王鄭通 楊華巍

(中法歐亞森林入侵生物聯(lián)合實驗室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) (江蘇省太倉海關(guān)口岸生物安全防控實驗室)

李碧鷹 任利利 石娟

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院) (中法歐亞森林入侵生物聯(lián)合實驗室(北京林業(yè)大學(xué)))

隨著國際經(jīng)濟一體化進程的加快，林業(yè)生物入侵形勢愈發(fā)嚴峻。林業(yè)入侵物種對森林資源、物種多樣性、生態(tài)環(huán)境以及經(jīng)濟安全造成了嚴重損害，防控入侵生物已成為全球的重大課題之一。

松樹蜂(Sirexnoctilio)隸屬于膜翅目(Hymenoptera)樹蜂科(Siricidae)樹蜂屬(Sirex)，原產(chǎn)于歐亞大陸和北非，是林業(yè)上十分重要的害蟲，也是國際重大檢疫性害蟲，先后入侵大洋洲、南北美洲和非洲的諸多國家，主要危害松屬(Pinus)、冷杉屬(Abies)等針葉樹種，對當?shù)卦斐芍卮蟮纳鷳B(tài)、經(jīng)濟損失[1-3]。松樹蜂雌性成蟲體內(nèi)專門制造昆蟲毒素的腺體被稱為毒素腺，毒素腺分泌的毒素儲存在一個被稱為毒素囊的器官內(nèi)，在松樹蜂產(chǎn)卵時與卵一起通過產(chǎn)卵器注入寄主松樹中[4]。毒素可降低松樹的抗性，為松樹蜂卵的發(fā)育提供條件，另外毒素也能促進松樹蜂體內(nèi)攜帶的一種共生真菌的生長[5]。研究表明，膜翅目昆蟲的毒素是一種含有多種小分子質(zhì)量物質(zhì)和生物活性多肽的極其復(fù)雜的混合物，通過活性測定、基因序列比對分析及蛋白質(zhì)組等方法，數(shù)余種酶類和毒素蛋白已被成功鑒定[6]。早期的研究學(xué)者指出松樹蜂毒素是一種由黏多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的呈酸性的混合物，含有多種酶、活性多肽和其他小分子質(zhì)量物質(zhì)[7]，但沒有對其成分做進一步分析。以往的研究對象主要集中在跟人類健康密切相關(guān)且有重大經(jīng)濟價值的種屬，如蜜蜂科(Apidae)和胡蜂科(Vespidae)上，而對植物性寄生的樹蜂毒素研究較少。

自2013年松樹蜂入侵我國以來，有關(guān)其毒素腺的生理結(jié)構(gòu)和毒素溶液有效成分的分析尚未見報道。鑒于此，筆者通過對松樹蜂雌成蟲腹部的解剖與觀察，找到毒素囊和毒素腺的位置并分離提純獲得毒素溶液，同時，對松樹蜂毒素腺的結(jié)構(gòu)及其功能進行了分析。最后，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀得出GC-MS譜圖，分析得到毒液各有效成分的種類，以期為明確松樹蜂毒素的作用原理及了解松樹蜂的致病機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 松樹蜂雌成蟲的解剖

試驗所用蟲體均來源于前期在各蟲源地(黑龍江省杜蒙縣、黑龍江省鶴崗市、內(nèi)蒙古通遼市)采集的樟子松受害木段，待雌性成蟲羽化后，放置冰箱中4 ℃保存待測，所有活蟲試驗均在北京林業(yè)大學(xué)植物檢疫實驗室內(nèi)完成。

將待測松樹蜂雌成蟲取出后，用沾有體積分數(shù)96%酒精的小毛刷輕輕擦拭蟲體進行消毒，并對解剖鏡臺面和解剖過程中使用的手術(shù)剪和昆蟲針等實驗用具進行消毒。用昆蟲針將雌蟲固定在蠟盤內(nèi)，蟲體背面朝上，放置在解剖鏡(Lecia M205C,Germany)臺面上，放大15～20倍。將手術(shù)剪的尖端輕輕插入蟲體第8和第9腹板的結(jié)合處，剪斷第8腹板，并順著向上依次剪斷第7至第2腹板；用昆蟲針將剪斷的腹板向兩側(cè)挑開并固定在蠟盤上；將背板下方的脂肪、肌肉以及結(jié)締組織用昆蟲針剔除干凈；最后，將1對卵巢分開并撥向兩側(cè)，觀察雌成蟲內(nèi)部的組織和器官。

