張 健，王彩霞，王迎春，鄭琳琳

（內蒙古大學生命科學學院, 內蒙古 呼和浩特 010000）

長葉紅砂（Reaumuria trigyna)又被稱為黃花紅砂或黃花琵琶柴，檉柳科（Tamarieaceae)琵琶柴屬（Reaumuria)，是一種強旱生泌鹽小灌木，主要分布于東阿拉善—西鄂爾多斯地區(qū)，是內蒙古自治區(qū)和國家重點保護植物之一[1]。由于其生境具有干旱、高鹽和低溫等特點，在長期的自然選擇下，長葉紅砂進化出了一種泌鹽結構—鹽腺，該結構在長葉紅砂適應鹽漬環(huán)境中發(fā)揮至關重要的功能[2]。此外，該植物還具有一定的藥用價值，其枝、葉及果實均可入藥，用于治療濕疹和皮炎等[3]。近年來，已先后對長葉紅砂的形態(tài)結構、耐鹽機制、轉錄組數(shù)據(jù)等進行了頗為深入的研究，為開發(fā)利用這種珍貴的植物資源提供了科學依據(jù)[4-6]。

在植物中，定向膜泡運輸是維持細胞穩(wěn)態(tài)、極性、生長和發(fā)育的基礎[7]，該過程涉及可溶性N-乙基馬來酰胺敏感因子連接復合體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor protein attachment protein receptor, SNARE)的參與，它通過在水環(huán)境中將囊泡和目標膜表面結合在一起來介導雙層融合[8]。有研究表明，膜泡結合膜蛋白（vesicle-associated membrane protein, VAMP)可能參與了含鹽囊泡的排出過程，該蛋白屬于R-SNAREs，在植物中以蛋白家族形式存在，如擬南芥（Arabidopsis thaliana)基因組中含有14個VAMP家族成員[9]。VAMPs 在植物物質運輸、生長發(fā)育及抵抗生物和非生物脅迫方面均發(fā)揮著重要作用[10-13]。AtSYP121、AtVAMP721/722 和AtSNAP33能夠組成三元復合體，在擬南芥免疫應答過程執(zhí)行重要功能，AtVAMP721/722的缺失將削弱擬南芥對劇毒卵菌以及宿主特異性和非特異性霉菌感染的防御能力[14]；Sugano 等[15]研究證實，定位于葉綠體和液泡膜上的OsVAMP714的過量表達可以增強水稻（Oryza sativa)對稻瘟病的抗性，同時促進葉鞘伸長；Ebine 等[16]報道了一種植物特有的R-SNARE 蛋白，將其命名為VAMP727，主要用于介導由胞內體向細胞質膜方向的運輸，該蛋白在擬南芥響應鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

本研究基于長葉紅砂耐鹽轉錄組數(shù)據(jù)分析[6]，結合RT-qPCR 結果發(fā)現(xiàn)，RtVAMP2-2基因（Genbank登錄號MZ852768)在鹽脅迫誘導下表達量顯著升高（P＜ 0.05)，表明RtVAMP2-2基因可能在長葉紅砂應對鹽脅迫中發(fā)揮一定的功能。因此，本研究克隆獲得膜泡運輸相關基因RtVAMP2-2，對其進行生物信息學、亞細胞定位和表達特性進行分析，并將該基因轉入擬南芥中進行進一步的功能鑒定，以期為長葉紅砂鹽腺泌鹽機理的闡明和開發(fā)該植物優(yōu)異抗逆基因資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株和載體

長葉紅砂種子于2017 年10 月采摘自內蒙古烏海市郊，野生型擬南芥 （Columbia-0)、本式煙草（Nicotiana tabacum)為牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室保存；Trans-T1 感受態(tài)細胞（全式金)、pMD19-T （TaKaRa)；農 桿 菌GV3101、pPZP221表達載體、pCAMBIA-1300 亞細胞表達載體也為牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室保存。

