張來福，郭紹勇，盧承印，王孝輝*

(1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院，河南 洛陽 471002)

骨缺損在臨床中較為常見，多由創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除后造成，治療中常因手術(shù)創(chuàng)傷大、治療周期長、并發(fā)癥多等給醫(yī)患雙方帶來不少困擾[1]。MASQUELET等[2]最早報道利用膜誘導技術(shù)治療35例骨缺損，其中骨缺損最長25cm，效果良好。Masquelet技術(shù)操作相對簡便，適應(yīng)證廣泛，治療周期也不受骨缺損長度的限制，因此在臨床上得到了醫(yī)患雙方的青睞。對誘導膜的研究表明[3]，膜中包含血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)；其中VEGF和BMP-2可以促進骨髓干細胞的分化影響成骨過程，TGF-β1既可以影響VEGF的表達，也可以和VEGF共同影響血管的生成，誘導膜也具有一定的成骨特性。臨床發(fā)現(xiàn)，骨缺損修復(fù)的效果與誘導膜的活性有關(guān)，如何提高誘導膜質(zhì)量，增加生長因子的表達，提升誘導膜的活性，促進骨細胞的增殖分化，成為該技術(shù)需要解決的問題[4]。本院的內(nèi)部制劑特制接骨丸能促進骨折愈合，在治療骨折中后期延遲愈合或者不愈合方面具有良好效果。李陽陽等[5]報道，在脛骨橫向骨搬移中服用特制接骨丸能促進成骨及鈣化，加快骨缺損的修復(fù)。盧承印等[6]認為，特制接骨丸配合Masquelet技術(shù)能促進骨缺損的修復(fù)，可取得滿意療效。但特制接骨丸配合Masquelet技術(shù)的作用機制尚不清楚，其能否對形成的誘導膜中生長因子的表達產(chǎn)生影響尚不明確。因此本研究通過觀察特制接骨丸對誘導膜中VEGF、BMP-2、TGF-β1等生長因子表達的影響，來探索特制接骨丸配合Masquelet技術(shù)的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級3月齡雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量250～270 g，購自河南省動物實驗中心[實驗動物許可證號：SYXK(豫)2015-0001]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 實驗用藥與試劑

特制接骨丸[豫藥制字Z04030038，河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)]；抗生素骨水泥(美國強生有限公司)；青霉素鈉(華北制藥)；VEGF、TGF-β1、BMP-2抗體及抗體試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型制作 按隨機數(shù)字表法將48只大鼠分為空白組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4組，各12只。術(shù)區(qū)備皮，術(shù)前30 min注射青霉素鈉，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)消毒、鋪巾，在脛骨結(jié)節(jié)下縱向開長約1 cm的切口，暴露脛骨，電動擺鋸截骨5 mm左右，克氏針髓內(nèi)固定，骨缺損區(qū)用抗生素骨水泥填充，完全凝固后清洗縫合傷口。術(shù)后青霉素鈉腹腔注射3 d。

1.3.2 灌藥方法 將特制接骨丸與蒸餾水按不同比例混合，參照特制接骨丸(9 g/粒)的服用劑量，根據(jù)人與大鼠等效劑量的體表面積計算，得出大鼠的等效劑量為1.62 g/(kg·d)。低劑量組給予特制接骨丸1.62 g/(kg·d)，中劑量組給予4.86 g/(kg·d)，高劑量組給予14.5 8g/(kg·d)，空白對照組給予等量蒸餾水對照。術(shù)后第2天灌胃給藥，1次/d，連續(xù)4周。

1.3.3 樣本收集檢測 于原切口切開，暴露抗生素骨水泥區(qū)，骨水泥表面可見一層紅潤透明狀膜，切取膜組織，混合蛋白酶抑制劑和磷酸鹽緩沖液，放入膜組織并用離心機以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定，觀察VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達。

2 結(jié)果

2.1 模型制作

本研究所用抗生素骨水泥填塞大鼠骨缺損模型制作成功，飲食正常，大鼠傷口甲級愈合，健康存活至實驗結(jié)束，期間未出現(xiàn)大鼠死亡病例。模型制作情況見圖1。

圖1 抗生素骨水泥填塞大鼠骨缺損模型

2.2 實驗各組VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達測定結(jié)果比較

給藥4周后，對各組誘導膜中VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達測定結(jié)果進行組間比較，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。結(jié)果顯示，實驗組VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達均高于空白組，且高劑量組表達最明顯、中劑量組相對較弱、低劑量組次之，差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。見表1-表3和圖2-圖4。