1.2 松樹蜂毒素成分分析

1.2.1 毒素溶液的制備

在完成了對松樹蜂雌成蟲腹部的解剖和貯菌囊的分離之后，用昆蟲針將毒素腺和毒素囊一一挑出，隨后立即裝入1.5 mL的滅菌離心管并在-80 ℃保存，以備后用。毒素溶液的制備參考Bordeaux的方法[8]，將收集到的10頭雌蟲的毒素腺體和毒素囊集中在一起，稱質(zhì)量，加去離子水，用勻漿器(組織研磨器)研磨至懸濁液狀態(tài)，稀釋至20 g·L-1，17 000g離心8 min，取上清液，分裝至1.5 mL滅菌離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品預(yù)處理

以吳晨等[9]的方法對毒素溶液樣品分別進行預(yù)處理。蛋白樣品使用氨水萃取，萃取后蛋白質(zhì)完全溶解于氨水，加入蛋白酶水解或5～10倍的體積分數(shù)20% HCl煮沸回流16～20 h，或加壓于120 ℃水解12 h，將蛋白質(zhì)水解成氨基酸。利用N-甲基-N-特丁基二甲硅烷基三氟乙酰胺(MTBSTFA)或N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)對水解產(chǎn)物進行硅烷化衍生，以降低水解產(chǎn)物的極性和氣化溫度，增加其化學(xué)穩(wěn)定性。脂類樣品使用乙醚、丙酮等有機溶劑萃取，萃取后使用KOH的甲醇溶液進行皂化甲酯化處理，水解產(chǎn)物經(jīng)萃取，酸化等處理，使用MTBSTFA、BSTFA等試劑衍生。多糖類樣品使用酸性水解試劑(三氟乙酸(TFA))水解，水解產(chǎn)物經(jīng)離心沉淀過濾后，采用三甲基硅烷化和乙?；苌?。

1.2.3 分析條件

采用賽默飛世爾TRACE ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；HP-5色譜柱(30.00 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm)；進樣口溫度230 ℃，分流比1∶1，分流流量1 mL·min-1，F(xiàn)ID檢測器溫度290 ℃；升溫程序：初溫50 ℃，保持0 min，然后10 ℃·min-1，到280 ℃，保持7 min；空氣壓力52 kPa，載氣(高純氮氣)；總流速5 mL·min-1，吹掃流速3 mL·min-1；進樣量1 mL[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 松樹蜂毒腺的解剖結(jié)構(gòu)

解剖結(jié)果顯示了松樹蜂雌成蟲內(nèi)部生殖系統(tǒng)的組織構(gòu)造和結(jié)構(gòu)特點以及貯菌囊(圖1a，松樹蜂雌性成蟲體內(nèi)貯藏共生真菌的囊狀器官)、腹神經(jīng)節(jié)(圖1b)、毒素腺(圖1c)和毒素囊(圖1d)等重要組織和器官的分布位置。進一步觀察發(fā)現(xiàn)：毒素腺位于產(chǎn)卵器(圖1e)基部，為體積較小的腺體組織。毒素囊也位于產(chǎn)卵器基部附近的位置，與毒素腺相鄰。與其他組織和器官相比，毒素囊占據(jù)了雌蟲腹部相當大的空間，呈淡黃透明色，類似米粒大小的球狀晶體，肉眼可見，毒素囊通過管狀組織和松樹蜂中輸卵管相連成為雌蟲生殖系統(tǒng)的一部分。值得注意的是松樹蜂體內(nèi)的管狀組織將松樹蜂的貯菌囊、毒素囊和生殖系統(tǒng)緊密地聯(lián)系在一起，形成了一個類似“三通管”的結(jié)構(gòu)，貯菌囊、毒素囊和卵巢(圖1f)位于“三通管”的3個分支方向，3個分支最終匯集到中輸卵管。這種組織結(jié)構(gòu)方式保證了松樹蜂雌蟲在產(chǎn)卵時能夠?qū)⒙殉仓械穆?、貯菌囊貯藏的共生菌菌絲片段(分節(jié)孢子)和毒素囊中的毒素一起注入寄主體內(nèi)。

a.貯菌囊；b.腹神經(jīng)節(jié)；c.毒素腺；d.毒素囊；e.產(chǎn)卵器；f.卵巢。(參照文獻[12])。

2.2 松樹蜂毒素成分

通過裂解氣相色譜質(zhì)譜試驗，得到松樹蜂毒素樣品裂解氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀譜圖，其結(jié)果見圖2。

