閆海冰 張慧芳 馮 帆 于兆友 楊秀清

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 太谷 030801)

土壤鹽堿化已成為全球性的資源和環(huán)境問題，全球約有 9.5億hm2的鹽堿土。中國的鹽堿土面積可達(dá)0.36億hm2(潘雄波等，2016)，而這些土地已成為農(nóng)林業(yè)發(fā)展的障礙用地，并嚴(yán)重影響我國的生態(tài)環(huán)境建設(shè)。研究植物的耐鹽堿機(jī)制，評價并篩選耐鹽堿植物進(jìn)行鹽堿地的生物改良，是實現(xiàn)鹽堿地提質(zhì)增效利用并實現(xiàn)鹽堿地長效生態(tài)修復(fù)的重要途徑(劉雨欣，2018)。

白刺屬(Nitraria)是蒺藜科(Zygophyllaceae)的多分枝生態(tài)抗逆兼果肉經(jīng)濟(jì)型灌木，主要分布于我國新疆、青海、寧夏、甘肅以及內(nèi)蒙古等地區(qū)的沙漠及鹽堿地上，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽耐旱能力(楊秀艷等，2017)。目前，關(guān)于白刺耐鹽機(jī)制及其評價研究大多集中于其生長特征、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)、活性氧代謝以及光合特性等生理生化方面(李煥勇等，2019；楊秀艷等，2017；左鳳月，2013；王文等，2012；武香等，2012；閆永慶等，2010)。基于蛋白組學(xué)方法可研究鹽脅迫下白刺蛋白表達(dá)的變化(Chengetal.，2015)，然而基因和蛋白質(zhì)在mRNA水平上增加或減少并不直接影響相應(yīng)蛋白表達(dá)的變化(Gygietal.，1999)；即使蛋白質(zhì)已經(jīng)被翻譯，也不可能總是能提高酶活性(Sumneretal.，2003)。代謝組學(xué)方法克服了蛋白組學(xué)方法無法完全描述生化合成的細(xì)胞內(nèi)代謝系統(tǒng)的不足，可通過代謝物的上下調(diào)變化以及代謝物實際參與的代謝通路(途徑)來真實地表征植物耐鹽反應(yīng)和發(fā)生過程(蔣丹，2019；Saito et al.，2010)。因此，基于代謝組學(xué)方法研究鹽脅迫下白刺的耐鹽反應(yīng)，可以全面揭示白刺細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)，獲得有關(guān)白刺代謝物的綜合信息，對于深入了解白刺對鹽脅迫響應(yīng)的代謝途徑及過程非常重要(Nietal.，2015；馮帆等，2019)。

本文以唐古特白刺(N.tangutorum)和西伯利亞白刺(N.sibirica)葉片為研究對象，采用GC-TOF-MS代謝組學(xué)方法，研究鹽脅迫下2種白刺葉片代謝物及其代謝通路的變化，以揭示這2種白刺對鹽脅迫的代謝響應(yīng)機(jī)制，為有效提高白刺對鹽堿地的持續(xù)生物改良及適應(yīng)性研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子采集及實生苗培養(yǎng)

西伯利亞白刺種子和唐古特白刺種子均為取自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市磴口縣(海拔1 036 m, 40°32′N, 106°28′E)白刺產(chǎn)地的野生種。分別挑選大小一致、顆粒飽滿的2種白刺的種子先后于50 ℃恒溫水浴鍋浸泡24 h，0.5‰KMnO4溶液避光浸泡2 h，用蒸餾水清洗干凈備用。

采用純沙進(jìn)行幼苗培養(yǎng)。將0.5% KMnO4溶液殺菌后的純沙置于16 cm×14 cm營養(yǎng)缽中，每缽播白刺種子50粒，每品種12缽，共24缽，種植深度約4 cm，置于溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件設(shè)為平均溫度26 ℃，光照時長14 h，光照強(qiáng)度1 200 Lux，每3天每缽澆灌蒸餾水100 mL，保持純沙含水量60%。

