王 嵐，趙 靜，孫鵬亮，塔·賽日吉瑪，李蓮瑞*

（1．塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾市843300；2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾843300）

豬巴氏桿菌病是指多殺性巴氏桿菌引起的急性流行性或散發(fā)性以及繼發(fā)性傳染病，該細(xì)菌一般侵襲豬的口腔、鼻咽和上呼吸道[1]。當(dāng)病原菌大量繁殖導(dǎo)致內(nèi)源性感染時，可引起豬發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病、局灶性感染及敗血癥[2]。近年來，豬群中流行的多殺性巴氏桿菌血清型為A、B和D型[3-4]，主要引發(fā)豬肺疫和進(jìn)行性萎縮性鼻炎等呼吸困難綜合征。巴氏桿菌病原菌常與多種病原混合感染動物機(jī)體，從而導(dǎo)致豬群患呼吸道疾病的概率提高，對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，巴氏桿菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病在規(guī)?；B(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶中普遍存在，冬季發(fā)病率較高，病豬生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響[5]。本試驗對南疆阿克蘇地區(qū)病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，通過菌落形態(tài)觀察、16S rRNA基因測序?qū)Ψ蛛x得到的菌株進(jìn)行鑒定，進(jìn)而確定引起豬出現(xiàn)呼吸困難癥狀的病原菌的種屬，為該地區(qū)由巴氏桿菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料樣品采自新疆阿克蘇地區(qū)阿克蘇宏盛牧業(yè)豬場病死仔豬的心臟、肝、脾、淋巴等。

試驗試劑：1%氫氧化鈉溶液、核酸染料、DNA maker、無菌水、結(jié)晶紫溶液、碘溶液、95%乙醇溶液等。

試驗儀器：GHP-9080恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、HVE-50高壓鍋（平山制作所株式會社）、Eppendorf 5453小型臺式高速離心機(jī)（德國艾本德）、Galanz G80F23CN3P-Q5CR0小型微波爐（美的集團(tuán)）、SW-CJ-2ED潔凈工作臺（賽默飛世爾科技有限公司）、ECLIPSE Ci-L顯微鏡（尼康儀器有限公司）、Thermo sciencific KZ04273/KZ01448/JZ35758微量移液器（德國艾本德）、DK-8D水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）、ZWY-2102C搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采取的病料放入500μL生理鹽水中，制成組織懸液，吸取200μL滴加在LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24～48 h。長出菌落后，在瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離純化培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 染色鏡檢

取清潔的載玻片，將25μL無菌生理鹽水滴在載玻片上，取分離純化的單菌落均勻涂于生理鹽水中使其分散，待晾干之后酒精燈外焰固定。細(xì)菌涂片革蘭氏染色，結(jié)晶紫染色1 min，水洗；碘溶液處理1 min，水洗；95%乙醇脫色30 s，水洗；沙黃復(fù)染15 s，水洗。烘干，油鏡下觀察并記錄菌體特征。

1.2.3 基因組DNA的提取

將篩選出來的菌珠接種到含150 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，并將其置于搖床中培養(yǎng)過夜。

細(xì)菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒（M10208）說明書操作。

1.2.4 16S rDNA擴(kuò)增

用通用引物擴(kuò)增16S rDNA全長序列。

PCR擴(kuò)增體系：DNA模板1μL、上下游引物各1μL、EasyTaq Super Mix 25μL、加入ddH2O 23μL后共組成50μL體系。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃再延伸10 min，35個循環(huán)。

1.2.5 16S rDNA鑒定巴氏桿菌16S rDNA克隆與pMD-19T載體自連克隆。PCR產(chǎn)物切膠回收按照北京全式金生物技術(shù)有限公司膠回收試劑盒（L41118）的說明進(jìn)行操作。

目的基因與pMD-19T連接反應(yīng)體系：16S rDNA片段0.5μL、pMD-19T Vector 3.5μL、Solution I 6μL。pMD-19T載體自連反應(yīng)體系：ddH2O 0.5μL、pMD-19T Vector 3.5μL、Solution I 6μL。

芽孢桿菌16S rDNA與pMD-19T載體自連轉(zhuǎn)化。

1.2.6 提取質(zhì)粒

按照高純度質(zhì)粒小提試劑盒的說明進(jìn)行操作。

1.2.7 測序?qū)㈣b定后為陽性的質(zhì)粒送測序（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2.8 序列分析測序所得的序列在NCBI BLAST上進(jìn)行核苷酸比對，鑒定該細(xì)菌的種屬[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株菌落形態(tài)結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，菌株經(jīng)48 h培養(yǎng)后，培基上出現(xiàn)光滑、圓形突起、淺白色半透明、邊緣整齊的菌落。用接種環(huán)挑取菌落，牽拉成絲。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strains

