白淼，王艦,2,3,4,5，王芳,2,3,4,5*

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，青海 西寧 810016；3.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；4.青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；5.青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬于茄科茄屬類農(nóng)作物[1]，起源于南美洲安第斯山，為一年生雙子葉植物。在西方國家馬鈴薯有“地下蘋果”“第二面包”和“長壽食品”之稱[2]，現(xiàn)已成為世界第四大糧食作物[3]，也是我國重要的蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物[4]。

馬鈴薯栽培種喜冷涼環(huán)境，但不耐霜凍。低溫會對馬鈴薯植株的生長造成很大的危害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致大面積減產(chǎn)，甚至絕收[5]。門福義等[6]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度低于7 ℃后，馬鈴薯植株就會停止生長，溫度低于-3 ℃時(shí)就會導(dǎo)致植株凍死。當(dāng)溫度在12 ℃以下時(shí)，馬鈴薯植株不開花，僅形成花芽；當(dāng)溫度達(dá)到16 ℃以上，植株才可以正常開花[7]。低溫不僅會抑制植株的生長發(fā)育，還會影響植株的光合作用。李飛[8]發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯栽培品種在幼苗時(shí)期遭受低溫凍害時(shí)葉片受到損傷并停止生長，導(dǎo)致光合作用受阻，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量，甚至?xí)斐山^收。低溫對植物的生理指標(biāo)也會產(chǎn)生一定的影響。吳雁斌等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在4 ℃時(shí)，隴薯3號和隴薯6號試管苗的丙二醛、游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)、POD、CAT活性上升，可溶性蛋白、葉綠素含量降低，以此來適應(yīng)和抵御低溫脅迫。楊超英[10]研究發(fā)現(xiàn)，在冷馴化期間，馬鈴薯幼苗體內(nèi)的脯氨酸含量總體呈上升趨勢；不同馬鈴薯品種體內(nèi)的SOD活性也不同，耐凍性強(qiáng)的品種比耐凍性弱的品種體內(nèi)SOD活性強(qiáng)，脯氨酸含量的變化和SOD活性可作為鑒定不同馬鈴薯品種耐凍性的評價(jià)指標(biāo)。李飛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在冷馴化期間耐凍品種和中薯3號葉片內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白含量均有所升高。王華等[12]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，SOD、POD、CAT 活性隨溫度的降低總體上呈先升高后降低的趨勢，表明酶活性隨外界環(huán)境變化而變化。陳巧巧[13]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，馬鈴薯葉片MDA含量總體呈增加趨勢；在施加外源蔗糖后，MDA含量降低，在一定程度上減輕了膜的氧化作用。

本研究以馬鈴薯品種DR-2和費(fèi)烏瑞它組培苗為試驗(yàn)材料對其進(jìn)行低溫脅迫，測定馬鈴薯組培苗中的SOD活性、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、總蛋白等生理指標(biāo)含量的變化，對其進(jìn)行相關(guān)性分析，鑒別各指標(biāo)之間的相關(guān)性；運(yùn)用隸屬函數(shù)法對馬鈴薯抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)，為馬鈴薯抗寒性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它和DR-2組培苗，由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

參照楊超英[10]方法并略作改動，將費(fèi)烏瑞它和DR-2組培苗在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，選取生長良好、長勢一致的組培苗用于試驗(yàn)。對照組轉(zhuǎn)入人工氣候培養(yǎng)箱中，氣候箱溫度為白天20 ℃、晚上18 ℃，光照強(qiáng)度為10 000 lx，光照時(shí)間為12 h。處理組進(jìn)行低溫脅迫處理，溫度為4 ℃[11]，光照強(qiáng)度為10 000 lx，光照時(shí)間為12 h，設(shè)置3次重復(fù)。分別處理0、1、3、5、7 d后，在相應(yīng)處理時(shí)間下取馬鈴薯組培苗，整株混勻后放入1.5 mL離心管中，用于測定不同處理下的生理指標(biāo)。

1.2.2 測定指標(biāo)及方法

SOD活性、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均采用南京建成試劑盒測定，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，濃硫酸(分析純)由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，利用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對馬鈴薯組培苗生理指標(biāo)的影響

2.1.1 可溶性糖含量

從圖1可看出，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，DR-2和費(fèi)烏瑞它組培苗中可溶性糖含量呈先增加后降低的變化趨勢。其中，DR-2可溶性糖含量的峰值出現(xiàn)在第5天，達(dá)23.54 mg·g-1；費(fèi)烏瑞它可溶性糖含量的峰值出現(xiàn)在第3天，達(dá)23.54 mg·g-1。不同脅迫時(shí)間下的費(fèi)烏瑞它可溶性糖含量間存在顯著性差異。除脅迫第3天外，DR-2的可溶性糖含量均高于費(fèi)烏瑞它。

