辛瑩，周厚妊，張月，劉慧，黃馳，劉治軍*

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院超聲科，遼寧沈陽 110004；2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016；*通訊作者 劉治軍liuzj1@sj-hospital.org

納米泡作為腫瘤診療載體是近年研究熱點，可以特異性地靶向識別腫瘤部位，在超聲介導(dǎo)納米泡破壞（ultrasound-targeted nanobubble destruction，UTND）技術(shù)下使納米泡破裂，釋放攜帶的基因，實現(xiàn)腫瘤細胞的靶向治療[1-3]。然而，外源性基因進入細胞后會被核酸酶裂解，從而喪失功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胍丁胺（agmatine，AGM）-N,N-半胱氨酸雙丙烯酰胺（N,N′-cystamine bisacrylamide，CBA）與基因凝聚得到的基因載體復(fù)合物具有較高的細胞轉(zhuǎn)染率及良好的核定位效應(yīng)[4-5]。HER2靶向載單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）基因/AGM-CBA的全氟己烷納米泡（targeted HER2 AGM-CBA andHSV-TKgene-loaded perfluorohexane nanobubble，tHAHT NB）作為HSV-TK基因/AGM-CBA的載體，通過生物素-親和素法與HER2抗體Affibody連接，并包載具備相變能力的全氟己烷。本研究以人HER2陽性人胃癌細胞NCI-N87細胞株及HER2陰性人胃癌細胞MGC803細胞株作為材料，探討tHAHT NB的體外尋靶能力及核定位效應(yīng)，以及聯(lián)合UTND技術(shù)抑制NCI-N87細胞生長活性和誘導(dǎo)其凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1,2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine，DPPC）、生物素化聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，Biotin-DSPE-PEG 2000）（西安瑞禧生物科技有限公司）；全氟己烷（perfluorohexane，PFH，上海氟科技）；生物素化的抗HER2 Affibody（Abcam）；單純皰疹病毒胸腺素激酶（HSV-TK）基因（Gama gene）；膽固醇（CH）及更昔洛韋（Sigma）；NCI-N87細胞株、MGC803細胞株（中國科學(xué)院細胞庫）；Annexin V、FITC凋亡檢測試劑盒（東仁化學(xué)科技有限公司）；MTT（大連美侖生物科技有限公司）。

1.1.2 儀器 聚碳酸酯膜擠出器（LiposoFast，AVESTIN）；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；低功率聚焦超聲實驗裝置（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所）；流式細胞儀（FACS Calibur，BD）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon）；多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 納米泡的制備

1.2.1 基因載體復(fù)合物的制備 本課題組前期采用AGM和CBA通過Michael加成法合成非病毒載體AGM-CBA[4]。以1∶9將AGM-CBA與HSV-TK質(zhì)粒于37℃孵箱中孵育30 min，得到基因載體復(fù)合物。

1.2.2 納米泡的制備 采用薄膜水化法。將8.8 mg DPPC、3.0 mg CH和2.8 mg Biotin-DSPE-PEG 2000溶于無水乙醇中，在45℃、120 r/min下，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸15 min，得到均勻的脂質(zhì)膜。將2 ml PBS溶液緩慢加入含有脂質(zhì)膜的瓶中，37℃、130 r/min水化15 min，得到脂質(zhì)體懸液。加入80 μl PFH，在冰浴條件下采用聲振儀振蕩后，離心清洗，經(jīng)1 μm和400 nm聚碳酸酯膜擠出得到空白納米泡（perfluorohexane nanobubble，NB）。通過生物素-親和素法連接抗HER2分子Affibody，離心清洗后得到HER2靶向空白納米泡（targeted HER2 perfluorohexane nanobubble，tHER2 NB）。將制備的基因載體復(fù)合物溶于2 ml PBS溶液，加入含有脂質(zhì)膜的西林瓶后同上述進行水化、清洗、擠出、連靶，得到HER2靶向載HSV-TK基因/AGM-CBA 的全氟己烷納米泡（targeted HER2 AGM-CBA andHSV-TKgene-loaded perfluorohexane nanobubble，tHAHT NB）。

1.3 細胞培養(yǎng)

1.3.1 細胞培養(yǎng) NCI-N87細胞接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，MGC803細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，傳代周期為3 d。

1.3.2 無低頻超聲輻照細胞轉(zhuǎn)染 將細胞以5×104個/孔接種于12孔板及共聚焦培養(yǎng)皿，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，過夜后棄去培養(yǎng)液，加入900 μl培養(yǎng)液及100 μl納米泡，對胃癌細胞進行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 低頻超聲輻照下細胞轉(zhuǎn)染 胃癌細胞轉(zhuǎn)染后，經(jīng)體外超聲輻照（頻率650 kHz，強度1.5 W/cm，連續(xù)輻照30 s），4 h后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育。觀察細胞活性及誘導(dǎo)凋亡作用時，按上述超聲處理24 h后加入200 μg/ml更昔洛韋（ganciclovir，GCV）100 μl，繼續(xù)孵育。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的體外尋靶能力 利用DiI染色的tHAHT NB檢測其體外尋靶能力。將實驗分為NCI-N87組、MGC803組。按步驟1.3.2操作，孵育45 min后用4%多聚甲醛溶液固定，在激光共聚焦顯微鏡下對比觀察納米泡與NCI-N87細胞和MGC803細胞的靶向結(jié)合情況。采用ImageJ軟件對細胞熒光進行半定量化，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。校正后累計光密度（IntDen）=（面積×平均灰度值）－（待測細胞面積×背景平均光密度）。

