陳寬，李娜，何瑜，宋功武

(湖北大學化學化工學院，湖北 武漢 430062)

0 引言

眾所周知，銅離子(Cu2+)在生物體內(nèi)發(fā)生的多種生理過程中起重要作用，也是重要的環(huán)境污染物之一.Cu2+廣泛應(yīng)用于許多工業(yè)過程如化學、電子、環(huán)境和生物領(lǐng)域，導(dǎo)致了在土壤、水和食物的廣泛污染[1].然而，在濃度升高的情況下，Cu2+對某些藻類、真菌、細菌和病毒等生物具有高毒性[2].異常水平的Cu2+可導(dǎo)致生物體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，甚至與印度兒童肝硬化的發(fā)展有關(guān)，如朊病毒病、梅克斯病、帕金森病和威爾遜病[3].而且，人類若過量攝取Cu2+可能會導(dǎo)致嚴重的健康問題，包括缺血性心臟病、腎臟疾病、神經(jīng)衰退性疾病以及貧血和骨骼疾病[4].美國環(huán)境保護署(USEPA)批準的飲用水中Cu2+的含量不能超過1.30×10-6mol/L[5].因此，開發(fā)高靈敏度、高選擇性的檢測實際樣品中Cu2+的分析方法非常重要.

據(jù)報道，多種用于檢測Cu2+的方法已經(jīng)被開發(fā)并應(yīng)用，包括有原子吸收/發(fā)射光譜法(AAS/AES)、電化學分析法、耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)和同步輻射X線光譜法(SRXRS)等[6].然而，這些方法中大多數(shù)耗時長、價格高昂，且需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品處理和使用到繁復(fù)的儀器設(shè)備.因此，開發(fā)一種簡易、環(huán)保的Cu2+傳感器仍然十分必要.熒光分析法因其選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好、時間消耗少、易于處理等優(yōu)勢受到了廣泛關(guān)注.而且人們對納米簇的研究也有了快速發(fā)展.因此，利用納米簇的熒光性能用于金屬離子的檢測是一種具有應(yīng)用前景的方法.

近幾年，因為獨特的理化性質(zhì)以及在催化、光學和生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，硫醇類修飾的金屬納米簇已經(jīng)受到了人們極大的關(guān)注[7].本研究參考Luo課題組[8]制備青霉胺修飾銅納米粒子的方法，以青霉胺為模板分子合成了具有紅色熒光的水溶性銀納米簇.利用青霉胺的胺基與Cu2+之間的強烈作用，制備了一種高效、快速檢測Cu2+的納米傳感器.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器儀器：NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀(Thermo Scientific)，100SX 透射電子顯微鏡(日本JSM-6360LV公司)，LS55熒光分光光度計(美國Perkin-Elmer公司).

試劑：青霉胺(DPA)、硝酸銀(AgNO3)、氯化鉻(CrCl3)、硝酸鉛(Pb(NO3)2、氯化鎘(CdCl2)、氯化鈷(CoCl2)、氯化鎳(NiCl2)、氯化鐵(FeCl3)、氯化亞鐵(FeCl2)、氯化銀(AgCl)、氯化銅(CuCl2)、氯化汞(HgCl2)、氯化鋅(ZnCl2)均購于中國阿拉丁試劑有限公司，氫氧化鈉(NaOH)購于國藥集團化學試劑有限公司，抗壞血酸(AA)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl2)均購于天津博迪化工股份有限公司,氯化鈣(CaCl2) 購于江蘇金壇縣試劑廠，氯化鋇(BaCl2)購于天津市蘇莊試劑廠，氯化錳(MnCl2)購于天津市恒星化學試劑制造有限公司,以上試劑的純度均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 青霉胺修飾的銀納米簇的制備與表征 將150 μL DPA (0.1 mol/L)和150 μL AgNO3(0.1 mol/L) 溶于4.5 mL超純水中，在室溫下快速攪拌5 min后加入80 μL NaOH(1 mol/L)，再攪拌5 min，最后在50 ℃恒溫水浴中攪拌并緩慢加入100 μL AA (0.5 mol/L)，繼續(xù)攪拌4 h，即得到5 mL紅棕色的DPA-Ag NCs溶液.并通過TEM、FL、FT-IR對其進行了表征.

1.2.2 青霉胺修飾的銀納米簇作為熒光探針檢測Cu2+

1)優(yōu)化檢測Cu2+的條件.探討了DPA-Ag NCs檢測Cu2+的最佳探針濃度、Cu2+的最佳反應(yīng)時間以及檢測的線性范圍、檢測的選擇性、識別Cu2+的機理.

向稀釋一定倍數(shù)的銀納米簇溶液中分別加入不同濃度Cu2+，研究該探針與Cu2+的作用時間.然后向稀釋不同倍數(shù)后的銀納米簇溶液中分別加入10 mmol/L的Cu2+，用熒光分光光度計分別記錄加入Cu2+前后DPA-Ag NCs在685 nm處的熒光強度的變化，探究DPA-Ag NCs檢測Cu2+的最佳濃度.

