保志娟, 金蓉, 楊金清, 張琦, 朱永立, 趙正雄

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院， 昆明 650201)

近年來，隨著工業(yè)化的發(fā)展及長時間礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用，土壤中重金屬含量劇增，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品重金屬超標(biāo)等安全性問題層出不窮[1]。鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞 (Hg)、鉻(Cr)、砷(As)和鎳(Ni)等有害重金屬難以被微生物降解，進入土壤后易積累進而轉(zhuǎn)化為毒性更大的甲基化合物。由于高等植物在整個生命周期中是固著生長的，其被動性地在體內(nèi)累積重金屬，當(dāng)積累到一定數(shù)量時，就會影響植物的生長發(fā)育[2]。

煙草作為我國主要的經(jīng)濟作物之一，易積累重金屬。重金屬含量過高的煙草植株不僅生長發(fā)育和產(chǎn)量會受到較大影響, 煙葉品質(zhì)也會明顯降低[3-5]。同時，許多研究表明，含有重金屬的卷煙在抽吸過程中會通過主流煙氣進入人體，對人體健康造成危害[6-7]。因此，減少煙草重金屬含量已成為國內(nèi)外研究的熱點。張艷玲等[8]研究表明，我國煙葉中的重金屬元素以Pb和Cd為主。土壤中Pb濃度的增加能引起煙草根、莖和葉中Pb含量增加，且以根中Pb含量增幅最大[9]。高濃度Pb會影響煙草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，抑制葉片的抗氧化酶活性，改變?nèi)~肉細胞的亞顯微結(jié)構(gòu)[10]。

不同元素和重金屬作用，尤其是有益元素和金屬元素的聯(lián)合作用，可能會加強或減緩重金屬對煙草的毒性。鋅(Zn)是植物生長、發(fā)育必需的微量元素。據(jù)報道，Zn能緩解重金屬Cd的毒性效應(yīng)[11-12]。另外，Pb2+在生物體內(nèi)常常與Zn2+和Ca2+的結(jié)合位點作用[13]。譚光群等[14]研究也表明，少量Zn加入有助于Pb從煙株根部向地上部轉(zhuǎn)移，這對于受重金屬污染的植物自身修復(fù)非常有意義。目前，關(guān)于煙草重金屬脅迫的研究大多只關(guān)注單一重金屬對煙草的毒性作用及機理，而重金屬復(fù)合污染對煙草的脅迫機制研究卻鮮有報道。本文采用土培方法，研究了不同濃度重金屬Pb、Zn復(fù)合作用(Pb×Zn)對煙草抗氧化酶和碳氮代謝的影響，以期為重金屬污染下煙草的耐性機制研究及緩解Pb污染提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為紅花大金元，種子來源于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司。試驗土壤取自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)實驗基地，土壤類型為壤土，pH為6.97，含水率18.78%，土壤有機質(zhì)含量7.06 g·kg-1，有機碳4.10 g·kg-1，硝態(tài)氮2.33 mg·kg-1，銨態(tài)氮4.89 mg·kg-1，速效磷11.69 mg·kg-1，速效鉀77.18 mg·kg-1。試驗土壤鉛含量為27.1 mg·kg-1，鋅含量為117 mg·kg-1，皆低于GB 15618—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[15]中規(guī)定的土壤污染風(fēng)險篩選值(鉛120 mg·kg-1，鋅250 mg·kg-1)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與工程中心進行。采用2因素4水平完全試驗設(shè)計，Zn濃度設(shè)置為：0、20、60、100 mg·kg-1，Pb濃度為：0、150、450、750 mg·kg-1，共16個處理(不施重金屬的處理為對照)。采用盆栽試驗，每個處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)3盆。將通過漂浮育苗，長勢一致的煙苗在苗齡為55 d時移栽入花盆，每盆裝風(fēng)干土10 kg，施用煙草專用復(fù)合肥40 g作基肥(N∶P2O5∶K2O=15∶5∶25)。Zn和Pb分別用Zn2SO4和Pb(OAc)2配制成不同濃度水溶液，于移栽后15 d以模擬污灌方式一次性施入，后期正常管理。