同品種柱間無相同小寫字母表示脅迫時(shí)間組間存在顯著差異(P<0.05)。圖2～5同。

2.1.2 可溶性蛋白含量

從圖2可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長，DR-2和費(fèi)烏瑞它組培苗中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中，DR-2各處理之間可溶性蛋白含量存在顯著性差異；費(fèi)烏瑞它在脅迫第0和第3天的可溶性蛋白含量沒有顯著差異，在第5天突然升高，與第3天形成顯著差異，第7天仍維持較高水平。2個(gè)馬鈴薯品種可溶性蛋白含量的峰值均出現(xiàn)在第5天，其中DR-2含量達(dá)7.53 μg·g-1，費(fèi)烏瑞它含量達(dá)15.26 μg·g-1，均顯著高于對照組。

圖2 低溫脅迫下馬鈴薯組織中可溶性蛋白含量的變化

2.1.3 游離脯氨酸含量

從圖3可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長，DR-2和費(fèi)烏瑞它組培苗中游離脯氨酸含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，DR-2組培苗組織中游離脯氨酸含量的峰值出現(xiàn)在第5天，達(dá)354.24 μg·g-1；費(fèi)烏瑞它的峰值出現(xiàn)在第3天，達(dá)163.00 μg·g-1。在不同脅迫時(shí)間下，2個(gè)品種游離脯氨酸含量均存在顯著性差異；在同一脅迫天數(shù)下，DR-2中游離脯氨酸含量明顯高于費(fèi)烏瑞它。相比脅迫0 d的對照，2個(gè)馬鈴薯品種在受到脅迫后，脯氨酸含量明顯增加。

圖3 低溫脅迫下馬鈴薯組織中脯氨酸含量的變化

2.1.4 SOD活性

從圖4可以看出，2個(gè)馬鈴薯品種組培苗中SOD活性變化趨勢有所不同。隨著脅迫時(shí)間的延長，DR-2組培苗SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，峰值出現(xiàn)在第1天，含量達(dá)到847.35 U·g-1，SOD活性相比對照明顯增加。費(fèi)烏瑞它組培苗SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低再升高又降低的趨勢，總體上SOD活性相比對照變化不大。在不同脅迫天數(shù)下，2個(gè)品種SOD活性存在顯著性差異。

圖4 低溫脅迫下馬鈴薯組織中SOD活性的變化

2.1.5 總蛋白濃度

從圖5可以看出，隨著脅迫天數(shù)的增加，DR-2和費(fèi)烏瑞它組培苗中總蛋白濃度均呈下降趨勢，且均存在顯著性差異。在脅迫初期，2個(gè)馬鈴薯品種總蛋白濃度均下降明顯；隨著脅迫時(shí)間的延長，總蛋白濃度降幅減緩，在脅迫第7天時(shí)，2個(gè)馬鈴薯品種間濃度相差不大。

圖5 低溫脅迫下馬鈴薯組織中蛋白質(zhì)濃度的變化

2.2 馬鈴薯生理指標(biāo)之間的相關(guān)性

由表1可以看出，可溶性糖含量與脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.741，與總蛋白濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.487；可溶性蛋白含量與總蛋白濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.697；其余指標(biāo)之間相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。

表1 低溫脅迫下馬鈴薯各生理指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.3 馬鈴薯品種抗寒性綜合評價(jià)

隸屬函數(shù)法是一種廣泛應(yīng)用的植物抗逆性綜合評定法，參照楊金紅[14]的方法對2個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行抗寒性綜合評價(jià)。

若某指標(biāo)與抗寒性呈正相關(guān)，則X(u)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)；若某指標(biāo)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，則X(u)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。其中，X(u)是各指標(biāo)的隸屬度值；X是某指標(biāo)的測定值；Xmin是某指標(biāo)測定值中的最小值；Xmax是某指標(biāo)測定值中的最大值。用隸屬函數(shù)法評定時(shí)，各指標(biāo)隸屬函數(shù)值的平均值越大，則抗寒性越強(qiáng)。

由表2可以看出，馬鈴薯品種DR-2的隸屬度平均值大于費(fèi)烏瑞它，說明馬鈴薯品種DR-2的抗寒性高于費(fèi)烏瑞它。

表2 馬鈴薯品種抗寒性綜合評價(jià)

