李世民，鄭鑫華，段華超，董 瓊

（西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

【研究意義】樹頭菜（Crateva unilocalaris）是山柑科魚木屬的一種喬木，主要分布于東南亞及我國的廣東、廣西、云南等地區(qū)。云南石屏、建水等地取嫩葉鹽漬食用，故有樹頭菜之名[1]。樹頭菜營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素及各種礦物鹽類，且含量均高于常見栽培蔬菜[2-3]，還具清熱解毒、健胃以及舒筋活絡(luò)之功效[4]，并可做良好的行道綠化樹種，其生態(tài)效益顯著[4]。近年來由于生態(tài)環(huán)境的破壞，野生樹頭菜植物資源正在逐漸減少[5]。因此，亟需加大對樹頭菜繁育技術(shù)的研究，實(shí)現(xiàn)樹頭菜資源的擴(kuò)大和推廣利用，從而真正實(shí)現(xiàn)其資源的有效保護(hù)和合理利用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】扦插生根過程中可溶性糖、可溶性蛋白含量在整個(gè)過程中都發(fā)生各自的變化[6]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物體內(nèi)可溶性糖含量相對提高時(shí)，可顯著利于插穗生根[7-8]。生根劑處理能明顯提高馬尾松插穗基部可溶性糖的積累，促進(jìn)不定根的形成[9]。曹凡[10]和沈琪[11]認(rèn)為插穗不定根形成過程中，需要消耗大量的可溶性糖和可溶性蛋白，因此當(dāng)兩者含量提高時(shí)，有助于扦插生根。許多研究表明，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化與不定根的形成與發(fā)展有著密切的關(guān)系，但說法各異。POD 可以消除插穗體內(nèi)過多的內(nèi)源IAA，進(jìn)而影響插穗生根[12]。SOD 能有效清除超氧陰離子自由基，減輕對細(xì)胞膜的傷害，從而促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)，以及降低扦插后期插穗內(nèi)POD 活性，利于不定根的增多與伸長，從而使插穗形成完整的植株[13]。MDA 是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，對植物細(xì)胞具有毒害作用，其含量過高時(shí)導(dǎo)致植物插穗生根不良甚至萎蔫枯死[14-15]。因此，通過調(diào)控植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量及抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)活性變化來抑制插穗體內(nèi)毒害物質(zhì)水平，是提高插穗生根的有效途徑之一[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，樹頭菜扦插繁殖方面的報(bào)道多集中于基質(zhì)篩選、激素處理等對插穗生根的技術(shù)研究[17-19]，其插穗扦插生根與生理生化指標(biāo)的關(guān)系尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為此，本研究探討了ABT-1 對樹頭菜扦插生根的影響，以及生根過程中插穗生理生化指標(biāo)的變化，分析樹頭菜插穗生根過程，探尋樹頭菜的生根機(jī)制，為建立高效的樹頭菜扦插繁殖體系提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)樹木園（25°03'N，102°45'E），地處云貴高原中部。昆明屬山原地貌，海拔為1 954 m，年平均氣溫16.5 ℃，年均降雨量700～1 100 mm，降雨集中在6—9 月，無霜期278 d，屬于北亞熱帶低緯度半濕潤高原山地季風(fēng)性氣候。試驗(yàn)地土壤理化指標(biāo)，pH 5.45，總質(zhì)量1.26 g/cm3，總氮1.44 g/kg，總磷0.83 g/kg，總鉀8.82 g/kg，總鈣0.56 g/kg，鎂0.12 g/kg，鐵41.10 g/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

插穗來自云南省建水縣健壯無病蟲害株上一年生枝條，插穗上端切成表面光滑的平口，下端切成斜口，以株行距20 cm×20 cm直插，入土5 cm，外露1～2個(gè)芽眼。

ABT-1（1號(hào)生根粉），是作物的一種外源性生長調(diào)節(jié)劑，其有效成分為吲哚乙酸和萘乙酸，生根粉對于促進(jìn)作物的生根有著顯著的效果，因此，有著廣泛的應(yīng)用[20]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，參考鄭鑫華等[19]研究結(jié)果，用ABT-1 質(zhì)量濃度分別為50，100，150，0 mg/L（清水對照，CK）溶液浸泡插穗基部3 h，分別記為T1、T2、T3、T4 處理。每個(gè)處理90 株，重復(fù)3 次，共計(jì)360 株。樹頭菜插穗扦插生根生長過程中，測定其新梢部位超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶CAT 的活性及丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白等的含量。扦插前一天用3%的高錳酸鉀澆淋土壤進(jìn)行消毒。