1.3 測定指標(biāo)及方法

在煙苗移栽后30和50 d時，用打孔器取7～11葉位的一定質(zhì)量煙葉，測定其各項指標(biāo)。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用硝基四氮唑藍光還原法測定[16]，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[16]，脯氨酸(proline，Pro)含量測定參照磺基水楊酸法[17]，硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)活性參照鄒琦[18]的方法測定，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G-520法測定[17]，蔗糖酶采用李合生[19]的方法測定，可溶性糖含量采用蒽酮法進行測定[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013、SPSS 19.0和Origin 2017軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉MDA和脯氨酸含量的影響

由圖1可知，在Pb、Zn單獨處理時，煙葉的MDA和脯氨酸含量均隨Pb或Zn濃度的增加而增加。中低濃度(150及450 mg·kg-1)Pb復(fù)合Zn處理，煙葉MDA和脯氨酸含量隨Zn濃度增加而增加，750 mg·kg-1Pb復(fù)合Zn處理則呈現(xiàn)先增后減趨勢。750 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn復(fù)合處理時，煙葉的MDA含量最高，分別比對照增加45.9%(移栽后30 d)和51.9%(移栽后50 d)。移栽后50 d，750 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn復(fù)合處理時，煙葉脯氨酸比對照增加580.1%。

圖1 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉MDA和脯氨酸含量的影響Fig.1 Combination effect of Pb and Zn on MDA and proline content in tobacco leaf

2.2 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉SOD和POD活性的影響

由圖2可知，Pb、Zn單獨處理及中低濃度(150及450 mg·kg-1)Pb復(fù)合Zn處理下，葉片SOD和POD活性均隨Pb或Zn濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢。450 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn復(fù)合處理時，煙葉SOD和POD活性較高，移栽后30 d時分別比對照增加22.9%和64.7%。高濃度(750 mg·kg-1)Pb復(fù)合Zn處理下，移栽后30 d時，煙葉SOD活性隨Zn濃度增加呈現(xiàn)增加-降低-增加的趨勢；移栽后50 d時，SOD活性隨Zn濃度增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。而POD則與之相反。移栽后50 d時，450 mg·kg-1Pb及20 mg·kg-1Zn復(fù)合處理下，煙葉SOD活性最高，比對照增加19%；750 mg·kg-1Pb及100 mg·kg-1Zn復(fù)合處理下，煙葉POD活性最高，比對照增加了71.4%。

2.3 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉NR活性的影響

由圖3可知，在Pb、Zn單獨處理時，煙葉NR活性均隨Pb或Zn濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢。450 mg·kg-1Pb單一作用下，煙葉NR活性較高，移栽后30和50 d時，分別比對照增加24.7%和18.9%；60 mg·kg-1Zn單一作用下，煙葉NR活性較高，移栽后30和50 d時，分別比對照增加19.8%和53.9%。隨著Zn濃度增加，中低濃度(150及450 mg·kg-1)Pb復(fù)合Zn處理下，煙葉NR活性表現(xiàn)為先增后減，而750 mg·kg-1Pb復(fù)合Zn處理則呈增加-降低-增加的趨勢。2個生長時期，450 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn復(fù)合處理下，煙葉NR活性最高，分別比對照增加119.3%(移栽后30 d)和102.1%(移栽后50 d)。

圖2 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉SOD和POD活性的影響Fig.2 Combination effect of Pb and Zn on SOD and POD activity in tobacco leaf

圖3 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉NR活性的影響Fig.3 Combination effect of Pb and Zn on NR activity in tobacco leaf

