朱成磊 楊克彬 徐秀榮 馬 霜,2 李曉佩 高志民

(1.國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所 國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室 北京 100102； 2.西南科技大學(xué) 綿陽 621010)

水是植物細(xì)胞維持正常的生理功能不可缺少的組成部分，而水分子的跨膜轉(zhuǎn)運主要通過水通道蛋白(aquaporins, AQPs)來完成的。嵌于生物膜上的水通道通常由4個功能獨立的AQPs構(gòu)成的四聚體組成(de Grootetal., 2001)，植物通過水通道快速調(diào)節(jié)水分平衡來適應(yīng)外界環(huán)境的變化(Johansonetal., 2001)。植物中根據(jù)AQPs在細(xì)胞中的位置及結(jié)構(gòu)將其分成5個亞家族(PIPs、TIPs、NIPs、SIPs和XIPs)(Danielsonetal., 2008)，其中膜內(nèi)在水通道蛋白(nodulin 26-like intrinsic aquaporin proteins, NIPs)最初在大豆(Glycinemax)中發(fā)現(xiàn)，被定義為類NOD26膜內(nèi)在水通道蛋白(Fortinetal., 1987)。隨后發(fā)現(xiàn)植物中NIPs普遍存在，主要在細(xì)胞膜上行使水分子和一些小分子物質(zhì)的運輸功能，在保護植物免受外界環(huán)境傷害方面發(fā)揮著重要作用。例如，AtNIP2;1主要在擬南芥(Arabidopsisthaliana)成熟根的維管組織和根尖中表達，參與根系營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和根尖的發(fā)育(Choietal., 2007)；AtNIP7;1參與砷的吸收與轉(zhuǎn)運(Isayenkovetal., 2008)；AtNIP5;1參與硼的運輸(Gómez-Sotoetal., 2019)。有研究表明，NIP基因在鹽和其他金屬離子等逆境脅迫中均扮演著重要角色(Wangetal., 2017; Zhuetal., 2019)。定位在細(xì)胞膜上的水稻(Oryzasativa)OsNIP2;1(Zhaoetal., 2010)、大麥(Hordeumvulgare)HvNIP2;1(Schnurbuschetal., 2010)分別具有運輸硅和硼穿過細(xì)胞膜的功能，而硅和硼在應(yīng)對各種脅迫保護植物方面具有重要作用。

毛竹(Phllostachysedulis)是我國最重要的竹種之一，現(xiàn)有林地面積467.78萬hm2，占全國竹林面積的72.96%(李玉敏等，2019)。低溫和干旱是影響毛竹生長和分布的主要環(huán)境限制因子，如自然低溫脅迫條件下，1年生、2年生毛竹和成竹的半致死溫度依次降低，且與1月下旬葉片中可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，與12月上旬葉片中MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)(應(yīng)葉青等，2011)。模擬干旱條件下對毛竹葉片的研究表明，水勢驅(qū)動不同竹齡個體之間水分輸送的方向，使毛竹適應(yīng)干旱脅迫環(huán)境(曹永慧等，2018)。研究表明，DREB、NAC、WRKY等多種轉(zhuǎn)錄因子(Wuetal., 2015; Wangetal., 2016; Lietal., 2017)，以及LEA、PeUGE、ZEP等多種結(jié)構(gòu)基因(Huangetal., 2016; Sunetal., 2016; Louetal., 2017)參與了毛竹對低溫和干旱等脅迫的應(yīng)答。過量表達毛竹水通道蛋白基因PeTIP4;1-1能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱能力(Sunetal., 2017)，然而對于毛竹NIP基因卻知之甚少。本研究在全面分析毛竹NIP家族成員的基礎(chǔ)上，采用實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)分析毛竹NIP基因在干旱和溫度脅迫條件下表達模式，以期為深入研究毛竹NIP基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛竹NIP基因查找及理化性質(zhì)分析

