(青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚與性病科,山東 青島 266003)

扁平苔蘚(LP)是一種病因不明的慢性炎癥性皮膚病，人群發(fā)病率低于1%[1]，主要累及皮膚和黏膜。其典型病理表現(xiàn)為基底細胞液化變性及真皮上部炎癥細胞浸潤帶[2]。MicroRNA(miRNA)不易被血清中核糖核酸酶降解，在血液和組織中穩(wěn)定存在[3-4]，在炎癥、代謝和發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。miRNA-138(miR-138)是miRNA家族一員,有研究表明miR-138在口腔扁平苔蘚(OLP)中表達降低[5]。細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p53是miR-138的靶基因。miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53是否在皮膚LP的發(fā)病機制中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53在皮膚LP病變組織中的表達及意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2018 年10月— 2020年3月，選取我院皮膚科收治的LP病人皮損組織標本40例(LP組)，病人臨床表現(xiàn)典型并經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為皮膚LP。選取同期我院美容外科手術(shù)切除的正常皮膚組織標本35例作為對照組。兩組均排除其他系統(tǒng)性疾病，均未使用糖皮質(zhì)激素治療。

1.2 RT-PCR方法檢測miR-138的表達

使用Trizol(日本Takara公司)從皮膚組織樣本中分離出總RNA，第一鏈cDNA使用Mir-XTMmiRNAFirstStrandSynthesisandTBGreen試劑盒(Takara Bio USA, Inc)合成，實時PCR定量使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)進行。采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平。miR-138引物(F：5′-AGCTGGTGTTGTGA-ATCAGGCCG-3′,R：5′-GTATCAACGCAGAGT-ACTTT-3′)、U6引物(F：5′-GGAACGATACAG-AGAAGATTAGC-3′,R：5′-TGGAACGCTTCAC-GAAATTGCG-3′)均由上海生工公司合成。

1.3 ELISA法檢測Cyclin D1、P53蛋白表達

應(yīng)用Cyclin D1 ELISA試劑盒(江萊生物公司)、人腫瘤蛋白P53 ELISA試劑盒(Elabscience Biotechnology 公司)檢測標本Cyclin D1、P53蛋白含量，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，同時設(shè)置空白對照孔。用酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度，繪制標準曲線，計算Cyclin D1、P53的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組皮膚組織各指標檢測結(jié)果比較

與對照組相比，LP組miR-138表達降低，差異有顯著性(t=2.473,P<0.05)；CyclinD1、P53蛋白表達顯著升高，差異有顯著性(t=-2.257、-2.217，P<0.05)。見表1。

表1 兩組皮膚組織各指標結(jié)果比較

2.2 miR-138與Cyclin D1、P53表達的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析顯示，miR-138表達與Cyclin D1表達、P53表達均呈負相關(guān)(r=-0.248、-0.266，P<0.05)。見圖1、2。

圖1 LP皮膚組織miR-138表達與Cyclin D1表達相關(guān)分析

圖2 LP皮膚組織miR-138表達與P53表達相關(guān)分析

3 討 論

LP是一種慢性炎癥性皮膚病，病程長，容易復(fù)發(fā)，常伴有瘙癢。其病因尚未明確，可能與遺傳、免疫、感染、精神因素等相關(guān)。既往關(guān)于miRNA與LP相關(guān)性研究主要集中在OLP，針對皮膚LP的研究相對較少。本研究主要檢測miR-138及其下游靶蛋白Cyclin D1、P53在皮膚LP中的表達，探討其在LP發(fā)病中的意義。

由于miRNA不易被血清核糖核酸酶降解，在血液和組織中能夠穩(wěn)定存在，因此可用作臨床診斷和疾病監(jiān)測的生物標志物。WANG等[6]研究顯示，miR-138表達水平升高可抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，并且降低MMP-2和MMP-9的表達。ZHOU等[7]的研究結(jié)果顯示，miR-138通過抑制MMP-2和MMP-9的表達降低了骨原性肉瘤細胞的侵襲。MMP-2、MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族成員，MMPs能夠降解細胞外基質(zhì)的多種成分，在炎癥反應(yīng)、組織愈合、組織重構(gòu)以及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，MMPs與LP的發(fā)病有關(guān)[8-10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-138下調(diào)導(dǎo)致Th1/Th2失衡，參與了銀屑病的發(fā)病機制[12]。Th1/Th2平衡失調(diào)與LP發(fā)病密切相關(guān)[13]。本文研究結(jié)果顯示，皮膚LP組織中miR-138表達下調(diào)，推測miR-138異常表達與LP發(fā)病相關(guān)。

細胞增殖、分化與凋亡間的動態(tài)平衡與細胞周期的正常運行密切相關(guān)。對LP病變中細胞的增殖狀況以及細胞增殖與凋亡關(guān)系進行研究，將有助于揭示該病的發(fā)病機制。CyclinD1是LP病變中與細胞增殖有關(guān)的基因，p53是LP病變中主要與細胞凋亡有關(guān)的基因。本文研究結(jié)果顯示，Cyclin D1、P53蛋白在皮膚LP中表達升高，推測Cyclin D1、P53可能通過破壞角質(zhì)形成細胞增殖與凋亡之間的平衡關(guān)系，促進細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，進而在LP發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

GHALLAB等[5]研究結(jié)果顯示，OLP病人標本中miR-138表達明顯下調(diào)，CyclinD1基因和蛋白均過表達，二者表達呈負相關(guān)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實CyclinD1是miR-138的靶基因[14]。Cyclin D1是細胞增殖過程中意義最大的細胞周期蛋白，在細胞周期控制中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[15]。既往有研究顯示，Cyclin D1可能參與OLP和LP的發(fā)病機制[16]。本文研究結(jié)果顯示，LP病人皮損組織中miR-138表達減少，Cyclin D1表達上調(diào)，二者呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。推測miR-138低表達通過調(diào)控其靶蛋白Cyclin D1誘導(dǎo)細胞增殖，可能在LP的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。

P53是參與細胞增殖和凋亡的眾多蛋白之一。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示p53是miR-138的靶基因。有研究發(fā)現(xiàn)，P53在OLP和LP中表達升高[17-18]。既往對細胞凋亡異常的研究主要集中在OLP，而對LP與凋亡的相關(guān)性研究相對較少。在細胞的正常發(fā)育過程中，由于P53半衰期短，所以蛋白水平較低；細胞在應(yīng)激狀態(tài)下，其表達升高從而阻滯細胞周期和促進細胞凋亡。本文研究結(jié)果顯示，LP病人皮損組織中miR-138表達減少，P53表達上調(diào)，二者呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。推測miR-138表達下調(diào)會減弱對P53的抑制作用，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，進一步證明miR-138的異常表達與LP發(fā)病相關(guān)。

綜上所述，miR-138表達降低可能通過調(diào)控CyclinD1、p53基因表達，破壞角質(zhì)形成細胞的增殖與凋亡之間的平衡關(guān)系，促進細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡，在LP的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。