程支利，陳智彬，郭鵬，李小榮

腎細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的3%，占腎惡性腫瘤的90%，是繼前列腺癌和膀胱癌后第三常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，但病死率最高，約為25%， 我國僅2015年就死亡23 400例[1]。目前，腎細(xì)胞癌的最佳治療方法是手術(shù)切除，但20%～40%的患者在腎切除后會復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。用于治療的靶點(diǎn)及隨訪的生物標(biāo)志物非常少是導(dǎo)致其預(yù)后不良的主要原因之一[3]。因此，有必要尋找新的靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物用于腎切除術(shù)后的治療及預(yù)后評估。微小RNA(miRNA)是一種長約22個核苷酸的單鏈RNA，可與目標(biāo)mRNA的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4-8]。研究表明，miRNA在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡，被認(rèn)為是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)[9-13]。微小RNA-579(miR-579)是近年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌分子，僅在少數(shù)腫瘤類型中有所報道，F(xiàn)attore等[14]發(fā)現(xiàn)miR-579可以抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，研究顯示miR-579與鼠雙微體2(MDM2)mRNA的3'-端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。此外，Kalhori等[15]發(fā)現(xiàn)miR-579通過與3’-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3’-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)mRNA相互作用，從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。但是，miR-579對腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響及PDK1、MDM2是否參與其作用機(jī)制均不清楚，因此本文旨在探討miR-579在腎細(xì)胞癌中表達(dá)的臨床意義及其生物學(xué)功能，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2014年3月四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院泌尿外科手術(shù)治療腎癌患者92例，患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療，術(shù)中獲取癌組織進(jìn)行病理學(xué)檢查確診，取癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣4～8 cm的正常腎組織)樣本，保存于液氮中作為研究對象，其中男54例，女38例，年齡41～75(59.32±9.96)歲。根據(jù)癌組織中miRNA-579水平的中位數(shù)，將患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組(各46例)。低表達(dá)組男24例，女22例，年齡32～59(51.43±9.61)歲23例，60～76(65.20±6.74)歲23例；腫瘤直徑1.1～4.8(3.9±1.1)cm 18例，5.1～9.8(6.8±1.5)cm 28例；高分化1例，中分化30例，低分化15例；Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期26例，Ⅳ期10例；透明細(xì)胞癌36例，非透明細(xì)胞癌10例。高表達(dá)組男30例，女16例，年齡35～59(52.26±9.38)歲18例，60～78(65.88±7.02)歲28例；腫瘤直徑1.2～4.5(3.7±0.9)cm 31例，5.0～9.1(6.4±1.1)cm 15例；高分化9例，中分化31例，低分化6例；Ⅰ期6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳ期2例；透明細(xì)胞癌31例，非透明細(xì)胞癌15例。2組患者腫瘤直徑、分化程度、臨床分期比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而性別、年齡、病理類型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗 為了研究miR-579對腎癌細(xì)胞增殖的影響，本研究首先檢測了miR-579在不同細(xì)胞株間的表達(dá)水平，包括人正常腎臟細(xì)胞株HK-2與腎癌細(xì)胞株Caki-1、A498、769-P、786-O(均購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)，結(jié)果顯示miR-579在A498細(xì)胞種的表達(dá)水平最低，因此選擇A498細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對象，以觀察上調(diào)miR-579水平能否抑制A498細(xì)胞的增殖。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)中，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱。miR-579類似物陰性對照(miR-NC)與miR-579類似物(miR-579 mimics)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，將A498細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即對照組、miR-NC組、miR-579組，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔2×105個細(xì)胞。miR-NC組和miR-579組分別使用miR-NC和miR-579 mimics進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書(美國Invitrogen公司)進(jìn)行操作。對照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 腎癌組織 miR-579表達(dá)水平檢測：采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測不同組織(患者癌組織與癌旁正常組織)及不同細(xì)胞(HK-2、Caki-1、A498、769-P、786-O及對照組、miR-NC組、miR-579組)中的miR-579水平。Trizol法(美國Promega公司)常規(guī)提取組織及細(xì)胞中的總RNA，然后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后應(yīng)用PCR試劑盒(日本Takara公司)對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，記錄各基因PCR擴(kuò)增后的CT值，使用2-△△CT法計算組織及細(xì)胞中miR-579的表達(dá)水平。引物合成于上海生工生物工程股份有限公司，見表1。