1.2 引物設計

RtVAMP2-2基因的序列篩選自前期已經獲得的長葉紅砂耐鹽轉錄組數(shù)據(jù)，序列的總長度為1 960 bp。使用在線工具ORF Finder，發(fā)現(xiàn)RtVAMP2-2基因的ORF 為1 074 bp。利用Primer 5.0 軟件，針對不同的用途，分別設計了不同的引物：設計一對引物用于RtVAMP2-2基因的克隆，分別在上下游引物5′末端插入了BamH I 和KpnI 酶切位點；設計一對引物用于RtVAMP2-2基因亞細胞定位分析，去掉終止密碼子，分別在上下游引物 5′末端插入了KpnI 和XbaⅠ酶切位點；設計一對引物用于RtVAMP2-2基因的RT-qPCR；設計一對引物用于內參基因RtActin的RT-qPCR （表1)。

表1 植物表達載體的構建及RT-qPCR 所需的引物序列Table 1 Primers sequences used in plant vector construction and RT-qPCR

1.3 RtVAMP2-2 基因的克隆

長葉紅砂總RNA 按照Eastep Super 說明書（Promega)提??；按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMII 1st strand cDNA synthesis kit （TaKaRa)的 說 明 書 以RNA 為模板合成cDNA 第一鏈，再通過oligo （dT)合成cDNA 第二鏈。以cDNA 為模板，使用上述用于pMD19T-RtVAMP2-2 載體構建的引物，用Trans start Taq 酶（全式金)擴增RtVAMP2-2基因編碼序列。PCR結束后產物回收，與pMD19-T 載體連接，將連接的產物轉化至感受態(tài)細胞Trans-T1 中。之后將菌落PCR 驗證呈陽性的菌株送至北京生工生物公司測序。

1.4 RtVAMP2-2 基因生物信息學分析

利用DANMAN 6.0 軟件分析蛋白的理論分子量和等電點；利用NCBI 網站識別ORF 并翻譯出氨基酸序列；利用在線工具Pfam 分析功能結構域；利用DANMAN 6.0 軟件進行氨基酸序列的比對。

1.5 RtVAMP2-2 基因的亞細胞定位分析

使用上述構建亞細胞定位載體的引物，PCR 擴增去掉終止密碼子的ORF，連接到pMD19-T 載體中，轉入大腸桿菌進行克隆。按照質粒提取試劑盒EasyPure Plasmid MiniPrep Kit （全式金)的說明書提取重組質粒與亞細胞定位載體pCAMBIA-1 300 一起進行雙酶切，將酶切產物用T4 DNA 連接酶（SIGMA)連接得到亞細胞定位重組載體，電轉到農桿菌中，之后用無針頭注射器注射到煙草中，待3～5 d 后利用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.6 RtVAMP2-2 基因的表達特性分析

將長葉紅砂種子剪去絨毛，放入10% NaCl 溶液中，浸泡過夜，再用10% NaClO 浸泡10～15 min，期間不斷用玻璃棒攪拌，放到超凈臺用滅菌水反復沖洗3～5 次，播種于固體MS 培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2～3 d后，置于溫度25 ℃、濕度70%、16 h/8 h （光照/黑暗)的人工氣候室中培養(yǎng)20～30 d，選擇長勢較好的幼苗移入裝有Hoagland 營養(yǎng)液的無菌大試管中，以相同的條件再培養(yǎng)15～20 d，選擇生長到10 cm 左右的長葉紅砂幼苗，進行鹽脅迫。將不同濃度（100、200、300、400、500 mmol·L-1)的NaCl 加入到Hoagland 營養(yǎng)液中處理6 h，不加NaCl 為對照組，其余濃度（Hoagland + NaCl)為 試 驗 組；使 用300 mmol·L-1NaCl 進行不同時間（3、6、12、24 h)的處理，NaCl 處理時間0 時即對照組，其余處理時間為試驗組，收獲葉片用液氮處理，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛√幚砗蟮拈L葉紅砂葉片RNA，反轉錄成cDNA，使用上述用于RT-qPCR 的引物，按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix 試劑盒說明書（全式金)，進行RTqPCR。不同處理各3 個重復。