以模式物種水稻和擬南芥的NIP基因為種子序列，利用TBtools軟件(Chenetal., 2020)基于毛竹第2版本基因組數(shù)據(jù)(Zhaoetal., 2018)進行同源序列查找。運用BLASN和BLASTX對所獲得序列進行比對分析，閾值E<10-20,并對獲得的序列用SMART在線軟件進行保守結(jié)構(gòu)域分析，保留具有完整NIP基因保守結(jié)構(gòu)域的序列。最終獲得毛竹NIP基因成員，并根據(jù)它們與水稻的親緣關(guān)系進行命名。用在線軟件ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)對毛竹NIP基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析。

1.2 毛竹NIP基因生物信息學(xué)分析

運用TBtools軟件以及毛竹第2版本基因組數(shù)據(jù)對毛竹NIP基因的基因結(jié)構(gòu)進行分析；使用在線軟件MEME(http:∥meme.nbcr.-net/meme/intro.html)對毛竹NIP氨基酸保守基序進行分析，利用DNAMAN 8.0將毛竹NIP氨基酸序列與擬南芥AtNIP1-1和水稻OsNIP1-1進行序列比對及保守結(jié)構(gòu)分析；使用WoLF PSORT算法(http:∥wolfpsort.seq.cbrc.jp/)和TMHMM Server v.2.0軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別預(yù)測亞細(xì)胞位置和跨膜結(jié)構(gòu)域；使用在線軟件PlantCARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，對毛竹NIP基因上游啟動子序列(2 000 bp)中所含調(diào)控元件進行分析預(yù)測(Lescotetal., 2002)。

利用BLASTP程序?qū)γ窈退景被嵝蛄羞M行雙向比對，配對超過100個氨基酸分子，閾值E<10-50(Zhangetal., 2018)的序列被定義為1對共線性序列，通過TBtools內(nèi)置的MCScanX程序(Wangetal., 2012)對2個物種間的NIP共線性基因進行可視化展示。同時，根據(jù)毛竹和水稻基因組的同源性結(jié)果，利用TBtools計算所有NIP同源基因?qū)χg的同義(Ks)和非同義(Ka)核苷酸替換率。

為探究毛竹NIP基因的潛在功能及其進化關(guān)系，分別從Rice genome annotation database、PLAZA、TAIR和Phytozome數(shù)據(jù)庫獲得水稻、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、擬南芥和毛果楊(Populustrichocarpa)NIP的氨基酸序列，基于MEGA 7.0內(nèi)置的Clustal W對毛竹和這些下載的NIP序列進行比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Kumaretal., 2016)，參數(shù)選擇：鄰接法，校驗參數(shù)為1 000次重復(fù)，氨基酸替換模型選用No.of differences(Jonesetal., 1992)，缺失位點處理方法選擇完全刪除。

1.3 毛竹NIP基因組織特異性表達分析

從NCBI Short Read Archive下載的毛竹組織(鞭、筍、根、葉片、芽和鞘)的26個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號：SRX2408703—SRX2408728)(Zhaoetal., 2018)，篩選其中NIP基因的FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments, 每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片值)，并取以2為底的對數(shù)(Log2)作為基因的表達量，用TBtools軟件繪制表達譜熱圖，可視化分析不同基因的表達情況。

1.4 毛竹NIP基因在不同脅迫條件下表達分析

毛竹種子播種后，在人工氣候室(溫度25 ℃左右，光16 h/暗8 h，相對濕度80%左右)中培養(yǎng)，選擇生長一致的3個月毛竹實生幼苗，隨機分成3組進行處理。向A組基質(zhì)中添加20% PEG 6000至飽和狀態(tài)，B組和C組分別放入4 ℃和42 ℃培養(yǎng)箱中處理。每個處理至少收集15株幼苗，每個處理3次重復(fù)。分別在處理后0、1、3、6、12 h后收集毛竹根系樣品，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。用Takara RNA試劑盒提取樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，存于-20 ℃冰箱用于后續(xù)試驗。