表1 引物序列

1.3.2 腎癌細(xì)胞吸光度值(OD值)測定： MTT法檢測3組細(xì)胞增殖水平。將3組細(xì)胞以5×103的細(xì)胞密度接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，將培養(yǎng)基吸棄，加入無血清培養(yǎng)液180 μl和MTT溶液(5 mg/ml，美國Sigma公司)20 μl，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，加入DMSO(美國Amersco公司)150 μl，震蕩5 min后，使用酶標(biāo)儀(美國Multiskan公司)于450 nm波長下測定OD值。

1.3.3 腎癌細(xì)胞PDK1、MDM2蛋白測定： 使用RIPA裂解液(上海碧云天公司)提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)測定蛋白濃度。取40 g的總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印后常規(guī)封閉2 h，加入一抗4℃過夜孵育，各一抗稀釋濃度：PDK1 1∶1 000，MDM2 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000均購自英國Abcam公司。次日，洗膜3次，加入二抗(武漢博士德公司)室溫孵育1 h，洗膜3次，ECL液(上海碧云天公司)顯色，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)下拍照。使用Quantity One軟件測定各條帶的灰度值，將對照組中目的蛋白與GAPDH灰度值之比作為1。

2 結(jié) 果

2.1 腎癌與癌旁組織中miR-579表達(dá)水平比較 腎癌組織中miR-579表達(dá)水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.63±0.26 vs. 1.44±0.42,t=16.010，P=0.000)

2.2 不同類型腎癌細(xì)胞株miR-579表達(dá)水平比較 與人正常腎臟細(xì)胞株HK-2(1.00±0.14)比較，腎癌細(xì)胞株Caki-1(0.39±0.15)、A498(0.18±0.08)、769-P(0.28±0.10)、786-O(0.25±0.11)miR-579的表達(dá)水平均降低(F/P=78.510/0.000)，且A498、769-P、786-O中miR-579表達(dá)水平顯著低于Caki-1，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F/P=5.987/0.002)，而A498、769-P、786-O間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F/P=2.772/0.080)，見圖1。

注： 與HK-2細(xì)胞比較，aP<0.05；與Caki-1細(xì)胞比較，bP<0.05

2.3 3組細(xì)胞中miR-579表達(dá)水平比較 miR-579組miR-579表達(dá)水平為3.11±0.24，顯著高于對照組(1.00±0.12)和miR-NC組(0.96±0.15)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F/P=480.200/0.000)，而對照組和miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t/P=0.659/0.519)，見圖2。

注：與對照組比較，aP<0.05； 與miR-NC組比較，bP<0.05

2.4 不同臨床/病理特征癌組織中miR-579水平比較 腎癌組織中miRNA-579水平在不同性別、年齡、病理類型中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)， 腫瘤直徑≥5 cm、分化程度低、臨床分期高的癌組織中miRNA-579水平顯著低于腫瘤直徑<5 cm、分化程度高、臨床分期低者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床/病理特征癌組織中miR-579

2.5 miR-579對腎癌細(xì)胞增殖的影響 與對照組和miR-NC組比較，miR-579組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h、72 h時的OD值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而對照組和miR-NC組3個時間點(diǎn)的OD值相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t/P=0.362/0.721、0.384/0.706、0.503/0.621)，見表3。

表3 3組細(xì)胞增殖水平(OD值)比較

2.6 miR-579對腎癌細(xì)胞中PDK1和MDM2表達(dá)的影響 與對照組和miR-NC組比較，miR-579組細(xì)胞中PDK1和MDM2的表達(dá)水平降低(P均<0.05)，而對照組和miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3，表4。

圖3 各組細(xì)胞PDK1和MDM2的表達(dá)水平比較

表4 3組細(xì)胞PDK1和MDM2表達(dá)水平比較

2.7 miR-579水平與腎癌預(yù)后的關(guān)系 對不同miR-579水平的腎癌患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示低表達(dá)組患者的生存率顯著低于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.684，P=0.030)，見圖4。