通過用熒光分光光度計來記錄向稀釋一定倍數(shù)的DPA-Ag NCs溶液中分別加入不同濃度的新制的Cu2+前后的熒光光譜，來探究DPA-Ag NCs檢測Cu2+的線性范圍.

2)檢測Cu2+的選擇性.為了考察DPA-Ag NCs對于Cu2+相比于其他金屬離子的選擇性，使用了以下金屬離子：Hg2+、Pb2+、Zn2+、Co2+、Fe3+、Fe2+、Ag+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Ce3+、K+、Mg2+、Na+、Ni2+.配制Cu2+與其他各金屬離子溶液，然后適當濃度的金屬離子溶液與稀釋后的DPA-Ag NCs混合一定時間后進行熒光測量.

1.2.3 自來水分析 由含有不同濃度的Cu2+的DPA-Ag NCs的熒光強度相對于Cu2+濃度的標準曲線，來計算當?shù)刈詠硭械腃u2+濃度，并與加標的Cu2+濃度作對比，得出回收率，驗證本方法的實用性.

2 結(jié)果與討論

2.1 青霉胺修飾的銀納米簇的表征首先對DPA-Ag NCs進行了結(jié)構(gòu)表征，由圖1(a)可知，所制備的DPA-Ag NCs表現(xiàn)出良好的單分散性，尺寸均一，其平均粒徑為2 nm.由圖1(b)所示，比較DPA-Ag NCs和DPA的紅外曲線，可以發(fā)現(xiàn)，DPA的紅外圖中2 500～2 600 cm-1處所對應(yīng)的S—H伸縮振動峰消失了，證明了DPA-Ag NCs的成功合成.

圖1 (a) DPA-Ag NCs的透射電子顯微鏡圖、(b) DPA-Ag NCs和DPA的紅外譜圖

對銀納米簇進行了光學性質(zhì)表征：將DPA-Ag NCs溶液加入比色皿中，在575 nm的激發(fā)光下測定其熒光發(fā)射光譜.如圖2所示，溶液在575 nm的光激發(fā)下于685 nm處發(fā)紅光.證明了納米簇的形成.

圖2 DPA-Ag NCs的激發(fā)與發(fā)射熒光光譜圖

2.2 青霉胺修飾的銀納米簇用于Cu2+的檢測

2.2.1 探究檢測Cu2+的最佳檢測條件 向稀釋一定倍數(shù)的DPA-Ag NCs溶液中，分別加入2 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L Cu2+(圖3b)，經(jīng)過不同時間的孵化后，觀測685 nm處熒光強度變化情況(圖3a)，可以看出隨著孵化時間增加，DPA-Ag NCs的熒光強度逐漸減弱，50 min以后，反應(yīng)基本達到動態(tài)平衡.因此，選取50 min為DPA-Ag NCs與Cu2+的最佳孵化時間.

圖3 (a) DPA-Ag NCs與Cu2+在不同時間下的熒光圖和(b)不同濃度Cu2+加入到DPA-Ag NCs中熒光強度隨時間的變化圖

其次，為了提高DPA-Ag NCs檢測Cu2+的靈敏度，對熒光探針的濃度進行研究.將制備的DPA-Ag NCs溶液原樣分別稀釋2、3、5、10、20倍，對比加入10 mmol/L Cu2+前后685 nm處的熒光強度變化情況，如圖4，可以看出稀釋10倍的熒光探針具有最佳的靈敏度，且相較于稀釋20倍的探針有較強的熒光強度，能有效減小系統(tǒng)誤差.

圖4 不同稀釋倍數(shù)的探針與10 mmol/L Cu2+作用后的熒光強度柱狀圖

2.2.2 探究熒光檢測Cu2+的線性范圍 為了評價DPA-Ag NCs檢測Cu2+的靈敏度，對加入不同濃度Cu2+后685 nm處的熒光強度進行了檢測，如圖(5)所示DPA-Ag NCs在685 nm處的熒光強度隨著其中Cu2+的濃度的增加而逐漸減弱.使用DPA-Ag NCs(超純水稀釋10倍)作為探針，Cu2+的濃度從0.05 μmol/L到10 μmol/L即能被檢測，并且在0.05～4.5 μmol/L和4.5～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)各不相同.分段擬合后得到兩個線性方程：

F=32.13 [Cu2+](μmol/L)+ 7.43，(R2=0.986 9)，

F=8.45 [Cu2+](μmol/L)+ 106.12，(R2=0.996 1).

