劉 芳 余李強(qiáng) 聶平英 陳心銘 林少鴻 郭佳穎 林 楠

腦卒中又稱“中風(fēng)”，為全球高發(fā)病[1]。卒中后認(rèn)知功能障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是卒中后最常見表現(xiàn)之一，研究表明PSCI的總發(fā)病率高達(dá)80.97%[2]。目前，PSCI的發(fā)病機(jī)制未完全闡明，但是研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡是影響卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的一個(gè)重要因素[3]，而在分子水平上，Bcl-2家族蛋白在凋亡途徑中發(fā)揮重要作用[4]。故本研究采用大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血再灌注損傷大鼠模型，通過艾灸百會(huì)穴，觀察對(duì)MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、腦梗死體積及Bcl-2、Bax的影響，明確艾灸對(duì)PSCI的效果及潛在機(jī)制，為艾灸治療PSCI的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康SPF級(jí)雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠30只購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005]。由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一無菌環(huán)境飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，體質(zhì)量(270±20)g，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和艾灸組各10只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審批通過并嚴(yán)格按照我國相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的規(guī)定執(zhí)行。

1.2 MCAO大鼠模型制備

模型組和艾灸組大鼠采用LONGA[5]和NAGASAWA[6]等制定的改良線栓法進(jìn)行MCAO模型制備，具體步驟如下：備MCAO模型線栓(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，直徑0.38～0.40 mm，分別在距離光滑面20 mm和22 mm處用記號(hào)筆標(biāo)記，于實(shí)驗(yàn)前將線栓置于75%乙醇消毒后置于生理鹽水中備用。首先根據(jù)大鼠稱重結(jié)果，以10%水合氯醛按照3.0 mL·kg-1進(jìn)行麻醉，然后用皮筋將大鼠固定于鼠板上，充分暴露頸部，局部剪毛備皮，消毒，再沿頸部正中切開皮膚，暴露并依次分離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈主干及其分支，結(jié)扎頸外和頸總動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，然后于左側(cè)頸總動(dòng)脈的結(jié)扎處上方剪一小口，將線栓沿著頸總動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈方向輕緩?fù)迫?，推入到頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉處時(shí)松開動(dòng)脈夾，繼續(xù)輕推至顱內(nèi)，直至感到有輕微阻力且插入深度約為20 mm時(shí)不再推入，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈栓塞致腦缺血并記錄時(shí)間。腦缺血后1.5 h，將部分線栓抽出并剪斷創(chuàng)口外的部分，從而實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注，造模結(jié)束。大鼠清醒后2 h內(nèi)，根據(jù)Zea Longa法[6]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分為0～4分，共5個(gè)等級(jí)，1～3分說明MCAO造模成功，0分或者4分說明造模不成功予以剔除。假手術(shù)組大鼠僅分離其左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，不結(jié)扎也不插線。

1.3 干預(yù)方法

造模完成后第2天，艾灸組大鼠進(jìn)行艾灸干預(yù)。根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究分會(huì)制定的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”中大鼠穴位定位方法[7]，將大鼠裝入固定器中，采用自制的直徑約8 mm艾條，在大鼠“百會(huì)穴”上方2～3 cm處施溫和灸，每次30 min，每日1次，持續(xù)7 d。模型組和假手術(shù)組大鼠僅給予同等抓取及固定，不予任何干預(yù)治療。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)2個(gè)部分。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)大鼠獲取經(jīng)驗(yàn)(學(xué)習(xí))的能力，于干預(yù)后第2天至第4天進(jìn)行。每次將實(shí)驗(yàn)大鼠置于平臺(tái)10 s后，分別將其從4個(gè)象限的入水點(diǎn)面壁式放入水池，當(dāng)找到平臺(tái)后則棲身其上，如大鼠在平臺(tái)上停留時(shí)間>3 s，則認(rèn)為大鼠找到平臺(tái)，即為逃避潛伏期，如果大鼠在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則潛伏期按90 s計(jì)算。逃避潛伏期時(shí)間越短說明大鼠的學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)大鼠保存經(jīng)驗(yàn)(記憶)的能力，于干預(yù)第5天進(jìn)行。撤去平臺(tái)，將大鼠面向池壁從第一象限的入水點(diǎn)放入水中，記錄90 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。次數(shù)越多表明大鼠的記憶能力越好。