1.5 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位效應(yīng) 利用DiI染色的HSV-TK基因驗證tHAHT NB在NCI-N87細胞中的核定位效應(yīng)。按步驟1.3.3操作，孵育48 h后，PBS清洗3遍，用4%多聚甲醛溶液固定，棄去多聚甲醛，PBS清洗3遍，加入1 ml含10 μl Hochest的PBS，避光進行細胞核染色10 min，用PBS清洗3遍，使用激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞核定位情況。

1.6 細胞活性及凋亡情況

1.6.1 MTT法檢測不同處理組內(nèi)NCI-N87細胞活性實驗分組為tHAHT NB+低頻超聲輻照組（tHAHT NB+US）、tHAHT NB組、tHER2 NB組、空白全氟己烷納米泡組（NB）、低頻超聲輻照組（US）、正常細胞組及空白組（不接種細胞，僅添加培養(yǎng)液），取對數(shù)生長期的NCI-N87細胞以104個/孔接種于96孔板內(nèi)，各組經(jīng)處理后，每孔加入20 μl MTT，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后棄去溶液，每孔加入150 μl DMSO，經(jīng)旋渦振蕩器振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（OD）值，根據(jù)公式（1）計算細胞活性。

1.6.2 流式細胞術(shù)檢測不同處理組內(nèi)NCI-N87細胞凋亡情況 實驗分組及處理同MTT法，經(jīng)胰酶消化后取細胞懸液1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入PBS溶液重懸細胞并洗滌3次，加入Annexin V結(jié)合液制成濃度為106個/ml的細胞懸液，取100 μl細胞懸液加入5 μl Annexin V，F(xiàn)ITC結(jié)合物和5 μl PI溶液，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入400 μl Annexin V結(jié)合液，置入流式細胞儀進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.3.0軟件，細胞活性及細胞凋亡率以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Sidak檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 tHAHT NB與胃癌細胞的靶向結(jié)合情況 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB與NCI-N87細胞及MGC803細胞結(jié)合情況，NCI-N87細胞周圍可見大量紅色熒光，MGC803細胞周圍僅見少許紅色熒光（DiI標(biāo)記的納米泡為紅色）（圖1A、B）。半定量分析結(jié)果顯示，與MGC803組相比，NCI-N87組累計熒光密度顯著增高（校正后IntDen=-0.24、1272.75），并且與細胞數(shù)目呈正相關(guān)（r=0.900，P＜0.01；圖1C），表明tHAHT NB具有良好的靶向能力。

圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB與胃癌細胞體外尋靶實驗及細胞熒光半定量分析。MGC803組細胞周圍僅見少許紅色熒光（DiI染色，×200，A）；NCI-N87組細胞周圍可見大量紅色熒光（DiI染色，×200，B）；細胞熒光半定量分析示NCI-N87組校正后累計熒光密度與細胞數(shù)目呈正相關(guān)（C）

2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位效應(yīng) 通過激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位情況發(fā)現(xiàn)，NCI-N87細胞的細胞核（藍色熒光）周圍有明顯的紅色熒光，且多聚集在細胞質(zhì)及細胞核周圍（圖2）。

2.3 細胞增殖活性及凋亡情況 采用MTT法檢測細胞活性，Annexin V流式細胞儀檢測細胞凋亡率（圖3，表1），各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=139.2，P＜0.01）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NB組與US組、tHER2 NB組與US組、NB組與tHER2 NB組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.70、2.16、0.46，P＞0.05）；與tHAHT NB組、tHER2 NB組、US組及NB組相比，tHAHT NB+US組細胞活性明顯減低，細胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（MTT：t=11.48、18.09、18.55、20.25，P＜0.01；Annexin V：t=18.00、25.74、25.53、23.23，P＜0.01）。

圖2 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位效應(yīng)。細胞核染色顯示為藍色熒光（Hochest染色，×200，A）；HSV-TK基因染色顯示為紅色熒光（DiI染色，×200，B）；C為A和B的合并

圖3 細胞凋亡及細胞活性檢測。A～E分別為Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測tHAHT NB+US、tHAHT NB、tHER2 NB、NB、US組細胞凋亡情況；F為MTT法檢測不同處理組的細胞活性