根據(jù)毛竹NIP基因序列使用Primer Premier 5軟件設(shè)計定量引物(表1)。qPCR反應(yīng)體系(10.0 μL)為：2 × SYBRⅡGreen 1 Master 5.0 μL，正向/反向引物0.3 μL，模板cDNA1.0 μL，ddH2O 3.4 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，61 ℃退火10 s，循環(huán)40次。以PeTIP41為內(nèi)參基因，定量結(jié)果采用2-ΔΔCT法(Livaketal., 2001)分析，基于TBtools進行歸一化后繪制表達量熱圖。

1.5 毛竹NIP基因的載體構(gòu)建與酵母表達分析

根據(jù)基因特征和表達模式分析結(jié)果，選擇2個基因(PeNIP1-1和PeNIP2-2)設(shè)計編碼區(qū)擴增引物(ORF-NIP1-1和ORF-NIP2-2)和酵母表達載體構(gòu)建引物(BENIP1-1和BENIP2-2)(表1)，以毛竹cDNA為模板先擴增編碼區(qū)，經(jīng)測序驗證正確后，以測序正確的質(zhì)粒為模板擴增得到包含雙酶切位點的基因片段。采用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切將含有PeNIP1-1和PeNIP2-2目的基因的片段分別克隆到pYES2載體的多克隆位點，形成酵母表達載體pYES2∷PeNIP1-1和pYES2∷PeNIP2-2。

表1 PCR引物①

載體經(jīng)測序驗證正確后，按照INVSc1感受態(tài)細(xì)胞(Weidibio, 中國)的轉(zhuǎn)化說明書，將酵母表達載體pYES2∷PeNIP1-1和pYES2∷PeNIP2-2以及空載pYES2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞。將重組酵母分別涂布于固體培養(yǎng)基(SD-Ura+2%葡萄糖，pH5.8)上，30 ℃培養(yǎng)48～96 h。分別挑取單克隆接種于液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩(200 r·min-1)培養(yǎng)24 h左右，取一定量的培養(yǎng)物，4 000 r·min-1離心1 min收集菌體，菌體重懸于液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SD-Ura+2%半乳糖，pH5.8)中，調(diào)整菌液OD600值為0.2，30 ℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h。取誘導(dǎo)培養(yǎng)后菌液，分別稀釋5個梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，取菌液5 μL分別接種在含0.5、1.0和1.5 mol·L-1山梨醇或NaCl的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5天后，比較觀察酵母的生長差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹NIP基因鑒定與蛋白理化性質(zhì)

通過比對分析，在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中共獲得14個具有完整保守結(jié)構(gòu)域的NIP家族基因，根據(jù)與其他物種的親緣關(guān)系分別命名為PeNIP1-1—PeNIP1-6、PeNIP2-1—PeNIP2-4和PeNIP3-1—PeNIP3-4(表2)。利用在線分析軟件對PeNIPs編碼蛋白預(yù)測分析的結(jié)果表明，14個PeNIPs編碼蛋白的氨基酸長度為235～297 aa，相對分子量在24.03～31.84 kDa之間；理論等電點在6.51～9.24之間，且除PeNIP1-3和PeNIP2-1之外其余的均大于7.00；僅PeNIP3-3有4個跨膜結(jié)構(gòu)，其他13個PeNIPs均有6個跨膜結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示所有PeNIPs均定位于細(xì)胞質(zhì)膜上(表2)。

表2 PeNIPs蛋白的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.2 PeNIPs的系統(tǒng)進化

為檢測PeNIPs之間的進化關(guān)系，預(yù)測其潛在功能，對毛竹、水稻、玉米、高粱、擬南芥和毛果楊的NIP氨基酸序列進行比對分析，利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)。結(jié)果表明，6種植物的NIP成員被分成了3個大的分支(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，其中Ⅰ中6種植物的NIP成員都有，又大致可分為2組，即毛竹的6個成員(PeNIP1-1—PeNIP1-6)和其他單子葉植物(水稻、高粱和玉米)的NIPs聚類在一起，而雙子葉植物擬南芥和毛果楊的NIPs聚類在一起；在Ⅱ分支中，主要是單子葉植物的NIP成員，包括毛竹4個成員(PeNIP2-1—PeNIP2-4)以及水稻的2個、高粱的2個和玉米的2個成員，僅包含1個雙子葉植物毛果楊成員(PtNIP2-1)；而在Ⅲ分支中各植物種成員間差異較大，聚類較為分散，但4個PeNIPs均與水稻或高粱的NIP成員聚類在一起。由此說明，毛竹與單子葉植物水稻、高粱和玉米的親緣關(guān)系更近，在功能上PeNIPs或許與單子葉植物中的同源基因相似(Hanaokaetal., 2014; Yamajietal., 2009)。