1.4.2腦梗死體積測(cè)定：干預(yù)7 d后，進(jìn)行小動(dòng)物功能核磁共振儀(functional magnetic resonance imaging，fMRI)T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging，T2WI)掃描，觀察大鼠大腦梗死體積。操作前，先將大鼠放入充滿0.3%異氟烷的密閉盒子4 min進(jìn)行麻醉，再將其俯臥位固定在fMRI掃描床上進(jìn)行定位掃描，每次掃描21層。掃描所得原始數(shù)據(jù)用Image J軟件計(jì)算腦梗死區(qū)域面積，得出腦梗死面積和全腦面積數(shù)值。占位百分比=[每層腦梗死面積×(層間距+層厚)]/[同一層全腦面積×(層間距+層厚)]×100%。

1.4.3免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)Bcl-2、Bax相關(guān)蛋白的表達(dá)：取大鼠海馬組織剪碎，用勻漿器勻漿后置于冰上，加入含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液進(jìn)行研磨至完全裂解后充分混勻，離心取上清液。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和適量BCA工作液，充分混勻。用酶標(biāo)儀測(cè)定各樣本蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本上樣量(上樣量=50 μg/蛋白濃度)。按每4 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液(4∶1)配比進(jìn)行混合，使蛋白充分變性、配膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育、浸洗等，將膜取出，平鋪于工作臺(tái)上，加ECL顯影液試劑，放入暗室中，靜置反應(yīng)1 min。運(yùn)行Bio-Rad Image軟件生物圖像分析系統(tǒng)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠存活率

本研究最終存活大鼠為假手術(shù)組10只，模型組9只，艾灸組8只。其中艾灸組大鼠1只造模當(dāng)天神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分4分且于干預(yù)第1天死亡，1只大鼠于干預(yù)第7天進(jìn)行核磁掃描不耐受麻藥死亡；模型組大鼠1只于干預(yù)第4天被同伴咬死。

2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能比較

定位航行實(shí)驗(yàn)，干預(yù)第2天模型組和艾灸組逃避潛伏期均長于假手術(shù)組；第3天和第4天艾灸組和假手術(shù)組逃避潛伏期短于模型組，見表1～3。

表1 各組大鼠干預(yù)第2天的逃避潛伏期比較 [M(QL～QU)]

空間探索實(shí)驗(yàn)，艾灸組和假手術(shù)組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)多于模型組，見表4。

表2 各組大鼠干預(yù)第3天的逃避潛伏期比較 [M(QL～QU)]

表3 各組大鼠干預(yù)第4天的逃避潛伏期比較 [M(QL～QU)]

2.3 各組大鼠腦梗死體積比較

各組大鼠行腦fMRI T2WI掃描，高信號(hào)白色區(qū)域?yàn)槿毖Ｋ啦课?；假手術(shù)組未出現(xiàn)梗死病灶；且腦組織結(jié)構(gòu)較清晰，左右對(duì)稱，腦室居中，無萎縮，灰質(zhì)和白質(zhì)均無水腫、壞死及結(jié)構(gòu)紊亂。模型組大鼠梗死灶呈彌漫性，面積較大，而艾灸組同模型組比較，腦組織水腫減輕，梗死區(qū)域呈纖維樣變，腦梗死體積總和以及百分比均小于模型組，如圖1。采用Image J軟件計(jì)算梗死體積數(shù)值，艾灸組百分比小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

(紅色箭頭指示梗死部位)

表5 各組大鼠腦梗死體積比較

2.4 各級(jí)MCAO大鼠Bcl-2、Bax比較

模型組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)Bcl-2的蛋白表達(dá)量減少，Bax蛋白濃度升高，而艾灸組Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯上升，Bax蛋白濃度降低。見圖2。假手術(shù)組Bcl-2/Bax比值最大，其次為艾灸組，最小為模型組；艾灸組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表6。

