劉玉芝，任玉華，王雪，張少陽(yáng)

（聊城市人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東 聊城 252000）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病。我國(guó)冠心?。–HD）的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們的生活質(zhì)量和健康，其主要的發(fā)病原因?yàn)楦鞣N危險(xiǎn)因素對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮的損傷和脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜層的積聚，導(dǎo)致動(dòng)脈壁的慢性炎癥，逐漸形成粥樣斑塊。在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）中，異常的脂質(zhì)位于血管壁內(nèi)膜下，介導(dǎo)形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應(yīng)[1]。在此過(guò)程中，免疫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞被激活，一些細(xì)胞因子被釋放，進(jìn)一步增加炎癥反應(yīng)。隨后，巨噬細(xì)胞、血小板和平滑肌細(xì)胞被激活，從而顯著增加炎性物質(zhì)，加重斑塊的不穩(wěn)定性和破裂，進(jìn)而加重疾病的發(fā)展程度[2]。

近年來(lái)，基因調(diào)控因子微核糖核酸（miRNA）、AS 及心血管疾病相關(guān)性研究增多。如miR-208a、miR-133a 參與心肌肥厚，miR-155在冠心病患者血漿中顯著下降，miR-143/145通過(guò)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，miR-2 也參與血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管新生內(nèi)膜病變的形成，micoRNA-195 參與心臟重塑的病理過(guò)程。Yao 等[3]研究發(fā)現(xiàn)miR-181 家族可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控。其中miR-181b 是 miR-181 家族在心血管細(xì)胞中的主要表達(dá)亞型［4］。本研究旨在分析miR-181b與冠狀動(dòng)脈狹窄程度之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA在冠狀動(dòng)脈斑塊形成和心血管治療中的作用提供新的依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年1 月至2019 年12 月本院心內(nèi)科收治的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者180 例為研究對(duì)象，根據(jù)Gensini 積分（見(jiàn)表1）分為≤25 分組（n=71）、26～50分組（n=53）、＞50分組（n=56），選取同期行冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果正常的35名作為對(duì)照組，所有研究對(duì)象年齡38～78歲，平均（60.82±8.24）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

表1 Gensini積分Table 1 Gensini score

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜85 歲者；2 個(gè)月內(nèi)無(wú)手術(shù)、外傷、感染性疾病者；無(wú)肝臟疾病、腎功能衰竭者；無(wú)惡性腫瘤者；無(wú)結(jié)締組織病或自身免疫性疾病者；非急性出血，輸血期者；無(wú)甲狀腺功能異常者；非接受放療、化療者；非腦梗病史或其他血栓病史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整者；中途退出者；拒絕參與本研究者。

1.2 方法

1.2.1 臨床一般指標(biāo)檢測(cè) 所有研究對(duì)象入院后第2天清晨空腹采集超敏CRP（hs-CRP）、Cr、BUN、TC、TG、HDL-C、LDL-C等血標(biāo)本進(jìn)行化驗(yàn)。

1.2.2 血清miR-181b相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qRT-PCR）測(cè)定血清miR-181b相對(duì)表達(dá)水平。具體方法為：提取血清1份，并檢測(cè)總RNA純度比值，范圍為1.6～2.0。按Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將反轉(zhuǎn)錄cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)45次。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-181b mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) 分析血清miR-181b 與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性 分別測(cè)定4組血清miR-181b水平，比較其與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用“”表示，采用單因素方差分析；不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用直線回歸相關(guān)分析血清miR-181b水平與臨床及病理指標(biāo)的關(guān)系，以P＜O.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組血清miR-181b相對(duì)表達(dá)水平及臨床資料比較 對(duì)照組miR-181b水平高于≤25分組、26～50分組及＞50分組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；≤25分組、26～50分組及＞50分組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；≤25分組與26～50分組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！?5分組、26～50分組、＞50分組hs-CRP 水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）；＞50 分組高于≤25 分組、26～50分組（P＜0.05）；≤25分組與26～50分組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其他指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 4組miR-181相對(duì)表達(dá)水平及臨床資料比較Table 2 Comparison of relative expression levels and clinical data of miR-181b among the four groups

2.2 血清miR-181b 相對(duì)表達(dá)水平與hs-CRP 直線相關(guān)分析血清miR-181b相對(duì)表達(dá)水平與hs-CRP呈負(fù)相關(guān)（r=-0.767，P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-181b與hs-CRP直線相關(guān)分析Figure 1 Linear correlation analysis of serum miR-181b and hs-CRP

3 討論

miR-181b 屬于 miR-181 家族 ，miR-181 是典型的具有內(nèi)含子性質(zhì)的非編碼RNA 分子家族，其中包括4 個(gè)成熟的miRs：miR-181a，miR181b，miR181c，miR181d，由位于3 條不同的染色體上的6個(gè)主miRs序列編碼構(gòu)成，靶基因主要參與細(xì)胞修復(fù)、炎性反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞增生等生物學(xué)過(guò)程[5-7]。有研究表明，miR-181b 是miR181 家族在心血管細(xì)胞中的主要表達(dá)亞型，miR-181b能負(fù)調(diào)控促炎分子的表達(dá)，從而保護(hù)血管炎癥[4]。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–HD）是血脂異常、血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)等多種病理因素造成的冠狀動(dòng)脈管腔狹窄而引發(fā)的疾病。急性冠脈事件多由斑塊破裂和血栓形成引起，據(jù)病理學(xué)研究顯示，血小板反應(yīng)介導(dǎo)的急性事件的發(fā)展主要取決于斑塊的組成和脆弱程度[8]。動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種動(dòng)脈管壁的慢性進(jìn)展性炎性反應(yīng)，異常的脂質(zhì)代謝引發(fā)動(dòng)脈管壁上脂質(zhì)沉積和炎性反應(yīng)，可形成粥樣斑塊及血管損傷，導(dǎo)致AS的發(fā)生［9］。