1.4 插后管理

扦插后將插穗按緊，均勻澆一次水至墑面似有水非水，并加蓋塑料薄膜和70%遮蔭網(wǎng)。保持土壤潮濕，初期每隔一天澆一次水，后期插穗生根之后5～10 d澆一次水，保持濕度在75%～90%，溫度過高時(shí)，揭開兩邊塑料薄膜及時(shí)通風(fēng)透氣，保持溫度20～25 ℃，有蚜蟲時(shí)用40%樂果1 000～1 500 倍液進(jìn)行噴霧防治。采用多菌靈溶液進(jìn)行噴灑預(yù)防樹頭菜插穗頂部病菌感染產(chǎn)生霉變。

1.5 生根性狀與指標(biāo)測定方法

1.5.1 生根指標(biāo) 扦插6個(gè)月后，對扦插苗生根性狀進(jìn)行測定與獲取，每處理選取6株樹頭菜幼苗，將整株挖出并保持其根系完整，用清水沖洗根系泥土后將其放置陰涼處風(fēng)干外部水分，測其生根率（大于1 mm）、生根量、根粗、根長、生根指數(shù)、根系效果指數(shù)[21-22]。

1.5.2 營養(yǎng)物質(zhì)含量、MDA及酶活性測定 扦插成活后，每隔30 d取樣1次，共5次，取插穗新梢，將樣品剪碎混合均勻，放入-80 ℃低溫冰箱保存，等待檢測。參照路文靜《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程第二版》[23]，可溶性蛋白測定用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，可溶性糖測定用蒽酮比色法，丙二醛（MDA）測定用硫代巴比妥酸（TBA）法，超氧化物歧化酶（SOD）活性用NBT光還原法，過氧化氫酶（CAT）活性用碘量滴定法，過氧化物酶（POD）活性測定用愈創(chuàng)木酚比色法。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，oringin8.0繪圖；利用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對插穗生根指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹頭菜扦插生根進(jìn)程

本次試驗(yàn)中，樹頭菜插穗不定根多在愈傷組織和皮部中形成，愈傷組織生根在95%以上，少部分是皮孔生根。另外樹頭菜插穗生根較慢，插后約30 d才開始有愈傷組織形成，45 d左右后開始生根，90 d后生長穩(wěn)定。

2.2 ABT-1對樹頭菜扦插生根的影響

由表1、表2可知，各處理間8項(xiàng)生根指標(biāo)存在顯著性差異（P＜0.05）。從表1可知，生根率以T2最高，達(dá)86.7%，T1、T3分別為82.2%和80%，CK 處理最低；平均根數(shù)以T3處理最多，12.11 條，T1處理次之，達(dá)11.67條，且T2處理大于對照組；最長根長以T3處理最長（40.55 cm），CK處理最短（15.57 cm）；平均根長以T3處理最長（17.96 cm）；由表2 可知，平均根粗、最大根系直徑、生根指數(shù)以及根系效果指數(shù)以T3處理最大，T1、T2處理顯著（P＜0.01）大于CK。

表1 樹頭菜扦插生根各項(xiàng)指標(biāo)LSD多重比較Tab.1 Multiple comparison of LSD of various rooting indexes in cuttings of Crateva unilocularis

表2 樹頭菜扦插生根各項(xiàng)指標(biāo)LSD多重比較Tab.2 Multiple comparison of LSD of various rooting indexes in cuttings of Crateva unilocularis

2.3 扦插過程中新枝生長節(jié)律分析

由圖1可知，樹頭菜扦插后的生長以一定斜率快速生長，不同處理間生長速度各不相同，整個(gè)過程中處理組的生長速度始終高于對照組，這與上述各生根指標(biāo)生長趨勢相似。

2.4 扦插過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

2.4.1 可溶性蛋白含量的變化 由圖2 可知，樹頭菜扦插生長過程中處理組和對照組可溶性蛋白質(zhì)含量變化總體呈上升—下降—再上升的變化趨勢。初始30～60 d 內(nèi)，可溶性蛋白含量快速增長，且明顯高于120～150 d 內(nèi)，并在第60 天達(dá)到峰值，推測其為愈傷組織的形成及不定根誘導(dǎo)形成提供營養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)。中期60～120 d 內(nèi)，可溶性蛋白的含量開始急速下降，這是因?yàn)椴欢ǜT導(dǎo)形成過程中消耗了大量的蛋白質(zhì)。120 d 以后又開始增長，說明后期隨著樹頭菜插穗新枝的生長，葉的光合作用和根吸收的營養(yǎng)物質(zhì)也在不斷地轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，所以可溶性蛋白的含量緩慢上升。從圖2 還可看出，各ABT-1 處理組前期、中期以及后期的含量明顯高于空白組（清水處理），高蛋白質(zhì)有利于早期扦插幼苗的生長。