1.2 鹽脅迫處理及取樣

待幼苗生長至25 cm左右且葉量充足時進(jìn)行鹽脅迫處理。此時唐古特白刺每缽平均出苗35株，西伯利亞白刺每缽平均出苗28株。分別將每種白刺的12缽幼苗隨機(jī)分為2組，每組6缽，并統(tǒng)一留苗20株，試驗組每3天澆灌300 mmol·L-1NaCl溶液100 mL，對照組澆灌等量的蒸餾水，為防止鹽分流失，營養(yǎng)缽底部墊有塑料托盤，澆灌后滲出的溶液要重新倒回營養(yǎng)缽內(nèi)，并定時記錄2種白刺的生長狀況。

脅迫后第7天試驗組有植株頂端嫩葉邊緣出現(xiàn)微黃，此時隨機(jī)剪取各缽幼苗中上部第2節(jié)完好葉片100 mg，每組6次。所取樣品用錫箔紙包好并編號，液氮浸泡7 min后迅速取出，置于-80 ℃冰箱備用。

1.3 代謝物提取及檢測

取樣本25 mg于2 mL EP管中，加入提取液300 μL、核糖醇5 μL，渦旋30 s后加入瓷珠，45 Hz研磨儀處理4 min，超聲5 min(冰水浴)，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，之后取200 μL上清液于1.5 mL EP管中，每個樣本各取50 μL混合成QC樣本，真空濃縮器中干燥后加入甲氧胺鹽試劑30 μL，混勻，80 ℃孵育30 min，再加入40 μL BSTFA，混勻，70 ℃孵育1.5 h，冷卻至室溫，加入5 μL FAMEs，備測。

使用配有Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱的Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(30 m×250 μm×0.25 μm, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)進(jìn)行GC-TOF/MS檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用ChromaTOF軟件(V 4.3x，LECO)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析(馮帆等，2019)；使用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫分析質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配進(jìn)行物質(zhì)定性，利用內(nèi)標(biāo)對代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。通過SIMCA軟件(V14.1, Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea, Sweden)對歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換、中心化格式化處理、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析，依據(jù)OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1.0、t檢驗的P<0.05來篩選差異代謝物(李煥勇，2018)。對差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析，并利用KEGG、PubChem等相關(guān)數(shù)據(jù)庫挖掘差異代謝物參與的通路，最后通過富集分析和拓?fù)浞治龊Y選與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物的PCA和OPLS-DA分析

通過對2個種24個白刺樣品的總離子流色譜圖(TIC)進(jìn)行掃描和重疊(圖1)，發(fā)現(xiàn)TIC出峰保留時間和峰面積都重疊較好。

利用SIMCA軟件對圖1中的代謝譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫前后，唐古特白刺代謝物在第二主成分(PC2)上區(qū)分顯著，而西伯利亞白刺代謝物在第一主成分(PC1)上區(qū)分顯著(圖2)，此外，2種白刺在2種處理下的數(shù)據(jù)點在第一主成分的預(yù)測主成分得分上區(qū)分顯著(圖3)，即2種白刺在鹽脅迫前后均有差異代謝物存在，且西伯利亞白刺代謝物差異更為顯著。由2種白刺的OPLS-DA置換檢驗圖(圖3)可知原模型具有良好的穩(wěn)健性。

圖1 所有QC樣本的TIC重疊

2.2 差異代謝物的篩選和分析

依據(jù)OPLS-DA模型第一主成分的VIP值大于1.0、t檢驗的P值小于0.05篩選組間的差異代謝物(表1)，并對這些差異代謝物進(jìn)行整理分類(圖4)。300 mmol·L-1NaCl脅迫處理前后唐古特白刺共篩選出差異代謝物11種，其中3種顯著下調(diào)，8種顯著上調(diào)，包括1種脂肪酸、5種有機(jī)酸、1種醇以及1種堿基衍生物(上調(diào)濃度介于1.32～2.68倍之間)；而西伯利亞白刺篩選出差異代謝物108種，其中2種顯著下調(diào)，106種顯著上調(diào)，包括51種氨基酸、22種糖、11種脂肪酸、8種有機(jī)酸、7種醇、5種生物堿以及2種維生素(上調(diào)濃度介于0.54～14.45倍之間)。以上結(jié)果表明，相比唐古特白刺，西伯利亞白刺有更多的代謝物參與鹽脅迫響應(yīng)。