3 討論

低溫是植物所面臨的重要非生物脅迫，影響植物的生長發(fā)育。在低溫脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列生理響應(yīng)，在不同程度上保護(hù)植物的生長，當(dāng)脅迫程度超過植物抵御極限時(shí)，就會導(dǎo)致植物死亡[15]。植物在低溫環(huán)境中可以通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，保持細(xì)胞內(nèi)部滲透平衡，以此來抵御逆境傷害。研究表明，植物抗寒性的強(qiáng)弱與可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸的含量有關(guān)[16]。作為一種親水性強(qiáng)的蛋白,可溶性蛋白的增加可以提高細(xì)胞保水能力，從而減少原生質(zhì)結(jié)冰而導(dǎo)致的植物致死。研究表明，可溶性蛋白含量的增加與植物抗寒性呈正相關(guān)關(guān)系[17]；許娟等[18]研究表明，在低溫脅迫下，4個(gè)馬鈴薯品種苗期葉片可溶性蛋白含量總體上呈先上升后下降趨勢，峰值出現(xiàn)在第2～3天。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)馬鈴薯品種可溶性蛋白含量也呈先上升后下降趨勢，與其趨勢基本保持一致。

作為植物體內(nèi)重要的組成成分之一，糖類也是重要的營養(yǎng)物質(zhì)和貯存物質(zhì)。楊慧菊等[17]研究表明，馬鈴薯的抗寒性與其葉片中可溶性糖含量的積累有關(guān)；李飛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過冷馴化馬鈴薯葉片內(nèi)可溶性糖含量呈增加趨勢，其中耐凍野生馬鈴薯材料03079-435可溶性糖含量的增幅高于霜凍敏感的中薯3號。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的延長，馬鈴薯組織內(nèi)可溶性糖含量呈先增加后降低趨勢，但相比對照明顯增加，說明可溶性糖含量的增加與馬鈴薯的抗寒性存在一定關(guān)系，這與李飛的研究結(jié)果基本一致。

游離脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。脯氨酸含量的增加能夠提高細(xì)胞液濃度，有利于細(xì)胞保水，也可作為活性氧清除劑來增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD等酶的活性。研究認(rèn)為，馬鈴薯的抗寒性與植株體內(nèi)的脯氨酸含量有高度相關(guān)性，在低溫脅迫下，抗寒性強(qiáng)的馬鈴薯品種植株內(nèi)脯氨酸的含量越高[18-20]。在本試驗(yàn)中，低溫脅迫下馬鈴薯品種DR-2和費(fèi)烏瑞它組織內(nèi)脯氨酸含量呈先增加后降低趨勢，在脅迫第5～7天時(shí)，DR-2的脯氨酸含量顯著高于費(fèi)烏瑞它。

酶作為一種活性催化劑在生物體內(nèi)發(fā)揮作用，抗氧化酶系作為植物的主要防御酶系起到清除植物體內(nèi)的自由基作用。其中，超氧化物歧化酶(SOD)能夠催化超氧陰離子自由基(O2-)發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫，對植物體內(nèi)氧化和抗氧化平衡起著重要作用[21]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，費(fèi)烏瑞它組培苗組織中SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低再升高又降低的趨勢，2個(gè)馬鈴薯品種中SOD活性隨著脅迫時(shí)間的延長總體上也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢；當(dāng)?shù)蜏孛{迫進(jìn)行到第5天時(shí)，馬鈴薯品種DR-2和費(fèi)烏瑞它組織內(nèi)SOD含量分別是對照的2.8和1.0倍。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在脅迫后期(5～7 d)，DR-2的可溶性糖含量、游離脯氨酸含量和SOD活性均高于費(fèi)烏瑞它，這可能是DR-2的抗寒性高于費(fèi)烏瑞它的原因。

低溫脅迫下植物的抗性反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，僅靠酶活性或滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等單一指標(biāo)很難準(zhǔn)確評價(jià)馬鈴薯品種的抗寒性。主成分分析法、隸屬函數(shù)法等是常用植物抗逆性的綜合評價(jià)方法[14]。主成分分析法是通過降維的思想，將原來眾多指標(biāo)重新組合成一組新的互不相關(guān)的綜合指標(biāo)，使結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確。楊鳳翔等[22]通過此方法對不同草莓品種進(jìn)行抗寒性的綜合評價(jià)。隸屬函數(shù)法則是通過模糊數(shù)學(xué)原理進(jìn)行綜合評價(jià)的一種方法，已成功應(yīng)用于馬鈴薯[17,20]、石楠等[14]多種植物的抗性綜合評價(jià)。本試驗(yàn)采用隸屬函數(shù)法通過5個(gè)生理指標(biāo)對2個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行抗寒性綜合評價(jià)，使評價(jià)結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確。