(青島大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,山東 青島 266100)

膿毒癥是指機體對感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。雖經(jīng)多年努力，其病死率仍居高不下，最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，膿毒癥病人的病死率高達64%[2]，繼續(xù)尋找有效的治療藥物對降低病死率至關(guān)重要。膿毒癥發(fā)病機制極其復(fù)雜，其中包括交感神經(jīng)過度激活，體內(nèi)兒茶酚胺大量釋放，心臟是兒茶酚胺超載的主要靶器官[3]，也是膿毒癥發(fā)展過程中最常見的受損靶器官，腎上腺素能系統(tǒng)的激活可能是發(fā)生膿毒癥心功能障礙的重要機制之一。因此，有研究人員試圖應(yīng)用β1腎上腺素受體阻滯劑拮抗腎上腺素能系統(tǒng)的過度激活。近年來的研究證實，β1受體阻滯劑在拮抗交感神經(jīng)活性[4]、抑制炎癥反應(yīng)[5]、減輕高分解狀態(tài)[6]、改善膿毒癥病人預(yù)后[7]等方面具有顯著效果，另外，β1受體阻滯劑在心肌保護方面可發(fā)揮獨特作用，對于膿毒癥病人具有良好的臨床應(yīng)用前景。β腎上腺素受體已被證實表達于外周血單個核細(xì)胞，而外周血單個核細(xì)胞上存在的Toll樣受體(TLRs)炎癥通路。TLRs是一種跨膜蛋白，它能夠識別病原微生物相關(guān)分子模式(PAMPs)，例如革蘭陰性菌脂多糖(LPS)，LPS與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合形成復(fù)合物，LPS/LBP復(fù)合物隨即被單核細(xì)胞表面的CD14所識別并結(jié)合，然后進一步與TLR4相結(jié)合，通過髓樣分化蛋白88(Myd88)依賴性信號傳導(dǎo)通路啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)的激活和易位，釋放多種炎癥因子。艾司洛爾作為一種高選擇性β1受體阻滯劑，具有起效快、作用時間短的特點，且通過紅細(xì)胞代謝，不受肝、腎功能的影響，尤其適用于危重病人。前期已有研究證實艾司洛爾可減輕心肌損傷，但其具體機制尚不清楚。因此，本實驗從TLR4/Myd88/NF-κB信號通路角度，探討艾司洛爾在膿毒癥心肌保護中的作用機制，以期為膿毒癥心肌損傷的治療提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量為330～360 g，由青島大學(xué)動物實驗中心提供，于室溫18～28 ℃、相對濕度40%～60%、12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

鹽酸艾司洛爾注射液(山東齊魯制藥有限公司)；肌鈣蛋白I(TnI)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，TLR4抗體(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品)，Myd88抗體(英國Abcam公司)，NF-κΒ p65抗體(Cell Signaling Technology公司)，β-actin多克隆抗體(Elabscience公司)，山羊抗兔IgG(Elabscience公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher，MK3)，顯影儀(法國Vilber Fusion，F(xiàn)X5)，雙目光學(xué)顯微鏡(日本Olympus，BX53)。

1.3 動物分組與處理

采用隨機數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、膿毒癥組(Model組)和艾司洛爾組(ES組)，每組20只。所有大鼠術(shù)前12 h禁食，可自由飲水。Model組和ES組依照文獻方法行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP法)制備膿毒癥動物模型[8]：大鼠以100 g/L水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定后沿腹前正中線切開皮膚約2 cm，沿腹白線切開，打開腹腔，探查并找到盲腸，用3-0絲線結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端，同時保持腸道通暢，用18號針頭做兩處穿刺，輕輕擠壓盲腸將兩滴腸內(nèi)容物擠至腹腔，還納盲腸，逐層縫合腹壁切口。Sham組探查盲腸后立即還納關(guān)腹，不行盲腸結(jié)扎穿孔。造模成功后各組均行右側(cè)股靜脈穿刺術(shù)，ES組持續(xù)微量泵入艾司洛爾稀釋液1 mL/h(15 mg·kg-1·h-1)，共計6 h；Sham組、Model組持續(xù)泵入等量生理鹽水。各組術(shù)后1 h內(nèi)均經(jīng)股靜脈給予30 mL/kg生理鹽水模擬液體復(fù)蘇。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1大鼠存活率 由3名研究人員在不知分組情況下觀察所有大鼠一般狀態(tài)，實驗大鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)豎立、眼鼻出血、腹瀉等癥狀，則提示膿毒癥造模成功。同時，計算各組大鼠的存活率。