圖4 鹽脅迫后2種白刺葉片中差異代謝物的分類

2.3 差異代謝物的KEGG注釋及代謝通路分析

通過KEGG注釋將唐古特白刺的差異代謝物富集到了6條代謝通路中，而將西比利亞白刺的差異代謝物富集到了46條代謝通路中(表2)。對注釋得到的代謝通路進(jìn)行富集分析和拓?fù)浞治?，進(jìn)一步篩選到與唐古特白刺代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵路徑為硫代謝、二羧酸循環(huán)及TCA循環(huán)(圖5)，說明唐古特白刺主要通過加強(qiáng)這3條代謝通路來響應(yīng)鹽脅迫。其中硫代謝最為顯著，參與此代謝通路的差異代謝物為O-琥珀酰-L-高絲氨酸，其含量顯著上調(diào)，為未脅迫時的2.68倍。篩選到與西伯利亞白刺代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵路徑為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、C5支鏈二元酸代謝、泛酸和CoA生物合成、苯丙氨酸代謝、硫代謝、絡(luò)氨酸代謝，屬于氨基酸生物合成的代謝通路數(shù)量多達(dá)13條，即氨基酸代謝在西伯利亞白刺響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮主要作用(圖5)。其中，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑差異性最為顯著，參與此代謝通路的差異代謝物分別為檸檬酸、L-亮氨酸、3-蘋果酸異丙酯、L-纈氨酸、L-異亮氨酸以及丙酮酸，其含量均顯著上調(diào)，為未脅迫時的1.21～3.12倍。

表2 鹽脅迫后2種白刺差異代謝物映射的KEGG通路

圖5 唐古特白刺(上)和西伯利亞白刺(下)的代謝通路分析

3 討論

植物對逆境脅迫的響應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，其中最重要的是代謝的改變，即植物通過調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)以誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列特殊代謝物，從而達(dá)到對生物、非生物脅迫的防御作用(郭鳳丹等，2017)。

3.1 鹽脅迫下2種白刺代謝物的變化

逆境脅迫時，植物通過啟動一系列細(xì)胞、分子以及生理生化水平上的調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞代謝平衡(倪建偉等，2014)。代謝物作為細(xì)胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，是聯(lián)系基因型和表型的紐帶，其種類和數(shù)量的變化被視為植物對基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)(Zhangetal., 2019；Fernieetal., 2008)。本研究中，鹽脅迫下西伯利亞白刺鑒定出差異代謝物108種，其中106種顯著上調(diào)，而唐古特白刺僅鑒定出11種，其中8種顯著上調(diào)，即相比唐古特白刺，西伯利亞白刺存在更多的代謝物質(zhì)參與鹽脅迫調(diào)控。就鹽脅迫后2種白刺的代謝差異物相比，代謝物種類差距較大的主要集中在氨基酸、糖以及脂肪酸，而生物堿、堿基衍生物以及維生素等代謝物的種類均比較少，且含量上調(diào)、下調(diào)不顯著。

鹽脅迫后西伯利亞白刺葉片中51種氨基酸含量顯著上調(diào)，而唐古特白刺葉片中1種上調(diào)。氨基酸作為蛋白質(zhì)的組成單位，是能量代謝物質(zhì)，也是許多生物體內(nèi)重要含氮化合物的前體(徐春英，2008)，其在植物體內(nèi)的積累可作為一種耐鹽指示物進(jìn)而反映植物的耐鹽性(燕輝等，2012)。同時，在植物響應(yīng)非生物脅迫中，氨基酸通過參與植物生理代謝，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)和關(guān)鍵酶的活性以提高植物對逆境的抗性(邢芳芳等，2018；楊冬爽，2017)。因此，與唐古特白刺相比，西伯利亞白刺在響應(yīng)鹽脅迫時氨基酸類代謝物的變化更為顯著，可為其抵御鹽脅迫提供更多的物質(zhì)和能量(段二龍等，2019)。