1.7 擬南芥的遺傳轉化及轉RtVAMP2-2 基因植株的篩選和鑒定

利用上述帶KpnⅠ和BamH Ⅰ酶切位點的引物擴增RtVAMP2-2的ORF，將擴增產物同pPZP221 載體連接，將連接的產物轉化大腸桿菌，之后進行藍白斑篩選，將白色菌落提取質粒進行PCR 和雙酶切驗證，并將驗證結果正確的菌株送至北京生工生物公司測序。利用電轉法將構建成功的表達載體轉化到農桿菌中，再通過花序浸染法侵染擬南芥，在Gent 抗性培養(yǎng)基中篩選至T3 代純合體植株。通過基因組PCR、RT-qPCR 等技術對轉基因擬南芥進行鑒定，最終篩選出3 個轉基因株系。

1.8 轉RtVAMP2-2 基因擬南芥的耐鹽性分析

將野生型（Columbia-0)和3 個轉基因株系擬南芥種子播種到1/2 MS 固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待生長至7 d 后，將幼苗分別移到含有0、75、100 mmol·L-1NaCl 的脅迫培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長7 d 后測量根長，14 d 后測量鮮重和葉綠素含量。按照DAB 和BCIP/NBT 顯色試劑盒說明書（Coolaber 北京)進行操作，對轉基因擬南芥葉片進行DAB 和NBT染色。

2 結果

2.1 RtVAMP2-2 基因的克隆

在轉錄組數(shù)據(jù)中找到一段注釋為VAMP的基因序列，根據(jù)該序列設計引物，通過PCR 擴增克隆獲得基因編碼序列 （coding sequences, CDS) 1 074 bp（圖1A)。將該CDS 序列連接pMD19-T 載體，轉化到大腸桿菌中，菌液PCR 驗證與預期大小一致（圖1B)。經氨基酸序列比對，結果顯示其與NCBI 數(shù)據(jù)庫中多種植物VAMP2-2基因具有高度的同源性，因此命名為RtVAMP2-2。

圖1 PCR 擴增RtVAMP2-2 基因的ORFFigure 1 Amplification of the ORF of RtVAMP2-2 gene by PCR

2.2 RtVAMP2-2 基因的生物信息學分析

通過在線工具ORF Finder 分析發(fā)現(xiàn)，VAMP2-2基因的開放閱讀框（open reading frame, ORF)為1 074 bp，編碼氨基酸的數(shù)量為357。利用NCBI blast對VAMP2-2 氨基酸序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)VAMP2-2 蛋白與葡萄（Vitis riparia, XP_034706841.1)的相似度最高，為51%；與番木瓜（Carica papaya, XP_021891213.1)的相似度為50%；與陸地棉（Gossypiumhirsutum, XP_016672432.1)的相似度為50%；與菠菜（Spinacia oleracea, XP_021835062.1)的相似度為49%；與茶樹（Camellia sinensis, XP_028098258.1)的相似度為49%。利用在線工具Pfam 分析發(fā)現(xiàn)，VAMP2-2的N 端有主要精子蛋白（major sperm protein, MSP)結構域，此結構域是VAMP 蛋白家族的保守結構域，在動物體中參與精子的運動[17]。用DNAMAN軟件比對上述不同植物VAMP 蛋白的氨基酸序列，比對結果如圖2 所示，劃線處為MSP 結構域。

圖2 VAMPs 的氨基酸序列比對Figure 2 Amino acid sequence alignment of VAMPs

2.3 RtVAMP2-2 基因的亞細胞定位分析

為進一步了解RtVAMP2-2基因的功能，本研究分析了該基因的亞細胞定位情況。通過農桿菌轉化法，在煙草表皮細胞中，瞬時表達CaMV35S 啟動子驅動的RtVAMP2-2-GFP 融合蛋白。以pCAMBIA-1300載體作為陰性對照，以質膜定位的擬南芥PM-mCherry蛋白作為陽性對照。利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)陰性對照中綠色熒光分布于整個細胞中（圖3A)，而PM-mCherry 蛋白的紅色熒光與RtVAMP2-2蛋白的綠色熒光于細胞質膜上完全重合（圖3 B—D)，說明RtVAMP2-2 蛋白定位于細胞質膜。