2.4 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可知，單一Pb處理下，移栽后30 d時，煙葉蛋白質(zhì)含量隨Pb濃度增加呈先增后降趨勢;而移栽后50 d時，煙葉蛋白質(zhì)含量則隨Pb濃度增加而增加。單一Zn濃度為60 mg·kg-1時，煙葉蛋白質(zhì)含量最高，分別比對照增加10.4%(移栽后30 d)、43.4%(移栽后50 d)。中低濃度Pb復(fù)合Zn處理下，煙葉蛋白質(zhì)含量隨Zn濃度增加，呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢；高濃度Pb復(fù)合Zn處理下，煙葉蛋白質(zhì)含量隨Zn濃度增加呈現(xiàn)增加-降低-增加趨勢。

2.5 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉蔗糖酶活性和可溶性糖含量的影響

由圖5可知，在Pb、Zn單獨處理時，煙葉蔗糖酶活性及可溶性糖含量隨金屬離子濃度的增加呈現(xiàn)低促高抑的變化趨勢。復(fù)合作用下，隨Zn濃度增加，中低濃度Pb處理煙葉的蔗糖酶活性大體呈先增后降變化，高濃度Pb處理的蔗糖酶活性呈增加趨勢。移栽后30 d時，150和750 mg·kg-1Pb處理的煙葉可溶性糖含量隨Zn濃度增加呈增加-減少-增加的變化；450 mg·kg-1Pb處理煙葉的可溶性糖含量隨Zn濃度增加呈先增后降的變化。移栽后50 d時，各濃度Pb處理的煙葉可溶性糖含量均隨Zn濃度增加而增加。移栽后30 d時，煙葉可溶性糖最高值在450 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn復(fù)合處理下出現(xiàn)，比對照增加43.4%；移栽后50 d時，煙葉可溶性糖最高值在750 mg·kg-1Pb及100 mg·kg-1Zn復(fù)合處理下出現(xiàn)，比對照增加74.2%。

圖4 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Combination effect of Pb and Zn on protein content in tobacco leaf

圖5 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉蔗糖酶活性和可溶性糖含量的影響Fig.5 Combination effect of Pb and Zn on sucrose activity and soluble sugar content in tobacco leaf

2.6 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉抗氧化酶、碳氮代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

從表1可以看出，Pb對煙葉抗氧化和碳氮代謝指標(biāo)均有極顯著影響(P<0.01)；而Zn對SOD活性影響不顯著。移栽后30 d時，Zn×Pb對煙草葉片的生理指標(biāo)都有顯著影響；但移栽后50 d時，Zn×Pb對SOD和POD活性無顯著影響。從方差和結(jié)果也可以看出，Pb對煙葉SOD和POD活性影響較大。隨著時間的累積，Pb對煙葉抗氧化指標(biāo)影響大于Zn、Pb×Zn；而Zn對于碳氮代謝指標(biāo)的影響比Pb、Pb×Zn處理大。

由表2可知，8個生理指標(biāo)逐步回歸方程的F檢驗均呈極顯著影響，線性關(guān)系成立。時間是SOD活性與蛋白質(zhì)含量的主要影響因素；除時間外，Pb為POD活性的主要影響因素，Zn是蔗糖酶的主要影響因素。Zn、Pb及時間對NR酶活性，MDA、脯氨酸及可溶性糖含量均影響極顯著。從線性方程的系數(shù)可以看出，Zn表現(xiàn)為激活蔗糖酶活性；Pb表現(xiàn)為對POD的激活作用；Zn、Pb皆能促進NR酶活性，使MDA、脯氨酸和可溶性糖含量增加。隨著時間的延長，POD和NR活性降低，脯氨酸含量減少。

表1 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉抗氧化酶、碳氮代謝影響的方差分析Table 1 Variance analysis of the combination effects of Pb and Zn on antioxidant enzyme, carbon-nitrogen metabolism in tobacco leaf