圖5 DPA-Ag NCs和不同濃度的Cu2+混合液的熒光發(fā)射光譜圖(稀釋10倍)

DPA-Ag NCs對Cu2+的檢測限低至2.5 nmol/L，與所文獻報道的其他探針相比，本方法提供了較寬的線性范圍和測定Cu2+更低的檢測限(表1).

表1 不同熒光探針用于Cu2+檢測的線性范圍及檢出限比較

2.2.3 離子選擇性 為了考察DPA-Ag NCs這種熒光探針的選擇性，探究了K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Ag+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Cr3+、Ni2+這17種金屬離子對DPA-Ag NCs的熒光影響.在金屬離子的檢測中，只有Cu2+、Fe3+、Hg2+、Cd2+、Co2+和Ni2+猝滅了DPA-Ag NCs的熒光(圖6).Fe3+、Hg2+、Cd2+、Co2+和Ni2+對銀納米簇的熒光強度影響不大，而Cu2+對銀納米簇的熒光影響非常顯著，證明了DPA-Ag NCs對Cu2+有較高的選擇性.

圖6 DPA-Ag NCs對Cu2+選擇性的熒光強度柱狀圖(稀釋10倍)

2.3 探究檢測Cu2+的機理熒光猝滅通常分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅.動態(tài)猝滅用Stern-Volmer方程(1)描述，靜態(tài)猝滅用Lineweaver-Burk方程(2)描述:

F0/F=1+KSV[C]

(1)

1/(F0-F)=1/F0+KLB/F0[C]

(2)

如圖7所示，F(xiàn)0、F分別是DPA-Ag NCs中加入Cu2+前后的熒光強度值，[C]是猝滅劑(Cu2+)的濃度，KSV是動態(tài)猝滅常數(shù)，KLB是靜態(tài)猝滅常數(shù).F0/F和Cu2+濃度的關(guān)系不符合Stern-Volmer方程，然而(F0-F)-1和[Cu2+]-1的線性關(guān)系表明熒光猝滅遵循Lineweaver-Burk 方程，屬于靜態(tài)猝滅.這些結(jié)果表明DPA-Ag NCs和Cu2+作用并在在銀納米簇表面形成了無熒光的化合物.

圖7 加入不同濃度的Cu2+后DPA-Ag NCs的a) Stern-Volmer’s線性擬合圖和b) Lineweaver-Burk線性擬合圖

我們將DPA-Ag NCs的熒光猝滅歸因于重金屬誘導(dǎo)銀納米簇的聚集原理.TEM圖是表征銀納米簇聚集的明顯證據(jù).如圖8所示，在加入Cu2+前，銀納米簇尺寸均一，在電鏡視野中分散均勻，而在加入5 μmol/L Cu2+后，銀納米簇明顯密集起來，而且加入的Cu2+濃度越高，聚集情況越明顯.

圖8 DPA-Ag NCs 溶液中加入Cu2+ 前(a) 和加入Cu2+(b：5 μmol/L Cu2+，c：50 μmol/L Cu2+)后的TEM圖

為了進一步探討Cu2+誘導(dǎo)DPA-Ag NCs聚集的原因，將團簇加入Cu2+前后的樣品進行紅外測試，如圖9所示，3 200 cm-1～3 400 cm-1屬于N—H的伸縮振動吸收峰，1 622 cm-1處屬于N—H的彎曲振動吸收峰，1 363 cm-1處屬于C—N的伸縮振動吸收峰.從圖9中可以看出，向DPA-Ag NCs溶液中加入一定量的Cu2+后，上述3處吸收峰均有所減弱，表明了Cu2+與DPA結(jié)構(gòu)中的—NH2之間的強烈作用.說明該熒光探針能選擇性的測定Cu2+，歸因于青霉胺的—NH2與Cu2+特異性結(jié)合作用.

圖9 DPA-Ag NCs中加入Cu2+前后的紅外譜圖

2.4 測定實際樣品中的Cu2+為了驗證DPA-Ag NCs作為Cu2+探針的實用性，檢測了自來水中Cu2+的濃度.3次測定的結(jié)果顯示在表2中.自來水樣測試前用純水稀釋了3倍來消除背景干擾.樣品的加標回收率分布在92%～99%之間，證明了DPA-Ag NCs作為熒光探針的應(yīng)用價值.

表2 銀納米團簇對于實際樣品的檢測

3 結(jié)論

制備了青霉胺的修飾的具有紅色熒光的銀納米簇，并對制備的DPA-Ag NCs進行了表征和分析，證明了DPA-Ag NCs的合成是通過青霉胺中S與Ag的相互作用實現(xiàn)的.模板分子青霉胺與Cu2+具有強烈相互作用，基于此建立了一種檢測Cu2+的高靈敏手段.得到其檢出范圍為0.05～10 μmol/L，說明該檢測方法具有簡單快速、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，并將其用于實際樣品(自來水)中Cu2+的檢測，得到了令人滿意的結(jié)果，證明了該熒光探針的實用性.