圖1 基于不同種植物NIP家族成員構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.3 毛竹與水稻NIP成員的基因片段復(fù)制和共線性

基因復(fù)制和功能分化在基因家族擴張和新功能的演變中發(fā)揮著重要作用，毛竹在4 800萬年前與水稻分化之后，又在700～1 200萬年前發(fā)生了多數(shù)基因簇的分化(Pengetal., 2013)。為研究毛竹PeNIPs與其近緣物種水稻的進化關(guān)系，對毛竹和水稻中NIP基因的共線性關(guān)系及類型進行分析。結(jié)果表明，在毛竹14個PeNIPs中除PeNIP3-3和PeNIP3-4沒有共線性關(guān)系外，共找到毛竹12個基因與水稻8個NIP基因存在27對片段重復(fù)，沒有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)及其他重復(fù)類型的基因。毛竹與水稻的NIP基因共線性分為2種類型：一是單個基因?qū)?yīng)，如PeNIP3-2/OsNIP3-1和PeNIP3-1/OsNIP3-1；二是單個基因與多個基因?qū)?yīng)，如PeNIP1-1對應(yīng)OsNIP1-1、OsNIP1-2和OsNIP1-4共3個基因(圖2)。通常認(rèn)為，非同義對同義取代比(Ka/Ks)<1表示基因選擇為純化的功能約束，Ka/Ks>1表示為陽性選擇的進化加速，Ka/Ks=1表示為自然選擇(Anisimovaetal., 2001; Rothetal., 2006)。對毛竹和水稻具有片段重復(fù)的基因進行Ka/Ks分析結(jié)果顯示，27對NIP基因的Ka/Ks均小于1，最大不超過0.56，表明毛竹NIP基因經(jīng)片段復(fù)制后，主要經(jīng)歷了較強的純化選擇，功能分化有限，且在隨后的進化過程中毛竹重復(fù)NIP基因間的功能差異不大。

2.4 PeNIPs基因結(jié)構(gòu)及編碼氨基酸的保守基序和結(jié)構(gòu)域

基因結(jié)構(gòu)分析表明，14個PeNIPs均具有內(nèi)含子(3～5個)，大部分成員含4個或者5個外顯子(圖3A)。同一分支成員的基因結(jié)構(gòu)相似，各分支之間的基因結(jié)構(gòu)存在一定差異，具體表現(xiàn)為內(nèi)含子的大小和位置存在差異，這些差異可能會導(dǎo)致基因功能的差異。對PeNIPs編碼的蛋白保守基序分析表明，毛竹PeNIPs序列中共有10個保守基序，其中Ⅰ分支6個成員除了PeNIP1-6之外，均含有基序1-7和9；Ⅱ分支4個成員所含保守基序一致，均包含除基序9以外的基序；基序1、2、4和5是Ⅲ分支中4個成員共有基序，而基序8是PeNIP3-1和PeNIP3-2所共有(圖3B)。每個保守基序中氨基酸序列的偏好性在PeNIPs不同成員間存在著一定的差異，但大多數(shù)是比較保守的，尤其是含有跨膜區(qū)(TM1-TM6)和Loop-Half螺旋區(qū)(Loop B和Loop E)的保守基序(圖3C)。同一個分支大多數(shù)成員具有相同的保守基序，說明這些成員可能存在相似的功能。