表1 各組誘導膜中VEGF指標比較

表2 各組誘導膜中BMP-2指標比較

表3 各組誘導膜中TGF-β1指標比較

注：紅色箭頭所指的藍色部分為細胞核，黃色箭頭所指的棕色部分為陽性表達

注：紅色箭頭所指的藍色部分為細胞核，黃色箭頭所指的棕色部分為陽性表達

注：紅色箭頭所指的藍色部分為細胞核，黃色箭頭所指的棕色部分為陽性表達

3 討論

臨床治療骨缺損時，Masquelet技術(shù)具有適應(yīng)證廣泛、操作簡單且治療周期不受骨缺損長度限制等優(yōu)勢，為醫(yī)患雙方所接受[7]。Masquelet技術(shù)分兩步，第一階段：骨缺損區(qū)清創(chuàng)徹底，植入抗生素骨水泥混合物，誘導形成纖維膜；第二階段：數(shù)周后，骨水泥周圍形成類骨膜的纖維膜，切開纖維膜，完全去除骨水泥，在膜內(nèi)植入適量自體骨，固定數(shù)周，促進新骨生成，修復(fù)骨缺損。誘導膜具有類骨膜的生物學特性和獨特的結(jié)構(gòu)特征，含有豐富的血管網(wǎng)，并且包含VEGF、BMP-2、TGF-β1等多種生長因子。研究證實[8]誘導膜中成骨因子的表達在4～6周達到峰值，為了避免藥物加速誘導膜中成骨因子達到峰值而影響結(jié)果，本研究選擇在骨水泥植入后的第4周對各組誘導膜中成骨因子表達含量進行測定。

在本研究中，高劑量組中的VEGF、TGF-β1、BMP-2因子表達最多，中劑量組、低劑量組、空白組的表達依次減少，且各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義?，F(xiàn)代研究證實[9]，VEGF是血管生成中的重要生成因子，可與血管內(nèi)皮細胞的特異性受體結(jié)合，積極調(diào)控血管的生成過程。由于骨的高度血管化，VEGF在骨修復(fù)和再生中也起著重要作用，研究表明成骨細胞中VEGF水平可以為骨修復(fù)和再生提供基礎(chǔ)[10-12]。VEGF在整個成骨過程中有持續(xù)表達[13]，用能緩慢釋放VEGF的材料可以更好地促進骨修復(fù)[14]。TGF-β1是存儲在骨組織中最豐富的生長因子之一，能有效調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖分化及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，通過刺激干細胞的增殖分化，加速成骨細胞的增殖，進而誘導膜內(nèi)成骨以及軟骨內(nèi)成骨[15]。BMP-2是轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員，是參加軟骨再生的主要軟骨生長因子，誘導各種類型干細胞中的軟骨形成分化及成骨的骨化[16]，既可以通過調(diào)控骨細胞中的VEGF表達，生成血管，也可以激活Smad蛋白的信號通路，促進骨髓基質(zhì)細胞分化成骨細胞[17-18]。研究顯示[19]，BMP-2可增加VEGF的表達，并結(jié)合作用于成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞中，加速血管化和成骨化。誘導膜中的成骨細胞和生長因子的表達水平能影響骨細胞的增殖和骨折愈合時間，是促進移植骨形成新骨、修復(fù)骨缺損的關(guān)鍵因素之一[20]。

《素問·陰陽應(yīng)象大論篇》曰：“腎生骨髓，在體為骨?！币虼丝蓮难a腎強骨論治骨折或骨折不愈合。特制接骨丸，是全國名老中醫(yī)毛天東主任醫(yī)師總結(jié)出的專用于骨折中后期延遲愈合或不愈合的方劑，具有益肝腎、理氣血、強筋骨、壯元陽、填精髓的功效。方藥由黃芪、骨碎補、紅參、鹿茸、白術(shù)、山藥、杜仲、地龍、枸杞、茯苓、續(xù)斷、自然銅、三七、土鱉蟲14味中藥組成。骨折后期氣血、肝腎虧虛，治療當以補為要，方中黃芪、骨碎補為君，補氣養(yǎng)血、補腎強骨；紅參、自然銅為臣，益氣攝血、續(xù)筋接骨；佐余下諸藥以養(yǎng)氣血、補肝腎、續(xù)筋接骨。杜貴強等[21]通過對98例骨折患者進行對比治療研究，證實特制接骨丸能有效促進骨折愈合，縮短愈合周期。而特制接骨丸對于誘導膜的作用未見報道，為此我們選擇特制接骨丸進行干預(yù)Masquelet技術(shù)中誘導膜的形成實驗，以揭示特制接骨丸對誘導膜中成骨因子表達的影響。

本研究結(jié)果表明，特制接骨丸能促進誘導膜中VEGF、TGF-β1、BMP-2成骨因子的表達，且表達水平與特制接骨丸的劑量成正相關(guān)。但是，本研究僅從誘導膜生長因子表達的情況進行分析，其在二期植骨術(shù)后對骨愈合的影響效果尚需要進一步證實。