郭 晉，范新浩，楊亞嵐，梁國明，唐中林,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因研究所，廣東嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)實驗室，深圳 518120)

碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CAs)是一類可催化二氧化碳和碳酸氫鹽的可逆水合金屬酶[1]，在不同物種的組織和細胞中表達水平不同[2]。由于CAs抑制劑與糖異生、尿素生成、脂肪生成、腫瘤發(fā)生等多種生理反應(yīng)有關(guān)[3-4]，CAs抑制劑現(xiàn)已成為肥胖和腫瘤等疾病治療的藥物[5-6]。線粒體(mitochrodria, MT)通過它自身表達的DNA、細胞質(zhì)中核基因編碼的蛋白質(zhì)和酶完成細胞內(nèi)的生物氧化過程[7]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體CA調(diào)節(jié)葡萄糖的氧化代謝、ROS的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激、線粒體的生物發(fā)生[8]。線粒體碳酸酐酶兩種同工酶CA5A(carbonic anhydrase，mitochondrial，5A；CA5A)和CA5B(carbonic anhydrase，mitochondrial，5B；CA5B)(以前被稱為CAVA和CAVB)在線粒體丙酮酸代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其通過可逆水合二氧化碳產(chǎn)生HCO3-：CO2+為丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸提供HCO3-，使草酰乙酸進入三羧酸循環(huán)途徑，是葡萄糖有氧代謝過程的關(guān)鍵底物。

人源碳酸酐酶(hCAs)參與大量的生理和病理過程，包括糖異生、脂肪生成、尿素生成、致瘤性以及各種病原體的生長和毒性[6, 10]，CA5(以前被稱為CAV)在糖異生、脂肪生成[6]、代謝調(diào)控[8, 11]和疾病發(fā)生[6, 8, 11-12]中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，這些hCAs已作為藥物靶點被深入研究，幾種hCA抑制劑已在臨床應(yīng)用[6]。小鼠線粒體碳酸酐酶CA5B與CA5A具有同源性[13]，小鼠CA5B基因在成年皮下脂肪和生殖器脂肪中表達量最高，小鼠胰島細胞中CA5在功能上可能與調(diào)節(jié)胰島素分泌有關(guān)[14]，此外，小鼠CA5參與調(diào)節(jié)脂肪細胞的丙酮酸羧化[15]和丙酮酸糖異生[16]。雙敲除(double knockout，DKO)CA5A和CA5B使小鼠高氨血癥增強和空腹血糖降低，表明CA5A和CA5B有助于尿素生成和調(diào)節(jié)糖異生[17]。

豬是人類最重要的蛋白來源和生物醫(yī)學(xué)模式動物之一。碳水化合物和脂肪是參與能量代謝的主要物質(zhì)，因此，研究分析豬代謝相關(guān)基因?qū)τ谌馄焚|(zhì)的改良有重要作用。目前，豬CA5B基因還沒有注釋，其表達及調(diào)控機制尚不清楚。本研究利用豬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析CA5B基因在發(fā)育過程中的表達特征以及組織中的表達情況，為研究CA5B的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集240日齡貴州小型豬(公、母各3頭)的心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、背最長肌、睪丸、卵巢組織。此外，采集通城豬和長白豬各27個生長發(fā)育時間點(出生前33、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105 d和出生后0、9、20、30、40、60、80、100、120、140、160、180 d)的骨骼肌，每個品種每個時間點采集3頭豬。上述組織樣品立即現(xiàn)場液氮快速凍存，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設(shè)備及試劑

臺式低溫離心機(Ependorff)、樣品研磨儀(Tekmar)、制冰機(SANYO)、1.5 mL離心管(AXY-GEN)、總RNA提取試劑盒(天根)。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA提取 取低溫保存的豬上述各種組織樣本提取總RNA，提取流程參照天根試劑盒說明書，提取的總RNA保存在-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 RNA轉(zhuǎn)錄組測序 取凍存的RNA，根據(jù)Illumina?TruSeqTMRNA樣品制備流程，構(gòu)建cDNA 文庫，利用Illumina HiSeqTM2500，采用雙端測序方法進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(GSE73763和PRJNA488311)。