圖3 PeNIPs基因結(jié)構(gòu)及編碼氨基酸保守基序分析

AQPs運輸?shù)孜锞哂羞x擇透過性，位于Loop B和Loop E處的高度保守的NPA(Asn-Pro-Ala)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诳椎来笮〖八钟H疏性具有重要作用。序列比對結(jié)果表明，從PeNIPs氨基酸的N端到C端，除PeNIP3-3缺少ar/R選擇性過濾器的TM4結(jié)構(gòu)之外，其他各序列均含有高度保守的NPA結(jié)構(gòu)域及ar/R選擇性過濾器(TM1-TM6)，另外除PeNIP3-1和PeNIP3-2的2個NPA結(jié)構(gòu)域的第3個氨基酸分別被絲氨酸和天冬氨酸替代外，其他12個PeNIPs均具有2個典型的NPA結(jié)構(gòu)域(圖4)。在底物運輸時，ar/R選擇性過濾器同樣也是重要的選擇通過結(jié)構(gòu)，除PeNIP1-4為W-V-E-R外，其他PeNIP1s均為W-V-A-R，PeNIP2s成員為G-S-G/A-R組合形式，而PeNIP3s成員為A-I/A-G-R形式。氨基酸Froger’s殘基在底物運輸過程同樣發(fā)揮著重要作用，但毛竹PeNIPs的Froger’s殘基保守性較低，具有多種組合形式。ar/R選擇性過濾器和Froger’s殘基的功能位點的多態(tài)性預(yù)示著PeNIPs在毛竹快速生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的功能。

圖4 NIPs序列比對分析

2.5 PeNIPs上游啟動子順式調(diào)控元件

了解啟動子順式作用元件是預(yù)測基因轉(zhuǎn)錄和表達調(diào)控的重要研究方法。對14個PeNIPs起始密碼子上游2 000 bp序列中調(diào)控元件分析表明，其中包含多種與脅迫、激素應(yīng)答相關(guān)的調(diào)控元件。非生物脅迫的順式作用元件主要有響應(yīng)低氧的ARE和GC-motif、低溫的LTR、干旱的MBS以及逆境響應(yīng)元件TC-rich repeats等；與生物脅迫相關(guān)的有真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件W-box；與激素相關(guān)的應(yīng)答元件包括生長素的AuxRR-core和TGA-element，茉莉酸甲酯的TGACG-motif，赤霉素的GARE-motif、P-box和TATC-box，水楊酸的TCA-element，以及脫落酸的ABRE等(圖5A)。但各基因啟動子中元件的種類以及數(shù)量均存在一定的差異(圖5B)。由此說明，PeNIPs的轉(zhuǎn)錄將受到各種生物、非生物脅迫和激素的影響，而且所受影響的程度也將存在一定的差異。

圖5 PeNIPs基因啟動子順式作用元件和應(yīng)答元件分析

2.6 PeNIPs組織特異性表達

轉(zhuǎn)錄組表達譜數(shù)據(jù)是驗證基因功能的有效途徑之一?；诿?6個組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，14個PeNIPs在毛竹不同組織以及同一組織不同生長時期的表達模式不同，且各基因的表達豐度也存在著一定的差異(圖6)。有4個基因(PeNIP2-1/2-2/3-1/3-2)在各個組織中均有表達，它們可能與毛竹整個生長發(fā)育過程密切相關(guān)，有3個基因(PeNIP1-6/3-3/3-4)則在26個組織中基本沒有檢測到表達；其他7個基因表現(xiàn)出組織表達特異性，如PeNIP1-1和PeNIP1-2主要在筍芽中表達，PeNIP1-3、PeNIP1-4和PeNIP1-5在根中的表達量高于其他組織，PeNIP2-3和PeNIP2-4在不同發(fā)育階段根、筍和葉中均有表達，但在不同高度筍中的表達量多數(shù)表現(xiàn)為中部和基部高于上部。另外，多數(shù)在筍中表達的PeNIPs具有類似的變化趨勢，即隨著筍高度的增加基因的總的表達量也逐漸增加，且多為基部和中部表達高于上部，推測PeNIPs在毛竹快速生長過程的水分運輸中發(fā)揮了重要作用。