表1 不同處理組對NCI-N87細胞活性及誘導(dǎo)凋亡的影響（±s，%）

表1 不同處理組對NCI-N87細胞活性及誘導(dǎo)凋亡的影響（±s，%）

注：與NB組比較，*P＜0.01，與tHAHT NB+US組比較，#P＜0.01

組別細胞活性細胞凋亡率tHAHT NB+US組 35.97±4.01* 54.3±3.5*tHAHT NB組20.7±3.1*#tHER2組 90.69±3.44# 6.2±0.7#70.70±8.00#NB組6.6±1.0#US組 97.21±2.04# 3.6±1.5#92.07±4.27#

3 討論

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時已是晚期，尋找一種新的非侵入性治療方法具有重要意義[6-7]。自殺基因療法是目前腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點，其中HSV-TK基因/GCV系統(tǒng)較為成熟，HSV-TK基因表達后可將GCV代謝為丙氧鳥苷三磷酸形式，抑制DNA聚合酶或合并到新生DNA鏈中，終止DNA的復(fù)制，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[8-9]。HSV-TK/GCV系統(tǒng)具備兩種“旁觀者腫瘤細胞殺傷”機制：①局部“直接”旁觀者效應(yīng)，經(jīng)縫隙連接轉(zhuǎn)移至未轉(zhuǎn)染的鄰近腫瘤細胞；②非局部全身免疫介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)，在殺死表達HSV-TK的腫瘤細胞后，體內(nèi)免疫狀態(tài)被激活，刺激細胞表面表達腫瘤特異性或相關(guān)抗原[10]。

缺乏安全高效的基因輸送系統(tǒng)是“自殺”基因治療的一大障礙[11]。納米泡作為腫瘤診療載體可以靶向識別腫瘤部位[12-13]，在UTND技術(shù)的空化作用及聲孔作用下可使外殼破裂，釋放基因及藥物，并增加血管內(nèi)皮間隙和細胞膜通透性，從而彌補由于腫瘤異質(zhì)性及增強滲透和保留（the enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)高度可變性引起的藥物及基因傳遞效率較低[14-15]。外源性基因進入細胞后，被核酸酶裂解而喪失功效，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，含胍基的可再生聚氨基胺類陽離子聚合物AGM-CBA可以凝聚和壓縮質(zhì)粒DNA，保護其不被核酸酶降解，并在胍基的作用下促進細胞攝取和核定位效應(yīng)，從而提高細胞轉(zhuǎn)染效率[16-17]。

本研究通過激光共聚焦顯微鏡和半定量分析發(fā)現(xiàn)，與MGC803細胞相比，NCI-N87細胞周圍可見大量紅色熒光，累計熒光密度顯著增高，并與細胞數(shù)目呈正相關(guān)，表明經(jīng)生物素-親和素法與HER2抗體Affibody連接的tHAHT NB具備靶向性，能夠特異性地識別并結(jié)合NCI-N87細胞。經(jīng)UTND技術(shù)處理后，HSV-TK基因多聚集于NCI-N87細胞的胞質(zhì)及細胞核周圍，表明tHAHT NB具備核定位效應(yīng)。MTT及Annexin V檢測發(fā)現(xiàn)，單純tHER2 NB、NB及US對細胞活性的影響及誘導(dǎo)凋亡的作用不顯著；tHAHT NB和tHAHT NB+US明顯減低了細胞增殖活性，并提高了細胞凋亡率；且tHAHT NB+US組較tHAHT NB組細胞活性顯著減低，細胞凋亡率明顯增高，表明UTND技術(shù)增強了tHAHT NB對細胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的能力，其可能的機制為：①tHAHT NB在超聲輻照下通過空化效應(yīng)使外殼坍塌，釋放HSV-TK基因/AGM-CBA；②在穩(wěn)定空化作用下tHAHT NB規(guī)律性機械擾動，改變細胞膜電位促進內(nèi)吞作用；③在穩(wěn)定空化變?yōu)閼T性空化時，血管內(nèi)皮細胞遭到破壞，擴散能力增強；④在慣性空化作用下細胞產(chǎn)生瞬態(tài)孔隙，促進細胞內(nèi)大分子的攝取。

本研究表明，載HSV-TK基因的tHAHT NB聯(lián)合UTND技術(shù)能夠有效地抑制NCI-N87細胞的增殖活性，誘導(dǎo)細胞凋亡，但是未能深入研究UTND技術(shù)對促進基因轉(zhuǎn)染的機制，課題組將進一步研究UTND技術(shù)促進基因轉(zhuǎn)染的機制，并探討其是否會影響HSV-TK/GCV系統(tǒng)“旁觀者腫瘤細胞殺傷”機制。

總之，HER2靶向載HSV-TK基因/ACM-CBA的全氟己烷納米泡可以特異性地靶向識別NCI-N87細胞，并具備核定位效應(yīng)，聯(lián)合UTND技術(shù)能夠有效地抑制NCI-N87細胞的增殖活性，顯著提高誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。