1.4.2血清TnI、TNF-α和IL-1測定 所有存活大鼠均于造模后24 h再次麻醉，腹主動脈取血2 mL，靜置30 min后，以3 000 r/min離心15 min，分離上清，按照試劑盒說明書，采用干式免疫熒光定量法測定TnI濃度，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法分別測定TNF-α、IL-1濃度。

1.4.3心肌組織病理學(xué)觀察 術(shù)后24 h麻醉處死大鼠，分離大鼠心臟，取左心室游離壁，以4 ℃生理鹽水洗凈血污，用40 g/L多聚甲醛固定72 h以上，流水洗凈甲醛，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)攤片、烤片后進行蘇木精-伊紅染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織學(xué)變化。從心肌變性壞死、出血、間質(zhì)水腫和中性粒細(xì)胞浸潤等方面觀察心肌病變分布情況，并采用半定量評分系統(tǒng)進行評分[9]，組織病理評分為0～4分，分別代表病變受累率0、25%、50%、75%和100%。由3名高年資病理科醫(yī)師在不知分組情況下同時進行組織病理學(xué)檢查并給出分?jǐn)?shù)，取平均值。

1.4.4Western blot檢測心肌組織TLR4、Myd88和NF-κB蛋白表達 用電子天平稱取100 mg心肌組織，組織剪剪碎后，按每20 mg組織加入200 μg組織細(xì)胞裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，裂解后的樣品以12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。配制100 g/L的SDS-PAGE分離膠及50 g/L的濃縮膠，經(jīng)過上樣、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入TLR4(1∶1 000)、Myd88(1∶1 000)及NF-κB(1∶1 000)抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶5 000)稀釋液，于室溫下孵育2 h，洗膜后加入超敏ECL發(fā)光液進行顯影，采用Image J軟件分析各條帶光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠存活率的比較

術(shù)后24 h，Sham組大鼠死亡2只，存活率為90.0%；Model組死亡9只，存活率為55.0%；ES組死亡7只，存活率為65.0%。Model組大鼠存活率較Sham組顯著降低(χ2=6.14，P<0.05)，而ES組與Model組存活率比較差異無顯著性(χ2=0.42，P>0.05)。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后，Model組、ES組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)豎立、眼鼻出血、腹瀉等膿毒癥癥狀，而Sham組大鼠未出現(xiàn)上述癥狀。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化

光鏡下Sham組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，纖維肌絲束排列緊密，未見明顯水腫、充血、變性以及壞死等；Model組可見心肌細(xì)胞大量壞死，呈空泡樣變性，心肌纖維明顯水腫，排列疏松，部分心肌纖維斷裂，細(xì)胞核腫脹，間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤；ES組與Model組相比心肌細(xì)胞壞死減少，心肌纖維排列欠規(guī)整，間質(zhì)無明顯水腫，仍有少量炎性細(xì)胞浸潤。心肌組織病理評分Model組(2.45±0.69)>ES組(1.77±0.73)>Sham組(0.83±0.71)，差異具有顯著意義(F=18.84，P<0.05)。

2.3 各組大鼠血清TnI含量的比較

Model組大鼠血清TnI含量較Sham組明顯升高，ES組大鼠血清TnI含量較Model組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=231.82，P<0.05)。見表1。