圖6 PeNIPs在26個組織中的表達分析

2.7 PeNIPs在逆境脅迫條件下的表達

啟動子調(diào)控元件分析表明毛竹PeNIPs的表達可能會受到逆境脅迫影響，本研究采用qPCR技術(shù)主要檢測了溫度和干旱脅迫處理條件下PeNIPs在根中的表達情況。結(jié)果表明，隨著處理時間的延長，14個PeNIPs在不同脅迫處理條件下呈現(xiàn)出一定的差異表達，其中低溫處理下的8個基因(PeNIP1-3、PeNIP1-5、PeNIP1-6、PeNIP2-1、PeNIP2-2、PeNIP2-4、PeNIP3-1和PeNIP3-3)、高溫處理下的2個基因(PeNIP1-1和PeNIP2-2)以及干旱處理下的3個基因(PeNIP1-1、PeNIP1-6和PeNIP2-1)均表現(xiàn)為不同程度的上調(diào)表達；而有2個基因(PeNIP3-3和PeNIP3-4)在4 ℃下以及有4個基因(PeNIP1-3、PeNIP2-1、PeNIP2-3和PeNIP2-4)在42 ℃下均表現(xiàn)為下調(diào)表達；其他基因則表現(xiàn)為波動變化，且多數(shù)基因在處理時間達到6 h和12 h時表達量較高(4 ℃處理下有3個基因，42 ℃處理下有5個基因以及干旱處理下有10個基因)(圖7)。

圖7 溫度和干旱脅迫條件下根中PeNIPs的表達分析

另外，上調(diào)表達的基因有3種變化趨勢：1)在處理6 h時基因表達量達到最高，隨后有所下降，如4 ℃處理下的PeNIP2-2和PeNIP2-4、42 ℃處理下的PeNIP1-1和PeNIP2-2及干旱處理下的PeNIP1-6；2)隨處理時間的延長，基因表達量逐漸上升，如4 ℃處理下的PeNIP2-1、PeNIP3-1和PeNIP3-2，以及干旱處理下的PeNIP1-1和PeNIP2-1；3)基因表達量隨處理時間延長而呈現(xiàn)出波動變化，如4 ℃處理下的PeNIP1-3、PeNIP1-5和PeNIP1-6。因此，推測PeNIPs在不同逆境脅迫中可能以不同的表達方式發(fā)揮其作用。

2.8 表達PeNIPs的酵母對脅迫的抗性

接種重組酵母(pYES2∷PeNIP1-1和pYES2∷PeNIP2-2)和對照酵母(pYES2)菌液在正常固體培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出相似的生長能力(圖8)，表明在酵母中表達PeNIP1-1和PeNIP2-2不影響酵母的正常生長。在添加不同濃度山梨醇和NaCl的固體培養(yǎng)基上，重組酵母和對照酵母的生長均受到一定的抑制。當(dāng)山梨醇濃度為0.5 mol·L-1時，各稀釋菌液的生長沒有明顯差異；但當(dāng)山梨醇濃度為1.0 mol·L-1時，稀釋為10-5的菌液中重組酵母菌落數(shù)量均明顯多于對照；當(dāng)濃度達到1.5 mol·L-1時，稀釋為10-4的菌液中重組酵母菌落數(shù)量均明顯多于對照(圖8A)。另外，在添加了不同濃度NaCl的固體培養(yǎng)基上，重組酵母在含0.5和1.0 mol·L-1的NaCl培養(yǎng)基上均有所生長，而對照酵母僅在含0.5 mol·L-1的NaCl培養(yǎng)基上生長，當(dāng)NaCl為1.5 mol·L-1時無酵母菌落生長；且在NaCl為0.5 mol·L-1時，稀釋為10-4的菌液中重組酵母菌落數(shù)量多于對照，在NaCl為1.0 mol·L-1時，稀釋為10-1的菌液中菌落數(shù)量多于對照(圖8B)。由此表明，PeNIP1-1和PeNIP2-2的表達提高了轉(zhuǎn)基因酵母的抗旱和抗鹽能力。