可溶性糖參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)(武香等，2012)。與鹽敏感玉米雜交種(Logo)相比，鹽脅迫下耐鹽玉米(Zeamays)雜交種(SR08)通過代謝物葡萄糖、果糖和蔗糖的積累以提高其耐鹽適應(yīng)性(Richteretal.，2015)。本研究中，鹽脅迫后西伯利亞白刺葉片中22種糖類代謝物顯著上調(diào)，這些糖類代謝物在應(yīng)答鹽脅迫時既可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)減緩滲透脅迫，也可作為合成有機(jī)溶質(zhì)的碳架和能量來源，為白刺抵抗鹽脅迫提供重要能量(馮帆等，2019)，同時，糖降解過程中的許多代謝產(chǎn)物也是合成氨基酸的前體物質(zhì)，如絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸等。但是，鹽脅迫后唐古特白刺葉片中唯一的糖類代謝物乳糖顯著下調(diào)，其他可溶性糖的含量無明顯變化，這表明，可溶性糖可能不參與唐古特白刺對鹽脅迫的應(yīng)答。

脂肪酸是生物體貯藏能量的主要來源以及細(xì)胞膜脂的重要組成成分(馮帆等，2019)，參與植物對多種生物、非生物脅迫的響應(yīng)，通過調(diào)控植物體基礎(chǔ)免疫、效應(yīng)子誘導(dǎo)抗性及系統(tǒng)抗性等多種防御途徑以提高植物對逆境脅迫的抗性(劉文獻(xiàn)等，2014)。生物膜是逆境脅迫中受損傷的主要位點，植物體通過脂肪酸脫飽和維持膜的流動性以適應(yīng)逆境(楊冬爽，2017；年洪娟等，2012)。Yang等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)鹽脅迫時，耐鹽野生大豆(Glycinesoja)的脂肪酸代謝物含量明顯高于普通野生大豆。本研究中，鹽脅迫后西伯利亞白刺葉片中顯著上調(diào)的脂肪酸代謝物共11種，其中，亞麻酸還是植物合成抗逆信號分茉莉酸的前體物質(zhì)(Xue，2006)；而唐古特白刺葉片中脂肪酸代謝物僅亞油酸，說明與唐古特白刺相比較，脂肪酸在西伯利亞白刺的耐鹽調(diào)控中發(fā)揮著更重要的作用。

3.2 鹽脅迫下2種白刺代謝通路的變化

本研究中，鹽脅迫后西伯利亞白刺的差異代謝物主要富集到氨基酸代謝(相關(guān)通路多達(dá)13條)，且代謝途徑的差異性以纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成最顯著，表明西伯利亞白刺可能通過氨基酸代謝迅速合成親和性滲透物質(zhì)以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢，維持細(xì)胞正常的生長和發(fā)育(徐春英，2008)。此外，氨基酸在細(xì)胞內(nèi)可經(jīng)生物合成形成蛋白質(zhì)，也可進(jìn)行分解代謝產(chǎn)生ATP，或轉(zhuǎn)化為糖和脂肪，為抵御鹽脅迫提供能量。鹽脅迫后唐古特白刺并未發(fā)現(xiàn)有差異代謝物被富集到氨基酸代謝中，即唐古特白刺在響應(yīng)鹽脅迫時氨基酸代謝并不顯著。

植物可通過硫代謝的加強(qiáng)以提高其對逆境脅迫的適應(yīng)性(包雨卓，2017)。在活性氧清除系統(tǒng)中作用最突出的含硫化合物是谷胱甘肽(GSH)，GSH是硫代謝的重要產(chǎn)物，也是硫代謝的一種重要的信號物質(zhì)，GSH的增多有助于維持植物正常的碳和氮代謝(高吉霞，2010)。在唐古特白刺中，與鹽脅迫代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵路徑為硫代謝，且以參與該途徑的O-琥珀酰-L-高絲氨酸含量上調(diào)最為顯著；同時，西伯利亞白刺硫代謝途徑差異性也較顯著，參與該途徑的硫酸鹽和L-半胱氨酸含量也顯著上調(diào)，說明硫代謝可能是2種白刺用于抵抗鹽脅迫的有效途徑之一。