圖1 扦插生根過程中新梢長、直徑隨時(shí)間變化Fig.1 The length and diameter of new shoots change with time during the rooting process of cuttings

2.4.2 可溶性糖含量的變化 如圖3 所示，樹頭菜扦插過程中ABT-1 處理組插穗中可溶性糖含量總體上呈現(xiàn)下降—上升趨勢。ABT-1處理組在30～60 d內(nèi)可溶性糖含量逐漸減少，此過程中有愈傷組織和不定根的形成，呼吸作用加強(qiáng)，可溶性糖被大量消耗以保證能量供應(yīng)，導(dǎo)致含量下降，在60 d 降至最低，隨后開始上升，原因是新枝葉片光合作用產(chǎn)生的光合產(chǎn)物和根吸收營養(yǎng)物質(zhì)增多開始積累可溶性糖；由圖1 也可知，新枝生長在60～120 d 內(nèi)為速生長期，此時(shí)段進(jìn)行的光合作用用以積累可溶性糖，正與此相對應(yīng)。另外，處理組在第120天達(dá)到第1個(gè)峰值，而對照組在第90天就已經(jīng)達(dá)到第1個(gè)峰值。由圖3可知，整個(gè)過程中，經(jīng)激素處理的樹頭菜插穗中可溶性糖含量始終高于空白處理，可能是激素組的插穗產(chǎn)生愈傷組織較快、生根長度及粗度等皆優(yōu)于空白處理，即激素對扦插生根具有顯著的促進(jìn)作用，并能夠促進(jìn)插穗吸收外界營養(yǎng)物質(zhì)。

圖2 扦插生根過程中可溶性蛋白含量隨時(shí)間變化Fig.2 The content of soluble protein changed with time during the rooting process of cuttings

圖3 扦插生根過程中可溶性糖含量隨時(shí)間變化Fig.3 The content of soluble sugar changed with time during the rooting process of cuttings

2.5 扦插過程中酶活性的動(dòng)態(tài)變化

2.5.1 POD 活性的動(dòng)態(tài)變化 由圖4 可知，樹頭菜扦插生根過程中，對照組與不同濃度ABT-1 處理的POD 活性變化趨勢相同，均為上升—下降—上升趨勢，但經(jīng)激素處理后的POD 活性顯著高于對照組，說明植物生長調(diào)節(jié)劑的施用能夠有效提高植物插穗POD 活性。在扦插初期POD 活性逐漸上升，可能是因?yàn)镻OD 活性升高可促進(jìn)植物插穗生成根系，隨著扦插時(shí)間推移，在不定根的表達(dá)階段，POD 活性下降且逐漸處于較低水平，此時(shí)有利于不定根的伸長生長，隨后，POD 活性又逐漸升高，可能是由于根系細(xì)胞壁、維管組織形成、根的木質(zhì)化等需大量木質(zhì)素，此時(shí)需要高活性的POD 酶參與植株體內(nèi)酚類物質(zhì)氧化以保證根系生長對木質(zhì)素含量的要求。激素組POD 活性的變化速度大于空白組。

圖4 扦插生根過程中POD活性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 The dynamic changes of POD activity with time during the rooting process of cuttings

圖5 扦插生根過程中SOD活性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 The dynamic changes of SOD activity with time during the rooting process of cuttings

2.5.2 SOD活性的動(dòng)態(tài)變化 由圖5可知，30～90 d內(nèi)處理組SOD活性升高，60 d出現(xiàn)第1個(gè)峰值，90 d出現(xiàn)第2個(gè)峰值。扦插后，植株插穗內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生和聚集對植物造成嚴(yán)重傷害的氧自由基和有害性脂類過氧化物，而當(dāng)這些物質(zhì)含量增多時(shí)將會(huì)刺激SOD 活性，SOD 活性升高以消除對植物有害的自由基，有利于對樹頭菜扦插前期插穗新枝的生長、愈傷組織的產(chǎn)生和不定根的形成。90 d 后隨著大量不定根的形成以及新枝的光合能力的增強(qiáng)，插穗內(nèi)各種生命活動(dòng)恢復(fù)正常水平，SOD 活性開始持續(xù)下降。對照組SOD活性在30 d 并開始持續(xù)降低，60 d 降至最低點(diǎn)，隨后其變化趨勢與處理組相同，但其活性無論是增量還是減量都小于處理組，可見植物生長調(diào)節(jié)劑處理不僅可以使生根時(shí)間提前，對于保護(hù)離體插穗免受外界脅迫也有著重要作用。