圖3 RtVAMP2-2 蛋白的亞細胞定位Figure 3 Subcellular localization of RtVAMP2-2

2.4 RtVAMP2-2 基因的表達特性分析

采用RT-qPCR 技術分析RtVAMP2-2基因在不同組織的表達特性。結果顯示，該基因的表達量莖 ＞根 ＞ 葉（圖4)。

圖4 長葉紅砂不同組織中RtVAMP2-2 基因相對表達量Figure 4 The relative expression of RtVAMP2-2 gene in different tissues of Reaumuria trigyna

為了分析RtVAMP2-2基因在鹽脅迫下的表達特性，本研究檢測了RtVAMP2-2基因在鹽脅迫下的表達量。結果顯示，除200 mmol·L-1NaCl 處理外，其余濃度NaCl 處理下，RtVAMP2-2基因的表達量與對照組相比均顯著增加（P＜ 0.05)，在100 mmol·L-1NaCl 時，該基因的表達量最高，達到了對照組的2.76 倍 （圖5A)；之后分別利用300 mmol·L-1NaCl 進行不同時間梯度的脅迫，發(fā)現(xiàn)在300 mmol·L-1NaCl的處理下，基因的表達量隨處理時間的增加呈現(xiàn)平緩上升的趨勢，12 h 時達到頂峰 （圖5B)。上述結果說明，RtVAMP2-2基因可以被鹽脅迫所誘導。

圖5 長葉紅砂在NaCl 處理下RtVAMP2-2 基因的表達水平Figure 5 Expression level of RtVAMP2-2 gene under NaCl stress in Reaumuria trigyna

2.5 RtVAMP2-2 轉基因擬南芥的篩選

利用電轉法將真核表達載體轉化到農桿菌中，再通過花序浸染法侵染擬南芥，在Gent 抗性培養(yǎng)基中篩選獲得了T1 代轉基因擬南芥（圖6A)，收種子后再用相同的方式篩選，獲得純合體T3 代植株（圖6B)。提取DNA 進行PCR 擴增，發(fā)現(xiàn)轉基因擬南芥OE1、OE3、OE5 均可擴增出RtVAMP2-2基因的特異性片段，而野生型無條帶（圖6C)；將3 個轉基因株系提取RNA 進行RT-qPCR 檢測， 3 個轉基因株系中均擴增出特異性條帶（圖6D)，上述結果顯示目的基因己成功轉入擬南芥基因組中并進行穩(wěn)定表達。

圖6 RtVAMP2-2 轉基因擬南芥的篩選與鑒定Figure 6 Screening and identification of RtVAMP2-2 transgenic Arabidopsis

2.6 鹽脅迫條件下RtVAMP2-2 轉基因擬南芥的耐受性分析

為了分析RtVAMP2-2基因在植物應對鹽脅迫中發(fā)揮的作用，本研究對比了野生型擬南芥和轉基因株系的生長表型，并對根長、鮮重、葉綠素含量進行了測定。結果顯示，在對照組中，野生型和轉基因擬南芥長勢良好，并無明顯差異，但在不同濃度的鹽脅迫下，野生型和轉基因擬南芥的根長、鮮重、葉綠素含量均下降，且隨著NaCl 濃度的增加，生長受到抑制的程度愈發(fā)嚴重（圖7)，但野生型的生長狀況和相關指標一直優(yōu)于轉基因植株，反映出轉基因植株具有鹽敏感性。

圖7 不同濃度的NaCl 對轉RtVAMP2-2 基因擬南芥生長的影響Figure 7 Effects of different concentrations of NaCl on the growth of transgenic Arabidopsis

對野生型和轉基因擬南芥幼苗的葉片進行DAB 和NBT 染色。結果如圖8 所示，脅迫處理后轉基因植株葉片中積累了更多的藍色和褐色沉淀物，說明在鹽脅迫下，與野生型相比，轉基因株系積累了更多的ROS，氧化損傷程度更高。

