地識(shí)別并實(shí)現(xiàn)切割;RuvC作用于切割第二條鏈特定位點(diǎn)，并通過體內(nèi)NHEJ修復(fù)機(jī)制使得基因突變得以引入。對(duì)此我們可以進(jìn)行不同sgRNA的設(shè)計(jì)，從而運(yùn)用CRISPR/Cas9對(duì)不同的DNA堿基序列進(jìn)行剪切獲得新的突變體。

2.2.2? 優(yōu)缺點(diǎn)

CRISPR/Cas9第三代基因編輯技術(shù)是新興的定點(diǎn)基因編輯工具。CRISPR/Cas9技術(shù)通過對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行編輯從而完成作物的遺傳基因改良，利用短RNA和核酸酶對(duì)特定靶標(biāo)基因進(jìn)行突變，并對(duì)無外源基因整合的編輯材料進(jìn)行篩選，在保證不會(huì)影響基因組的其他位點(diǎn)前提下，實(shí)現(xiàn)DNA修復(fù)系統(tǒng)對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行精確突變。CRISPR技術(shù)因使用簡(jiǎn)便且效率更高的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水稻和高粱等糧食作物的基因組編輯工作中，同時(shí)運(yùn)用在對(duì)人類及動(dòng)物細(xì)胞等多種生物進(jìn)行定點(diǎn)修飾中，并且該技術(shù)能夠避免傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因所導(dǎo)致的安全問題。但CRISPR/Cas9技術(shù)存在小概率的脫靶現(xiàn)象，從而引起基因組非靶向位點(diǎn)的突變影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如何實(shí)現(xiàn)運(yùn)用HDR修復(fù)途徑提高對(duì)基因編輯的效率、實(shí)現(xiàn)大片段插入和堿基替換仍需進(jìn)一步研究。

2.2.3? 主要類型

目前已發(fā)現(xiàn)三種類型的10個(gè)亞種系統(tǒng)。Ⅰ型存在于古生菌的大腸桿菌等細(xì)菌和銅綠假單胞菌中，包含Cas2、Cas3、Cas5、Cas6、Cas7等亞型。Ⅱ型僅存于嗜熱鏈球菌等細(xì)菌基因組，包含Casl、Cas2、Cas9等亞型。Ⅲ型存在于激烈火球菌等古生菌，包含Casl、Cas2、Cas6等亞型。Ⅰ型和Ⅱ型的靶標(biāo)類型均為DNA，Ⅲ型的靶標(biāo)類型為DNA或RNA。

2.2.4? 相關(guān)技術(shù)

發(fā)展基因編輯技術(shù)，也需同時(shí)發(fā)展相應(yīng)的檢測(cè)方式。焦磷酸測(cè)序是ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶及熒光素酶等4種酶參與化學(xué)反應(yīng)的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，免除需要通過熒光標(biāo)記的引物和電泳檢測(cè)的方法對(duì)已知的短序列采取測(cè)序分析的環(huán)節(jié)，該技術(shù)具有快速準(zhǔn)確分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，能夠鑒別很多植物成分及其病原微生物，逐漸成為單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型和突變檢測(cè)的方式之一。解美霞等在檢測(cè)水稻PL3基因的靶向突變時(shí)采用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該技術(shù)能夠根據(jù)所檢測(cè)編輯的位點(diǎn)對(duì)編輯后的水稻及未被編輯的野生型水稻加以準(zhǔn)確區(qū)分，與以往技術(shù)相比具有更高的效率和準(zhǔn)確性，對(duì)水稻位點(diǎn)定性具有較廣闊的前景[19]。

基因編輯技術(shù)的持續(xù)快速發(fā)展為進(jìn)一步開展植物基因功能研究及作物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。已發(fā)展技術(shù)如PCR法、電泳法和測(cè)序法具有操作較復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)和成本較高等系列問題，而PARMS技術(shù)則是通過熒光檢測(cè)的方式進(jìn)行SNP的基因分型，具有前面幾種方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)?；贏RMS技術(shù)開發(fā)的SNP基因分型技術(shù)PARMS，采用1對(duì)通用熒光引物、1對(duì)等位基因特異引物和1條反向共用引物共5種引物對(duì)SNP和短Indel位點(diǎn)進(jìn)行等位基因的特異性擴(kuò)增，并采用熒光掃描進(jìn)行基因分型。律文堂等同樣利用該技術(shù)對(duì)水稻進(jìn)行基因編輯，從而能夠?qū)χ仓赀M(jìn)行基因分型，所得到的鑒定結(jié)果能夠與電泳法、測(cè)序法結(jié)果吻合，充分證明了該技術(shù)能夠?qū)λ具M(jìn)行植株編輯及對(duì)其后代進(jìn)行基因分型，同時(shí)為其他作物進(jìn)行后代編輯提供良好范本[20]。

3? 展望

CRISPR/Cas9技術(shù)為基因組定向修飾帶來新突破，但該技術(shù)研究時(shí)間尚短，仍需深入探索。應(yīng)引導(dǎo)我國(guó)從事水稻育種研發(fā)的種業(yè)公司和科研院所共同合作，引導(dǎo)CRISPR技術(shù)與常規(guī)育種方法結(jié)合，通過設(shè)計(jì)多gRNA靶向到單一基因，特異性的獲得多遺傳性狀的各種組合。目前該技術(shù)在水稻育種的應(yīng)用依賴于HNEJ途徑基因敲除，但如何更好運(yùn)用HDR實(shí)現(xiàn)大片段的插入和堿基替換依然有很大的可能性;并且該技術(shù)會(huì)有一定概率出現(xiàn)脫靶情況，引起基因組的非靶向位點(diǎn)的突變，造成研究結(jié)果不確定性。對(duì)未知領(lǐng)域應(yīng)積極探索，目前各研究運(yùn)用較為廣泛的Cas9蛋白基本都來自于Ⅱ型CRISPR技術(shù)，而Ⅰ和Ⅲ型仍有良好的發(fā)展?jié)摿?。同時(shí)，應(yīng)注意運(yùn)用該技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株是否符合法律規(guī)定，不斷提高無外源基因的水稻基因的效率和準(zhǔn)確性，對(duì)可能出現(xiàn)的不良情況加以預(yù)測(cè)并及時(shí)干預(yù)。

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（責(zé)任編輯：易? 婧）

收稿日期：2021-08-12

作者簡(jiǎn)介：李萌（1996—），女，河北承德人，黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院資源利用與植物保護(hù)專業(yè)2020級(jí)在讀碩士研究生，主要從事作物分子育種研究。E-mail： 572023305@qq.com。

*為通信作者，E-mail： 1144983024@qq.com。