圖2 各組腦組織Bcl-2、Bax蛋白檢測(cè)結(jié)果

表6 各組Bcl-2/Bax比值結(jié)果

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腦卒中后由于瘀血閉阻、氣血運(yùn)行不暢、痰蒙清竅等均可引起認(rèn)知障礙?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，認(rèn)知功能障礙是由神經(jīng)元凋亡和代謝減少而引起的[8-9]。腦卒中特別是腦缺血后，局部缺血再灌注損傷可引起一系列復(fù)雜的病理生理過程，進(jìn)而引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與壞死，最終導(dǎo)致卒中后認(rèn)知功能障礙。艾灸百會(huì)穴是借助艾火的“溫經(jīng)通絡(luò)”作用，通過刺激腦府及督脈穴位，總督和調(diào)節(jié)人體陽脈的經(jīng)氣，以調(diào)理臟腑陰陽，使元?dú)獾貌迹裰贸?，進(jìn)而達(dá)到疏通督脈，養(yǎng)腦調(diào)神的作用?！夺樉募滓医?jīng)》謂“百會(huì)”為手足三陽經(jīng)、督脈之會(huì)，有醒腦開竅、升陽舉陷之功效，主治風(fēng)證和神志病。課題組前期通過系統(tǒng)評(píng)價(jià)及數(shù)據(jù)分析表明百會(huì)穴是治療PSCI選穴頻率最高且有效的穴位[10-11]。本研究結(jié)果說明，艾灸百會(huì)穴可明顯改善缺血性腦卒中后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；本研究采用fMRI T2WI掃描觀察大鼠左側(cè)腦梗死體積發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組未出現(xiàn)梗死病灶；艾灸組腦組織水腫減輕，梗死區(qū)域呈纖維樣變，腦梗死體積總和以及百分比均小于模型組。可見，艾灸百會(huì)穴可以促進(jìn)缺血腦組織的修復(fù)，縮小腦梗死體積，從而改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損情況，提高大鼠認(rèn)知功能。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，認(rèn)知功能障礙是由神經(jīng)元凋亡和代謝減少而引起的。Bcl-2家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)基因。Bcl-2家族包括兩類，一類對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用，如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；而另一類則對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，如Bax、Bak、Bad等。研究表明，Bcl-2 家族中抑制凋亡的基因，可以通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性穩(wěn)定線粒體，從而阻止線粒體釋放Cyt-c等凋亡相關(guān)蛋白，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；相反的，Bcl-2 家族中促進(jìn)凋亡的基因，則可以破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。Bcl-2 不僅對(duì)線粒體有調(diào)控作用，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)證明，Bcl-2 可以阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的Cyt-c釋放和Caspase-3 激活[13]。大量研究證實(shí)，Bcl-2/Bax比值在Cyt-c釋放和Caspase激活中起著關(guān)鍵作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織Bcl-2的蛋白表達(dá)量減少，Bax蛋白濃度升高，而艾灸組Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯上升，Bax蛋白濃度降低，Bcl-2/Bax提高，提示艾灸可抑制MCAO大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)大鼠神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，縮小腦梗死體積，從而改善其學(xué)習(xí)記憶功能。由此推測(cè)，艾灸干預(yù)PSCI的療效與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其抗凋亡作用可能是通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。該結(jié)論為艾灸療法輔助治療卒中后認(rèn)知功能障礙的臨床應(yīng)用提供了理論支持，但本研究僅從凋亡相關(guān)蛋白闡明艾灸百會(huì)穴對(duì)PSCI的影響，其具體是如何減少神經(jīng)元調(diào)亡，通過什么通路調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)艾灸療法可通過抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)，從而改善腦卒中后認(rèn)知功能障礙，后續(xù)可進(jìn)一步研究艾灸促進(jìn)中樞神經(jīng)修復(fù)的通路及對(duì)神經(jīng)修復(fù)微環(huán)境的影響，進(jìn)一步闡明其機(jī)制。