通過氣相色譜質(zhì)譜試驗，得到松樹蜂毒素樣品的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀譜圖，其結(jié)果見表1。

圖2 松樹蜂毒素樣品裂解氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀譜圖

由圖2、表1可見，松樹蜂毒素中共檢測出了42種物質(zhì)，其中，離子豐度相對比較高的6種物質(zhì)的保留時間分別為1.183、1.974、2.851、16.246、18.058、20.274 min，由氣象質(zhì)譜色譜試驗得到每個保留時間對應(yīng)峰的面積、基線高度、絕對高度、峰寬等數(shù)據(jù)，再查詢NIST標準質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)庫，通過譜峰數(shù)據(jù)，檢索相似譜圖，得到豐度較高的每個峰對應(yīng)的化合物的匹配項名稱、質(zhì)量、分子質(zhì)量、CAS號等相關(guān)信息。

經(jīng)整理和歸類得知，松樹蜂毒素主要由各種酸、酯、醇、烯、酮以及它們的同分異構(gòu)體及順反異構(gòu)體組成，可歸納成生物堿、糖及糖苷、脂肪酸和蛋白質(zhì)四大類，主要組成元素有碳、氫、氧、氮、硫、氟等，物質(zhì)相對分子質(zhì)量為80～500。脂肪酸包括棕櫚酸、丁二酸、十四碳烯酸、十六碳烯酸、十八烷酸、十八碳烯酸、乙酸、油酸、辛酸等，大部分為碳原子較多的中鏈和長鏈脂肪酸，且多為含雙鍵的不飽和脂肪酸，脂肪酸物質(zhì)在毒素成分中占57.9%，含量最多，為組成松樹蜂毒素的主要物質(zhì)。糖及糖苷類物質(zhì)在松樹蜂毒素成分中占28.7%。松樹蜂毒素中的糖類物質(zhì)和脂肪酸類物質(zhì)作為其主要的組成物質(zhì)，占毒素成分的比例較大。

表1 松樹峰毒素樣品氣相質(zhì)譜色譜峰主要對應(yīng)化合物

續(xù)(表1)

生物堿和蛋白質(zhì)類物質(zhì)雖然在毒素中含量較少，分別占5.1%和8.3%，但其作為具有生物活性的物質(zhì)存在于毒素中，與松樹蜂毒素對寄主樹木的致病性有很大的關(guān)系。生物堿主要包含一些氮雜縮醛類、烯胺、亞胺及一些氮氧化物，蛋白質(zhì)主要以多肽和酶的形式存在，包括磷脂酶、蛋白酶、肽酶、酯酶等水解酶，催化底物結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化反應(yīng)的順反異構(gòu)酶，以及一些常見的氧化還原酶。

3 結(jié)論與討論

與其他組織和器官相比，松樹蜂的毒素囊占據(jù)了雌蟲腹部相當大的空間，以便于松樹蜂貯存盡量多的毒素，其貯菌囊、毒素囊和卵巢形成的“三通管”的結(jié)構(gòu)充分體現(xiàn)了其結(jié)構(gòu)與功能的高度統(tǒng)一性。據(jù)文獻報道，寄生性膜翅目昆蟲的泌毒器官起源于外胚層，由生殖系統(tǒng)的附腺演化而來，其毒液由成熟雌蜂的毒腺或酸腺所分泌，并貯于毒囊中[13]。因此，松樹蜂雌成蟲毒素腺與輸卵管相連的結(jié)構(gòu)可以說明松樹蜂的毒素腺和毒素囊符合進化演變的規(guī)律，和蜜蜂等蜂毒素在體內(nèi)的分泌和貯藏器官發(fā)育來源一致。

研究表明，中華蜜蜂(Apisceranacerana)分泌的報警信息素中主要成分是乙酸異戊酯和乙酸芐酯，還包括乙酸正丁酯、乙酸正已酯、乙酸正辛酯、乙酸正癸酯、乙酸苯酯、乙酸二十酯、辛酸等20余種成份，同時，有關(guān)寄生性膜翅目昆蟲毒素的研究中指出已知膜翅目昆蟲毒素中含有烴類、醇類、醛類、酮類、羧酸類、酯類、內(nèi)酯類、酶類等多種化合物[13-14]。因此，松樹蜂毒素中含脂肪酸這一現(xiàn)象基本符合膜翅目昆蟲毒素的演化規(guī)律。