2.5.3 CAT 活性的動(dòng)態(tài)變化 過氧化氫酶（CAT）是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，它通過與其他氧化酶類協(xié)同作用，提高植物對外界環(huán)境的適應(yīng)性。試驗(yàn)中對樹頭菜插穗內(nèi)CAT 活性測定表明（圖6），處理組新枝內(nèi)CAT 活性先升高再下降再升高。60 d 出現(xiàn)第1 個(gè)峰值，活性較小，90 d 出現(xiàn)第2 個(gè)峰值，其活性明顯高于60 d；90 d 后其活性開始下降，120 d 下降至最低點(diǎn)。對照組插穗內(nèi)的CAT 活性30 d開始下降，隨后其變化趨勢與處理組相同，說明ABT-1處理插穗，極大的刺激了CAT活性，有利于插穗提前生根。

圖6 樹頭菜扦插生根過程中CAT活性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 The dynamic changes of POD activity with time during the rooting process of cuttings

圖7 樹頭菜扦插生根過程中MDA含量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 The dynamic change of MDA content with time during the rooting process of cuttings

2.6 扦插過程中MDA含量的動(dòng)態(tài)變化

由圖7 可知，插穗離體后水分蒸發(fā)較快，受損嚴(yán)重，處理組MDA 含量小幅上升。60 d 后隨著SOD活性升高、愈傷組織及不定根的形成，插穗內(nèi)MDA 含量逐步下降，90 d 時(shí)下降至最低點(diǎn)。對照組中，樹頭菜插穗內(nèi)MDA 含量變化趨勢與處理組大致相同，但在整個(gè)過程中其含量明顯高于處理組，可見植物生長調(diào)節(jié)劑處理的插穗受逆境脅迫程度更小、時(shí)間更短。樹頭菜插穗脫離母株轉(zhuǎn)移至基質(zhì)過程中受到脅迫，初期植株體內(nèi)MDA 上升，后期插穗愈傷組織形成并長出根系后，植株自身愈合能力升高，其MDA 含量也逐漸下降，而新植株抗性較弱，自我保護(hù)能力還不夠，因而其MDA 含量轉(zhuǎn)為緩慢升高再逐漸趨于平衡。

3 結(jié)論與討論

3.1 ABT-1處理對樹頭菜插穗生根的影響

本次研究，樹頭菜扦插后30 d左右有愈傷組織產(chǎn)生，45 d左右才開始有不定根形成，90 d生長穩(wěn)定，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)樹頭菜插穗扦插，多為愈傷組織生根，皮部生根較少，這與鄭鑫華等[19]研究結(jié)果相同。插穗生根過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑的處理能有效影響離體插穗的不定根再生能力。本試驗(yàn)中，150 mg/L ABT-1為試驗(yàn)最優(yōu)處理，其生根率為82.2%，生根指數(shù)為1.12。100 mg/L ABT-1處理插穗生根率最高，為86.7%，但其余各項(xiàng)指標(biāo)皆小于150 mg/L ABT-1處理組。另外，處理組各項(xiàng)指標(biāo)皆顯著（P＜0.05）高于CK，說明ABT-1 對樹頭菜插穗扦插生根具有明顯的促進(jìn)作用，且不同質(zhì)量濃度之間扦插生根效果存在一定的差異，這與李曉玲等[24]和王雪萍等[25]在野葛和茶樹扦插試驗(yàn)觀點(diǎn)相似。