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1含量的比較

Model組大鼠血清TNF-α、IL-1含量較Sham組明顯升高，ES組大鼠血清TNF-α以及IL-1含量較Model組明顯降低，差異有顯著性(F=335.21、602.11，P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TnI、TNF-α和IL-1含量比較

2.5 各組大鼠心肌組織TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達的比較

Model組大鼠心肌組織中TLR4、Myd88以及NF-κB蛋白表達較Sham組明顯升高，而ES組大鼠心肌組織中TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達較Model組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.15～95.92，P<0.05)。表明艾司洛爾可抑制膿毒癥大鼠心肌組織中TLR4、Myd88及NF-κB蛋白的表達。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠心肌組織TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達電泳圖

表2 各組大鼠心肌組織TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達比較

3 討 論

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的常見病、多發(fā)病，已成為沉重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。心肌損傷是膿毒癥導(dǎo)致的常見的器官功能障礙之一，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及全身炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)激活、免疫功能障礙、冠狀動脈低灌注或不均勻灌注、氧化應(yīng)激、Ca2+超載、線粒體功能障礙等[10-12]。雖然許多病理生理機制被提出，但每種機制的全部影響尚未闡明。目前臨床上通過測量生物標(biāo)志物(心肌肌鈣蛋白、腦鈉肽)和使用超聲心動圖，可以很容易地識別膿毒癥病人的心臟功能障礙。然而，尚無針對膿毒癥心肌抑制的特異性治療方法。當(dāng)前治療常通過液體復(fù)蘇、血管活性藥物的支持確保足夠的心室充盈，優(yōu)化血流動力學(xué)穩(wěn)定性，在很大程度上仍屬于支持性治療。未來的研究應(yīng)集中在糾正特定病理生理學(xué)異常的靶向治療上。

艾司洛爾作為一種β受體阻滯劑，因具有負(fù)性肌力作用以往通常被認(rèn)為不適合用于膿毒癥休克的治療。隨著對膿毒癥病理機制的不斷深入研究，人們發(fā)現(xiàn)膿毒癥病人的典型特征是腎上腺素能系統(tǒng)過度激活，強烈的腎上腺素能刺激可產(chǎn)生多種毒副作用，包括心臟效應(yīng)，如心率、心肌收縮力和心肌能量需求增加，以及心臟外效應(yīng)，如高分解狀態(tài)、高凝狀態(tài)、全身炎癥細(xì)胞因子的釋放調(diào)節(jié)。因此，人們對在膿毒癥病人中使用β腎上腺素能阻滯劑越來越感興趣，目的是減輕交感神經(jīng)過度刺激引起的副作用。SUZUKI等[5]的實驗結(jié)果顯示，連續(xù)輸注艾司洛爾可改善CLP法所致膿毒癥大鼠的各項心功能指標(biāo)，表明艾司洛爾可改善膿毒癥大鼠心肌氧利用率，作者認(rèn)為艾司洛爾的這種心臟保護作用可能是通過阻斷過度的β腎上腺素能刺激、減少β腎上腺素能受體密度而實現(xiàn)的。這一觀點也得到了國內(nèi)學(xué)者的認(rèn)同[13-14]。另有研究顯示，艾司洛爾還可通過抑制炎癥遞質(zhì)的表達，提高膿毒癥病人的心臟效應(yīng)[15-16]。除此之外，β受體阻滯劑在治療膿毒癥方面也表現(xiàn)出生存率上的優(yōu)勢，例如，LIU等[17]研究表明，艾司洛爾可降低膿毒癥休克病人28 d死亡率，同時縮短ICU住院時間。由此可見，艾司洛爾在治療膿毒癥所致心肌損傷方面具有積極作用。