圖8 不同濃度鹽脅迫下葉片的DAB 和NBT 染色Figure 8 DAB and NBT staining of leaves under salt stress

3 討論與結論

VAMP作為膜泡運輸相關基因，已經在動物和模式植物擬南芥中進行了廣泛研究，但是在泌鹽鹽生植物中卻鮮有報道。事實上，膜泡運輸已被證實在鹽腺泌鹽中發(fā)揮著關鍵作用[18]，因此在泌鹽鹽生植物中研究該基因，具有重要價值。本研究克隆獲得長葉紅砂RtVAMP2-2基因，并對其進行了生物信息學、亞細胞定位和表達特性分析，發(fā)現(xiàn)NaCl 能誘導RtVAMP2-2基因的表達，說明RtVAMP2-2基因可能在植物應對鹽脅迫中發(fā)揮作用，但具體發(fā)揮何種調控作用，需要通過轉基因或基因沉默等試驗進一步加以闡釋。

研究表明，VAMP 蛋白家族在植物應對鹽脅迫中發(fā)揮重要作用，但不同的成員對植物耐鹽性的影響大不相同。一些VAMP 蛋白對植物的耐鹽性具有積極作用，如Josselyn 等[19]利用微陣列和RT-qPCR技術發(fā)現(xiàn)番茄（Solanum lycopersicum)的SlVAMP727等SNARE基因與鹽脅迫呈正相關關系，暗示該基因在植物鹽脅迫應答中發(fā)揮重要作用。而另外一些VAMP 蛋白則對植物的耐鹽性具有消極作用，如Leshem 等[20]通過反義或突變AtVAMP711基因來抑制AtVAMP7C基因的表達，發(fā)現(xiàn)含H2O2的囊泡與液泡膜的融合受到抑制，使細胞質中保留許多含H2O2的大囊泡，使得突變植株的液泡免受活性氧的損傷，能夠發(fā)揮良好的功能，從而提高了植物的耐鹽性，推測該基因對植物的耐鹽性具有消極作用；Sun 等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)，高鹽度能夠誘導野生大豆GsVAMP72基因的表達，表明GsVAMP72可能參與植物應對鹽脅迫的響應，之后將GsVAMP72基因導入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)該基因的過量表達通過下調COR47、CORA15A、KRN1、RAB18和RD29A等應激反應基因的表達和改變細胞離子含量的方式，顯著降低了植物對鹽的耐受性。本研究中得到了與Sun 類似的結果，將RtVAMP2-2基因轉入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下轉基因擬南芥的生理指標比野生型更低，并且在葉片中積累了更多的活性氧，說明異源表達RtVAMP2-2基因可以通過抑制轉基因擬南芥根的生長，削弱光合作用效率，減少生物量積累，增加氧化損傷程度，從而導致轉基因植株對鹽的敏感性提高。

事實上，本研究發(fā)現(xiàn)的鹽脅迫下基因表達量上調，而轉基因擬南芥卻對鹽敏感的現(xiàn)象并不少見。例如曹揚榮等[22]發(fā)現(xiàn)煙草的NtRop1基因的表達水平受到NaCl 的誘導，將該基因轉到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉基因擬南芥對NaCl 的敏感性有所增加；王燕[23]將鹽脅迫下表達量顯著增加的唐古特白刺（Nitraria tangutorum)NtAOC基因轉入到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)該基因增加了擬南芥對鹽的敏感性。推測原因可能是RtVAMP2-2基因在不同植物應對非生物脅迫中所發(fā)揮的調控作用有所不同，特別是在鹽生植物和甜土植物存在較大差異，后續(xù)將進一步通過轉化鹽生植物二色補血草（Limonium bicolor)進行對比分析。

綜上，RtVAMP2-2基因在長葉紅砂應對鹽脅迫中發(fā)揮作用，轉RtVAMP2-2基因擬南芥對鹽敏感，推測RtVAMP2-2基因在植物耐鹽中發(fā)揮負調控作用。未來沉默或敲除植物中RtVAMP2-2的同源基因從而抑制其表達，可能是一種提高植物耐鹽性的有效手段。