表2 Pb、Zn復(fù)合作用對煙葉抗氧化酶、碳氮代謝影響的線性分析Table 2 Linear analysis of the combination effects of Pb and Zn on antioxidant enzymes and carbon-nitrogen metabolism in tobacco leaf

3 討論

3.1 Pb、Zn復(fù)合作用對煙草抗氧化系統(tǒng)的影響

重金屬脅迫下，植物體內(nèi)的氧化還原平衡容易被打破。本研究中，單因素脅迫下，煙葉中MDA含量和脯氨酸含量均隨著Pb或Zn濃度的增加而增加，說明單一Pb、Zn脅迫會損傷煙苗的膜系統(tǒng)，同時脯氨酸增加對受脅迫植株產(chǎn)生保護作用，進一步減緩植株受傷害程度[21-22]。中低濃度Pb與 Zn復(fù)合處理表現(xiàn)為協(xié)同作用，煙葉MDA和脯氨酸含量隨Zn濃度增加而增加，對煙葉的傷害加大；但750 mg·kg-1Pb及100 mg·kg-1Zn復(fù)合處理下，表現(xiàn)為拮抗作用，煙葉MDA和脯氨酸含量降低。

重金屬濃度不同對植物抗氧化酶系統(tǒng)的影響程度也不同[23]。有研究表明，適度的Pb脅迫能促進植物的SOD和POD活性[24-25]；但阮亞男等[26]研究顯示，高濃度的Pb也會抑制煙草葉片愈傷組織中SOD活性。本研究中，單一Pb或Zn脅迫對煙葉SOD和POD活性均表現(xiàn)為低促高抑作用，與前人結(jié)果相似。張軍等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Zn、Pb復(fù)合污染會抑制黑麥草POD活性，而激活SOD活性。本研究條件下，Pb是煙葉POD活性的主要影響因素。中低濃度Pb(150、450 mg·kg-1)與Zn復(fù)合處理下，低濃度Zn能激活煙葉SOD和POD活性，高濃度Zn則抑制抗氧化酶活性；而高濃度Pb(750 mg·kg-1)與Zn復(fù)合處理下，SOD和POD的變化趨勢則相反。這說明在Pb、Zn交互作用中，酶活性并非單一重金屬影響之和，金屬離子濃度不同可表現(xiàn)為協(xié)同或拮抗作用。

3.2 Pb、Zn復(fù)合作用對煙草碳氮代謝的影響

植物在重金屬脅迫下，可以通過抗氧化酶消除重金屬產(chǎn)生的毒害，達到解毒的目的，一旦抗氧化系統(tǒng)無法抵抗重金屬脅迫，植物的碳氮代謝也隨之受到影響。NR是植物氮素同化的限速酶，是植物體最基本、最原始的氮代謝調(diào)控關(guān)鍵酶，其活性高低影響植物的氮水平[28]。煙草葉片NR活性和可溶性糖含量會隨土壤Pb濃度的增加先升高而后下降[29-30]，施Zn能夠提高煙草蛋白質(zhì)含量[31]。本研究也證實了，適量的單一Pb元素能提高煙葉中NR和蔗糖酶活性，增加蛋白質(zhì)含量和可溶性糖含量。而Pb、Zn復(fù)合污染對煙葉碳氮代謝的影響則與抗氧化酶相一致，即適宜濃度的Pb、Zn復(fù)合產(chǎn)生拮抗作用，促進煙葉的碳氮代謝；Pb濃度過高、Zn濃度較低或Pb濃度較低、Zn濃度過高時，則會產(chǎn)生協(xié)同作用，抑制煙葉的碳氮代謝。從煙葉生長的2個時期來看，Zn主要起激活蔗糖酶活性作用，但是對蛋白質(zhì)含量的影響不如生長時間顯著。

綜上所述，單一Pb、Zn對煙草抗氧化酶活性及碳氮代謝具有低促高抑的作用。Pb、Zn復(fù)合處理下，金屬濃度不同表現(xiàn)為協(xié)同或拮抗作用。