研究表明，miRNA 在血管和炎性疾病（包括中風(fēng)和斑塊破裂）的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，miR-181 家族在心血管炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和急性卒中事件中起關(guān)鍵作用[9-11]。Deng B[12]發(fā)現(xiàn)，在局灶性缺血性腦卒中大鼠中，miR-181b 的表達(dá)隨缺血程度的增加而下降，miR-181b 表達(dá)的增加可降低總動(dòng)脈負(fù)荷。Sun 等［9］研究表明，miR-181b 可通過(guò)調(diào)控炎性相關(guān)因子的表達(dá)，阻礙炎性細(xì)胞的聚集和動(dòng)脈粥樣斑塊形成。以往研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，在易損斑塊中存在大量的巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞對(duì)于斑塊的破裂非常重要。miR-181b 可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來(lái)減少斑塊面積、壞死面積和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。Hulsmans 等［15-16］在喂食高脂肪飲食的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜中miR-181b 下調(diào)，miR-181b 的過(guò)量表達(dá)與大鼠體質(zhì)量的下降呈正相關(guān)，超重、肥胖為CHD 發(fā)病危險(xiǎn)因素之一，表明miR-181b與CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)成負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，冠脈狹窄程度越重，miR-181b的表達(dá)水平越低；同時(shí)，冠脈狹窄程度越重，其血漿炎癥因子hs-CRP 水平越高，且miR-181b 的表達(dá)水平與hs-CRP 呈顯著負(fù)相關(guān)，表明miR-181b 在炎癥反應(yīng)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，提示miR-181b 在冠狀動(dòng)脈硬化中起保護(hù)作用。

關(guān)于miR-181b 對(duì)冠狀動(dòng)脈硬化的保護(hù)機(jī)制尚未明確。Zhang 等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，輸入蛋白-α3 和 caspase 募集結(jié)構(gòu)域蛋白-10 的低表達(dá)，可特異性下NF-κB 核轉(zhuǎn)位作用，進(jìn)而導(dǎo)致IL-6、IL-8、TNF-α的失活，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶-2、細(xì)胞黏附分子-1、人血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1等細(xì)胞因子表達(dá)的下調(diào)，從而抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生。Gargi S等［19］和 Dan-Dan Xu 等［20］提出 miR-181b 與 NF-κB 之間存在NF-κB/IL-6/STAT/miR-181b調(diào)節(jié)環(huán)路，NF-κB可通過(guò)激活I(lǐng)L-6 依賴的STAT 通路，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)miR-181b 的轉(zhuǎn)錄作用，降低炎性反應(yīng)。miR-181b 與NF-κB 互相作用，進(jìn)一步降低動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)，提示miR-181b 在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮保護(hù)作用。有研究證實(shí)[21]，miR-181b 可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化，抑制免疫細(xì)胞在炎性反應(yīng)中的聚集，進(jìn)一步發(fā)揮抗炎作用。miR-181b 為血管內(nèi)皮和平滑肌的主要調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)VEC 及VSMC 的增生分化，促進(jìn)組織修復(fù)［22］。P SUN等[23]發(fā)現(xiàn)miR-181b/Notch1信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，miR-181b 通過(guò)抑制Notch1 的表達(dá)來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能。Tie-Jun Li等[24]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-181b 可激活 PI3K 和 MAPK 通路，AKT 和 ERK1/2 磷酸化水平升高，miR-181b 可通過(guò) PI3K、MAPK 和 JNK 通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖，發(fā)揮動(dòng)脈粥樣硬化血管的修復(fù)作用。Di Gregoli 等［25］進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-181b 在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中能抑制病變組織中MMP-12 和TIMP-3等金屬蛋白酶表達(dá)，可擴(kuò)張血管，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。miR-181b 通過(guò)自噬調(diào)節(jié)機(jī)制，正性調(diào)節(jié)mTOR 信號(hào)通路的下游分子p70S6K的表達(dá)，負(fù)性調(diào)節(jié)自噬，延緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。Carlos等［26］發(fā)現(xiàn)在CHD患者血漿中，TNF-α 可促進(jìn)白細(xì)胞附著，冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活性，細(xì)胞因子TNF-α 高表達(dá)可誘導(dǎo)miR-181b 的表達(dá)，而高表達(dá)的miR-181b 可反向抑制 TNF-α 的表達(dá)，證實(shí) miR-181b 在 CHD 中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究的不足之處為總體樣本量較少，組內(nèi)比較樣本量相對(duì)更少；本研究主要為臨床實(shí)驗(yàn)，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較，不可控因素相對(duì)較多，可能存在一定偏差。

綜上所述，miR-181b 在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展通過(guò)各種途徑、機(jī)制可發(fā)揮保護(hù)作用，延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的病情發(fā)展，有望為冠心病的治療提供新的方向。