漆酶是多酚氧化酶中最重要的一種酶，本課題組前期高成龍通過對松樹蜂毒腺進行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出11條漆酶基因[15]，同時，李大鵬等[5]通過以ABTS為底物測定的方法檢測到了松樹蜂毒素內(nèi)漆酶的存在[5]，由此可以得出松樹蜂毒素成分中包含漆酶這一結(jié)論。李大鵬等[5]在研究中證實了松樹蜂毒素能夠顯著地促進共生真菌A.areolatum漆酶的分泌并提高其漆酶活力，這與松樹蜂毒素中包含漆酶這一結(jié)論相符，并進一步證明了松樹蜂的共生菌和毒素在危害寄主樹木時存在的協(xié)同關(guān)系。

李玉梅等在對蜜蜂毒素的研究中指出，蜜蜂毒中含有蜂毒素、蜂毒神經(jīng)肽、磷脂酶、透明質(zhì)酸酶、組織胺、碳水化合物等多種復(fù)雜成分，且具有很高的生物活性[16]，與本研究中對毒素蛋白質(zhì)的研究結(jié)果基本一致。由于酶的生物活性極高，可猜測在松樹蜂毒素中蛋白質(zhì)可能是對寄主樹木造成傷害的主要活性物質(zhì)。早期的研究學(xué)者指出松樹蜂毒素是一種由黏多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的呈酸性的混合物，含有多種酶、活性多肽和其他小分子量物質(zhì)[17]，有研究者利用化學(xué)成分分離技術(shù)結(jié)合生理試驗，證實毒素混合物中的一種具有生物活性的多肽是引起寄主受害癥狀出現(xiàn)的關(guān)鍵因子，接種該活性多肽的供試枝條出現(xiàn)了萎蔫、失綠變黃等典型癥狀[8]，也說明松樹蜂毒素中主要的活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)。

生物堿是一類含氮的堿性有機化合物，有顯著的生物活性，一般以鹽類、苷類、酰胺類、N-氧化物等形式存在于自然界植物或動物中，研究發(fā)現(xiàn)某種在植物中廣泛存在的吡咯里西啶類生物堿，以及山豆根(Euchrestajaponica)中的苦參堿和氧化苦參堿等多種生物堿對生物機體均具有明確的毒性作用[18-20]。但目前為止對昆蟲尤其是膜翅目昆蟲體內(nèi)含有的生物堿的文獻和相關(guān)報導(dǎo)還較少，且松樹蜂毒素中的生物堿含量相對來說最少，對于它是否是導(dǎo)致寄主松樹出現(xiàn)針葉枯黃、萎蔫等現(xiàn)象的原因，以及它的致病機制還需要進一步的深入研究。

劉嶺等[21]選用單一流動相，采用不同規(guī)格的Sephadex凝膠柱分3步對蜂毒素進行分離提純，洗脫速度適中，純化過程較省時，經(jīng)高效液相色譜法進行含量測定，證實分離所得的蜂毒素具較高的純度。徐彭等[22]利用蜂毒肽(蜂毒素)的油水兩親性和其分子結(jié)構(gòu)中不含巰基及雙巰鍵，對蜂毒素進行溶酶萃取和化學(xué)裂解處理，同時利用其在濃度高時常以四聚體形式存在的特性，采用在含4 mol·L-1脲(使蜂毒肽的四聚體解散)與不含4 mol·L-1脲的2種不同情況的緩沖液系統(tǒng)中，進行凝膠過濾柱層析，所獲產(chǎn)品的純度和得率均較高。本研究中，松樹蜂毒素由于直接從解剖的毒素囊中獲得，雜質(zhì)較少，純度較高，該方法可為松樹蜂毒素中蛋白質(zhì)中多肽和氨基酸等活性物質(zhì)的分離提純提供思路，也可從松樹蜂基因表達量和毒素腺轉(zhuǎn)錄組分析等分子生物學(xué)方面進一步探討多肽的作用機制，為接下來對毒素的研究打下基礎(chǔ)。相比于其他成分檢測方法，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有進樣量少、靈敏度高、分離性好、分析速度快、檢出限低等優(yōu)點，但操作比較復(fù)雜。為提高試驗過程的操作性和安全性，可以從樣品的預(yù)處理、干擾雜質(zhì)的排除、色譜柱類型的選擇以及升溫程序的優(yōu)化等方面對檢測方法加以改善，以助于試驗更順利的進行。