圖4 2組患者生存率比較

3 討 論

盡管miR-579在多種腫瘤類型中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)失調(diào)，但是一直未得到單獨(dú)且深入的研究，Li等[16]通過深度測序及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，包括miR-579在內(nèi)的14個miRNA可用于預(yù)測神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存率；Lin等[17]研究了肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌與非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中miRNA表達(dá)的差異性，結(jié)果表明28個miRNA在肝轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)發(fā)生變化，其中miR-579表達(dá)下調(diào)。本研究則基于上述報道，對miR-579在腎癌中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，并深入探討了其臨床意義與生物學(xué)功能，認(rèn)為其在臨床和基礎(chǔ)中均具有較好的研究價值和應(yīng)用前景。

本研究首先對腎癌組織及癌旁組織中miR-579的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示癌組織中miR-579表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，與Lin等[17]報道相一致，提示miR-579可能是一種抑癌基因。此外，腫瘤直徑大、分化程度低、臨床分期高的患者癌組織中miRNA-579水平較低，表明miR-579與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了進(jìn)一步探討miR-579水平對腎癌預(yù)后的影響，本研究對所有患者的生存情況進(jìn)行了為期60個月的隨訪，結(jié)果顯示低表達(dá)組患者的生存率明顯低于高表達(dá)組，提示低水平的miR-579可用于預(yù)測患者預(yù)后不良。但Azizian等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-579在直腸癌組織中表達(dá)升高，且與患者的低生存率顯著相關(guān)，與本研究結(jié)論不一致，可能與腫瘤類型、病例數(shù)量、隨訪時間等因素有關(guān)，未來需要通過增加病例、嚴(yán)格隨訪等方法進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。

本研究通過體外細(xì)胞試驗對miR-579的生物學(xué)功能做了進(jìn)一步研究，首先使用qRT-PCR檢測了不同類型腎癌細(xì)胞中miR-579的表達(dá)水平，結(jié)果顯示腎癌細(xì)胞株Caki-1、A498、769-P、786-O中miR-579的表達(dá)水平均顯著低于人正常腎臟細(xì)胞株HK-2，與腎癌組織中低表達(dá)的趨勢相吻合。其中，A498細(xì)胞中miR-579表達(dá)水平降低最為明顯，因此本研究選擇A498細(xì)胞作為后續(xù)研究的細(xì)胞類型。體外轉(zhuǎn)染miR-579模擬物后可顯著抑制A498細(xì)胞增殖，進(jìn)一步表明了miR-579的抑癌效應(yīng)。

為了探討miR-579抑制腎癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，在miR-579的相關(guān)報道中，發(fā)現(xiàn)2個可能的靶向抑制分子，即PDK1和MDM2[14- 15]。PDK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以促進(jìn)AKT蛋白質(zhì)磷酸化，從而激活PI3K/AKT信號通路，在細(xì)胞增殖、代謝等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[19-22]。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)，miR-375可通過靶向抑制PDK1，降低腎癌細(xì)胞的增殖和遷移，本結(jié)果也顯示，miR-579組細(xì)胞中PDK1表達(dá)水平低于對照組和miR-NC組，表明PDK1可能是miR-579的靶點(diǎn)之一。MDM2是p53的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期等過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24-26]。本結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)染miR-579模擬物可抑制MDM2表達(dá)，與Fattore等[14]的研究結(jié)論相一致，即miR-579可與MDM2相互作用而發(fā)揮靶向抑制效應(yīng)。

本研究的不足：(1)研究僅檢測了miR-579在組織中的表達(dá)情況，其在血清中的表達(dá)尚不清楚，血清miR-579水平能否用于早期診斷也有待進(jìn)一步研究；(2)除細(xì)胞增殖外，腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為還包括凋亡、遷移、侵襲等，但是本研究未對這些指標(biāo)進(jìn)行全面系統(tǒng)的檢測；(3)除PDK1和MDM2外，其他基因的表達(dá)也有可能是miR-579的靶點(diǎn)，未來仍然需要通過生物信息學(xué)、雙螢光素酶報告基因試驗等方法進(jìn)行篩選和驗證。

綜上所述，miR-579在腎癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，與腫瘤直徑、分化程度、臨床分期及低生存率有關(guān)。體外轉(zhuǎn)染miR-579模擬物可抑制細(xì)胞增殖，可能與抑制PDK1和MDM2表達(dá)有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

程支利：設(shè)計研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；陳智彬：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；郭鵬、李小榮：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改