TCA循環(huán)是糖、脂肪和氨基酸三大營養(yǎng)物質(zhì)的最終代謝通路和代謝聯(lián)系樞紐，該循環(huán)代謝的中間產(chǎn)物又可作為許多生物合成途徑的起點(李明達(dá)等，2010)，在植物對逆境脅迫的響應(yīng)中扮演著重要角色。本研究中，鹽脅迫后唐古特白刺顯著上調(diào)的代謝物檸檬酸參與TCA循環(huán)，脅迫后西伯利亞白刺葉片中參與TCA循環(huán)的檸檬酸和丙酮酸也顯著上調(diào)。檸檬酸可以直接參與機(jī)體能量、結(jié)構(gòu)和酶促反應(yīng)，在TCA循環(huán)中可被完全氧化生成ATP，具有高能量利用率(崔媛等，2019)。丙酮酸是糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，可以在細(xì)胞漿中還原成乳酸供能，還可通過乙酰CoA和TCA循環(huán)完成葡萄糖的有氧氧化供能過程，實現(xiàn)植物體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的相互轉(zhuǎn)化(路文靜，2011)。檸檬酸和丙酮酸的顯著上調(diào)表明鹽脅迫后2種白刺的TCA循環(huán)有所增強(qiáng)，即TCA循環(huán)在2種白刺抵御鹽脅迫調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用。

植物響應(yīng)鹽脅迫時，新陳代謝較為復(fù)雜，涉及氨基酸類、糖類及有機(jī)酸類等代謝物及相關(guān)代謝通路的變化(Chandnaetal.，2013)，代謝物的含量反映了與之相關(guān)基因的表達(dá)量，也表明鹽脅迫對這些代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用(趙佳利等，2019)。Yang等(2017)研究表明，耐鹽野生大豆主要通過氨基酸代謝與有機(jī)酸代謝來響應(yīng)鹽脅迫，而普通野生大豆主要通過TCA循環(huán)來響應(yīng)鹽脅迫。本研究中2種白刺在鹽脅迫下代謝物與代謝通路均發(fā)生變化，且表現(xiàn)出不同的代謝響應(yīng)策略，與唐古特白刺相比，西伯利亞白刺在響應(yīng)鹽脅迫時參與的代謝物種類更多，途經(jīng)更廣，代謝響應(yīng)更顯著。本研究前期試驗(馮鑫煒等，2015)表明，300 mmol·L-1NaCl脅迫時唐古特白刺平均生物量達(dá)2.97 g，根冠比為0.21，葉片電解質(zhì)滲透率25.27%，MDA含量為8.63 μmol·L-1FW，SOD活性為357.80 U·g-1；西伯利亞白刺平均生物量達(dá)5.39 g，根冠比為0.33，葉片電解質(zhì)滲透率20.08%，MDA含量為6.58 μmol·L-1FW，SOD活性為408.47 U·g-1。西伯利亞白刺從生長和生理方面表現(xiàn)出了優(yōu)于唐古特白刺的耐鹽性，這與左鳳月(2013)、武香(2012)等的研究結(jié)果相吻合。本研究中2種白刺對鹽脅迫的代謝響應(yīng)與生長、生理響應(yīng)的一致性進(jìn)一步驗證了西伯利亞白刺具有比唐古特白刺較好的耐鹽性。

4 結(jié)論

唐古特白刺與西伯利亞白刺對鹽脅迫有著不同的代謝響應(yīng)機(jī)制。唐古特白刺通過以有機(jī)酸為主的11種代謝物參與鹽脅迫響應(yīng)，并通過加強(qiáng)以硫代謝為主的6條代謝通路來應(yīng)答鹽脅迫。西伯利亞白刺通過以氨基酸、糖、脂肪酸為主的108種代謝物參與鹽脅迫響應(yīng)，并通過加強(qiáng)以氨基酸代謝為主的46條代謝通路來應(yīng)答鹽脅迫。西伯利亞白刺參與鹽脅迫調(diào)控的代謝物較唐古特白刺種類更多，代謝途徑更廣，對鹽脅迫的代謝響應(yīng)更顯著。