文獻報道，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后24 h心肌損傷最明顯，是觀察膿毒癥心肌損傷最合適的時間點[18]。本實驗?zāi)Ｐ驮u價結(jié)果顯示，造模24 h后開腹可見腹腔大量滲出伴有惡臭，盲腸末端充血壞死，同時心肌組織病理切片鏡下可見心肌細(xì)胞大量壞死，心肌纖維明顯水腫、排列疏松，部分心肌纖維斷裂，細(xì)胞核腫脹，間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤，提示膿毒癥造模成功。TnI是目前檢測心肌細(xì)胞損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[19]，不僅可以作為診斷膿毒癥心肌損傷的指標(biāo)，還可以作為病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的指標(biāo)[20]。LABUGGER等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥過程中，心肌細(xì)胞損害多為細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的改變，心肌內(nèi)肌鈣蛋白裂解為較小片段，心肌細(xì)胞膜通透性增加，從而導(dǎo)致血漿肌鈣蛋白水平的升高。因此，本實驗選擇TnI作為膿毒癥后心肌損傷及其程度的評價指標(biāo)。本文結(jié)果顯示，Model組大鼠的血清TnI濃度較Sham組顯著升高,提示采用CLP法可誘導(dǎo)膿毒癥心肌損害，ES組的TnI濃度較Model組顯著降低，表明艾司洛爾能夠減輕膿毒癥大鼠心肌損傷。

膿毒癥時，LPS可促進大量細(xì)胞因子釋放，從而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，過度炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致器官功能障礙，尤其是心臟。TNF-α在膿毒癥發(fā)病早期起關(guān)鍵作用，它是啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)的始動因子，抑制TNF-α信號能有效改善內(nèi)毒素血癥引起的心肌損傷[22]。例如，糖皮質(zhì)激素在抑制TNF-α的同時，可以減輕膿毒癥大鼠的心肌抑制[23]；阿托伐他汀可以抑制TNF-α的表達，減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷[24]。與以往研究相一致，本實驗也證實膿毒癥大鼠血清中TNF-α的表達水平明顯增加，通過外源性給予艾司洛爾，可以明顯降低TNF-α的表達。另外，炎癥因子IL-1也在膿毒癥心肌損傷中發(fā)揮重要作用[25]。例如，黃芪多糖能夠抑制膿毒癥大鼠心肌組織IL-1的表達，從而減輕心臟損害[26]。本文研究結(jié)果顯示，Model組大鼠血清中IL-1的表達水平較Sham組明顯增加，而艾司洛爾可以明顯降低IL-1的表達水平。以上結(jié)果提示，艾司洛爾可能通過降低炎癥因子TNF-α和IL-1的表達，抑制炎癥反應(yīng)，從而改善膿毒癥心肌損傷。

TLRs是一種跨膜蛋白，它能識別PAMPs，通過Myd88依賴性信號傳導(dǎo)通路啟動信號傳導(dǎo)，激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路，啟動炎癥因子轉(zhuǎn)錄[27]。近年來，對TLR4/Myd88/NF-κB信號通路的研究涉及器官移植、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等多個領(lǐng)域。ZHOU等[28]采用CLP法建立膿毒癥大鼠模型，證實了抗TLR4單抗預(yù)處理可抑制TLR4/Myd88信號通路，減輕炎癥反應(yīng)。本研究進一步探討了艾司洛爾調(diào)控膿毒癥大鼠心肌炎癥反應(yīng)的作用機制，結(jié)果顯示，艾司洛爾能顯著抑制TLR4、Myd88、NF-κB蛋白的表達。表明TLR4/Myd88/NF-κB信號通路可能參與了膿毒癥大鼠的心肌損傷及炎癥反應(yīng)。

綜上所述，艾司洛爾能夠減輕炎癥反應(yīng)和心肌損傷，其作用機制可能與抑制TLR4/Myd88/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。這將為膿毒癥大鼠心肌損傷的預(yù)防和治療提供新的研究方向。但本實驗存在未設(shè)置艾司洛爾濃度梯度、觀察時間短等不足，因此，艾司洛爾在膿毒癥心肌保護中的劑量和作用時間仍需進一步研究。