2.2 分離菌株染色鏡檢結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，分離菌株細(xì)胞呈桿狀、無芽孢、革蘭氏染色陰性。

圖2 分離菌株染色鏡檢（HE 10×100）Fig.2 Staining microscopic examination of isolated strains(HE 10×100)

2.3 16S rDNA電泳結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，使用通用引物序列擴(kuò)增出的細(xì)菌基因大小約為1 500 bp，與預(yù)期大小一致。

圖3 16S rDNA電泳結(jié)果Fig.3 Result of 16S rDNA electrophoresis

2.4 16S rDNA克隆質(zhì)粒鑒定結(jié)果（見圖4）

由圖4可知，擴(kuò)增的基因片段大小約為1 500 bp，與預(yù)期的基因片段大小一致，該克隆為陽性克隆。

圖4 16S rDNA克隆質(zhì)粒的鑒定結(jié)果Fig.4 16 s rDNA cloned plasmid of appraisal results

2.5 BLAST分析結(jié)果（見圖5）

由圖5可知，該菌株的16S rDNA長度為1 500 bp，將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸比較，該菌株為豬源巴氏桿菌。

圖5 16S rDNA測序結(jié)果Fig.5 Sequencing result of 16S rDNA

2.6 同源性分析（見圖6、圖7）

由圖6、圖7可知，將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸比對，建立進(jìn)化樹后分析表明，該菌株（PA）與登錄號為AF139584、AY465371、AY465373、NR_026032、AF139577、U66492、KM555273的巴氏桿菌處于同一分支，且根據(jù)同源性分析，該菌株與其他巴氏桿菌菌株同源性均為99%以上。根據(jù)以上結(jié)果可以確定該菌株為巴氏桿菌。

圖6 進(jìn)化樹分析Fig.6 Evolutionary tree analysis

圖7 同源性比較Fig.7 Homology comparison

3 討論

巴氏桿菌病是養(yǎng)豬業(yè)中一種重要的傳染性疾病。一般情況下，動物在發(fā)病前體內(nèi)已經(jīng)存在致病菌，當(dāng)畜禽機(jī)體抵抗力下降時，致病菌便乘虛侵入體內(nèi)，引發(fā)內(nèi)源性感染最終導(dǎo)致死亡。巴氏桿菌常與多種病原發(fā)生混合感染，在氣候變化劇烈等多種因素的共同作用下，豬群抵抗力降低，病原菌在其體內(nèi)大量繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性感染[7]。豬群發(fā)病后難以治療并且治療后容易復(fù)發(fā)，造成仔豬大量死亡。

近年來，由細(xì)菌感染引起動物發(fā)病的病例越來越多，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[8]。目前，疫苗免疫仍是預(yù)防巴氏桿菌病的重要措施之一[9]，因此，在日常養(yǎng)殖中，根據(jù)自身養(yǎng)殖場的實際情況，制定科學(xué)的疾病防控措施，始終以預(yù)防為主，防重于治的思維進(jìn)行科學(xué)化養(yǎng)殖；同時，養(yǎng)殖戶應(yīng)每年對豬巴氏桿菌疾病預(yù)防性的接種兩次，可有效預(yù)防或減少該病的流行，避免給養(yǎng)殖者帶來經(jīng)濟(jì)損失。

本研究通過從病料中分離到的一株細(xì)菌，根據(jù)菌落培養(yǎng)和染色鏡檢的特點，初步鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌。采用分子生物學(xué)方法對菌株進(jìn)行鑒定，并用16S rDNA通用引物對16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列測定，結(jié)果表明，該菌株為巴氏桿菌，說明新疆阿克蘇地區(qū)存在巴氏桿菌感染的情況。該養(yǎng)殖場應(yīng)及時進(jìn)行治療或淘汰，徹底清掃消殺后再重新飼養(yǎng)仔豬，制定合理的免疫程序，科學(xué)進(jìn)行防控；同時，要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，營造良好環(huán)境，減少疾病的發(fā)生，堅持以防控為主的綜合防治措施，以免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

本試驗對出現(xiàn)呼吸異常的仔豬的病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、16S rDNA分子生物學(xué)鑒定出該病料中有巴氏桿菌，證明該養(yǎng)殖場中出現(xiàn)呼吸困難的豬受到巴氏桿菌的感染。本試驗為豬巴氏桿菌的分離鑒定及進(jìn)一步研究致病機(jī)理提供參考。