圖8 脅迫條件下PeNIP1-1和PeNIP2-2表達對酵母生長的影響

3 討論

許多研究證實，水通道蛋白(AQPs)在提高植物對非生物脅迫的耐受性方面發(fā)揮著重要作用。膜內(nèi)在水通道蛋白(NIPs)作為一類重要的AQPs，其在植物生長發(fā)育過程中的作用倍受關(guān)注。如HvNIP2;1(HvLsi1)在大麥中不但具有運輸硅的活性(Chibaetal., 2009)，而且還調(diào)節(jié)硼的吸收(Schnurbuschetal., 2010)，從而影響其生長和產(chǎn)量；NIP1;2調(diào)節(jié)擬南芥對鋁的吸收、轉(zhuǎn)運和耐受能力(Wangetal., 2017)。繼玉米和水稻之后，已在多種單子葉植物如谷子(Setariaitalica)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、高粱、菠蘿(Ananascomosus)中先后鑒定出12、23、11和7個NIP成員(Azadetal., 2009; Reddyetal., 2015; Bezerra-Netoetal., 2019)，進一步試驗證明，NIPs除運輸水外還具有甘油轉(zhuǎn)運功能(Kaldenhoffetal., 2006; Gomesetal., 2009)。本研究從毛竹中鑒定出14個NIP成員，是已知單子葉植物中相對較多的。研究表明，在進化過程中多倍體化是植物適應(yīng)環(huán)境和新物種形成的重要機制(Husbandetal., 1998)，單個基因片段、染色體和基因組復(fù)制是植物進化的主要動力(Patersonetal., 2012)。毛竹在進化過程中經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件和多數(shù)基因簇的分化(Pengetal., 2013)，是導(dǎo)致其NIP基因數(shù)量增加的主要原因，毛竹和水稻NIP基因之間共線性分析結(jié)果支持了這一觀點。然而，基因?qū)Φ腒a/Ks均小于1，推測PeNIPs在進化過程中受到了純化選擇，基因片段的復(fù)制維持了其原有功能，而沒有形成新的功能。

真核生物基因的表達受多層次調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子結(jié)合位點的相互作用是真核生物基因表達調(diào)控的重要機制之一。啟動子決定基因的活動，但其本身并不控制基因活動，而是通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而控制基因的活動。在PeNIPs上游啟動子序列中存在多種激素與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件和應(yīng)答元件，這些元件已被證明賦予了植物快速反應(yīng)和調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達的能力，從而提高對逆境的適應(yīng)性(Wuetal., 2019)，如維持細(xì)胞壁、抵御外界傷害(Creelmanetal., 1992)、調(diào)控細(xì)胞壁性質(zhì)(Wolfetal., 2012; Majdaetal., 2018)以及果實生長與成熟(Villarrealetal., 2016)等，推測它們在毛竹中可能發(fā)揮著類似的作用?；虮磉_模式是基因功能的重要體現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄組表達譜表明PeNIPs在各組織中發(fā)揮著不同的作用。結(jié)合定量表達結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，一些在毛竹各生長階段表達量低或不表達的基因(如PeNIP1-1、PeNIP1-6、PeNIP3-3和PeNIP3-4)，在逆境脅迫條件下卻均有所表達，故推測這些PeNIPs也可能參與逆境脅迫響應(yīng)并發(fā)揮著重要作用(Zhuetal., 2019)。另外，不同逆境脅迫下同一基因表達模式的差異，進一步說明PeNIPs功能的多樣性，而其在竹子生長過程以及脅迫中的作用機制仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究在毛竹中共鑒定出14個PeNIPs基因，其編碼的蛋白均具有完整的保守結(jié)構(gòu)域，為疏水蛋白。在PeNIPs啟動子區(qū)域中含有多種與脅迫、激素相關(guān)的順式作用元件和應(yīng)答元件，在逆境脅迫條件下PeNIPs的表達變化證實它們參與了溫度、干旱脅迫的應(yīng)答。表達PeNIP1-1和PeNIP2-2的酵母在干旱和高鹽脅迫下的生長優(yōu)于對照，表明它們具有一定的提高抗旱和抗鹽能力的功能。本研究將為進一步開展毛竹基因工程研究提供候選基因資源，對培育毛竹抗逆新品種具有重要參考價值。