3.2 ABT-1處理對樹頭菜插穗內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

插穗內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量是影響其生根的重要因素，它們?yōu)椴逅肷椭参镎ＩL提供物質(zhì)和能量[26-27]。張忠微等[28]研究發(fā)現(xiàn)，ABT 處理影響了插穗體內(nèi)可溶性糖類和蛋白質(zhì)的積累消耗。本試驗(yàn)中，扦插初期可溶性糖含量快速下降，由此推測，愈傷組織的形成以及不定根的產(chǎn)生需要消耗可溶性糖，相比ABT-1 處理組，對照組可溶性糖含量偏低，說明ABT-1 可提高樹頭菜插穗內(nèi)可溶性糖含量，促進(jìn)不定根形成。后期，可溶性糖含量上升，推測新枝生長其葉片光合作用能力加強(qiáng)，加速了可溶性糖的積累。劉玉民等[29]在馬尾松（Pinus massoniana）的扦插試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，處理組和對照組可溶性糖含量呈先升高后下降的趨勢，與本試驗(yàn)結(jié)果相反，原因可能是取自不同樹種的插穗內(nèi)可溶性糖原始含量不同以及芽生長分化速度上的差異。而陳晨等[30]在納塔櫟（Quercus nuttallii）扦插試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不定根形成期處理組可溶性糖含量顯著（P＜0.05）高于對照組，且變化趨勢與本試驗(yàn)相同?？扇苄缘鞍缀壳捌谏仙?，后期下降后又升高，推測是愈傷組織的出現(xiàn)需要積累可溶性蛋白，而不定根的生長以及新細(xì)胞的形成需要消耗可溶性蛋白，對照組與ABT-1 處理組可溶性蛋白變化趨勢一致，相比ABT-1 處理組，對照組可溶性蛋白含量偏低。由此可見，ABT-1 處理可提高插穗內(nèi)可溶性蛋白的積累，進(jìn)而促進(jìn)不定根的生長發(fā)育。

3.3 ABT-1處理對樹頭菜插穗內(nèi)相關(guān)酶活性及MDA含量的影響

植物離體扦插過程中POD 活性的變化與不定根的形成有密切關(guān)系[31]。本次試驗(yàn)，插穗生根過程中對照組與處理組POD活性總體變化趨勢相同，相比ABT-1處理組，對照組POD活性偏低，說明ABT-1處理能夠顯著提高插穗POD活性，有效促進(jìn)根系的形成。

SOD 和CAT 是酶保護(hù)系統(tǒng)中的2 種酶，其中SOD 處于核心地位，能有效的清除自由基，高SOD 和CAT 活性可以提高植物抗逆性[32]。本試驗(yàn)，ABT-1 處理組SOD 活性在愈傷組織形成過程中處于上升狀態(tài)，且不定根誘導(dǎo)及表達(dá)階段小幅度升高，增強(qiáng)了離體插穗的抗逆性；不定根伸長階段SOD 活性大幅度升高，起到促進(jìn)生根及根伸長的作用；陳晨等[30]在納塔櫟扦插研究中略有不同，其隨著愈傷組織的出現(xiàn)，SOD活性逐漸降低，推測可能是不同植物插穗體內(nèi)的SOD含量各有差異。另外，對照組SOD活性在不定根誘導(dǎo)及表達(dá)階段減少，后期變化趨勢與處理組相同，且其活性始終低于ABT-1 處理組，說明ABT-1 處理可以提前激發(fā)SOD活性，提高離體插穗的抗逆能力。CAT能有效地阻止H2O2等的積累，限制自由基對膜脂過氧化的啟動(dòng)及危害[33]。本次試驗(yàn)，CAT 活性變化與SOD 活性變化趨勢基本一致，與其他氧化酶類起到協(xié)同作用，提高植物對外界環(huán)境的適應(yīng)性。

當(dāng)植物遇到不良環(huán)境時(shí)，自由基迅速增加，超過一定閾值會(huì)引起膜脂過氧化，產(chǎn)生丙二醛（malo?naldehyde，MDA），MDA 使蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合，引起酶、蛋白質(zhì)失活，膜完整性受到破壞[34]，所以其含量不僅可以用來衡量植物受損程度，而且還是鑒別植物發(fā)生衰老的指標(biāo)之一[35]。樹頭菜扦插過程中，MDA 含量在扦插初期小幅上升，此時(shí)插穗離體，受到較強(qiáng)的環(huán)境脅迫；而當(dāng)SOD 活性升高以及不定根大量形成及伸長，插穗內(nèi)各項(xiàng)生命活性恢復(fù)正常，生長代謝趨于穩(wěn)定，MDA 含量逐漸下降。相比ABT-1 處理組，對照組MDA 含量較高，說明ABT-1 處理能有效抑制插穗內(nèi)MDA 的產(chǎn)生，提高插穗的防御能力。

綜上所述，ABT-1 處理可顯著影響與生根相關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)含量、氧化酶活性，以及抑制MDA 的產(chǎn)生，從而促進(jìn)不定根形成。植物插穗生根過程的機(jī)制較為復(fù)雜，影響樹頭菜插穗生根的生理生化因素也是多方面的，故深入研究其扦插繁殖的生根機(jī)制仍需要大量實(shí)踐探索，以及通過分子手段進(jìn)一步探索研究。本研究中樹頭菜150 mg/L ABT-1 處理的插穗生根效果最好，可為樹頭菜扦插生產(chǎn)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。