1.3.3 RNA測序數(shù)據(jù)處理 用TopHat2[18]將得到的RNA測序數(shù)據(jù)比對到豬的參考基因組上，經(jīng)過注釋和計算，得到CA5B基因在各個樣本中RPKM(每萬reads中來自某基因每千堿基長度的reads數(shù))的表達情況。

1.3.4CA5B功能預(yù)測 從NCBI數(shù)據(jù)庫下載豬、人、小鼠、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓的CA5B基因的蛋白質(zhì)序列，利用EBI的多序列比對軟件Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對不同物種的CA5B進行多序列比對分析，利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)分析CA5B與其它蛋白的相互作用，利用DREP[19]數(shù)據(jù)庫(http://www.rnanet.org/editing/)分析CA5B潛在的RNA編輯位點，利用Targetscan、PicTar和miRanda工具預(yù)測CA5B基因的 3′UTR區(qū)域與miRNA結(jié)合位點，用R語言的cor.test()函數(shù)計算CA5B基因和miRNA表達量之間的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 CA5B的序列保守性分析

由于小鼠和人CA5B基因功能已有報道研究，為了探究豬CA5B基因功能，首先分析了豬、小鼠與人CA5B基因的保守性。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載豬(XP_020935797.1)、人(EAW98898.1)、小鼠(NP_851832.2)、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓的CA5B蛋白序列，利用EBI的多序列比對軟件Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行多序列比對分析。圖1為10個物種蛋白編碼序列的比對結(jié)果，在人、豬、小鼠、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓中，除小鼠外，其余序列相似性均在90%左右；就豬、人和小鼠的比對結(jié)果來看，豬和小鼠CA5B序列一致性為86.4%，而豬和人同源性為90.5%。說明豬CA5B蛋白序列與人相似度更近，與小鼠次之。

2.2 CA5B的系統(tǒng)發(fā)育樹

為研究CA5B基因在不同物種中的進化關(guān)系，利用MEG5軟件，以豬、人、小鼠、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓的CA5B的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬、狗與貓CA5B聚為一支，牛、綿羊與山羊CA5B聚為一支，這兩支屬于同一大分支，與人、猴CA5B具有相同的來源。這8個物種與馬聚為一大支，最后與小鼠CA5B聚為一支(圖2)。表明，與小鼠相比較，豬與人CA5B在進化上更近。

圖2 CA5B序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 CA5B的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)分析CA5B與其它蛋白的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CA5B互作的蛋白包括TMEM35、CYP24A1和XPNPEP2等基因編碼的蛋白質(zhì)(圖3)。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uniprot/)中檢索發(fā)現(xiàn)，與CA5B蛋白互作的這些基因在豬中的注釋較少，在人和小鼠中有較多注釋。

圖3 CA5B的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

CA5B互作蛋白功能：跨膜蛋白(transmembrane protein 35A，TMEM35)在細胞的過氧化物酶體中釋放的可溶性肽可調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突的生長；雄性至死因子3(male-specific lethal 3, MSL3)具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性及與甲基化組蛋白結(jié)合功能，在染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用；溶質(zhì)載體家族成員(solute carrier family 25 member 30, SLC25A30)為在小鼠和人心肌、骨骼肌中特異性表達的線粒體轉(zhuǎn)運蛋白，完成線粒體內(nèi)外的物質(zhì)運輸；富含脯氨酸的Gla 1(proline rich Gla 1,PRRG1)可編碼跨膜蛋白TMEM171，可與鈣離子結(jié)合；細胞色素P450(cytochromeP450, family 24, subfamily a, polypeptide 1,CYP24A1)基因編碼的蛋白質(zhì)作用于線粒體，其將骨化三醇降解為骨化醇，在維生素D分解和鈣穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用；TXLNG(taxilin gamma, taxilinγ)基因可編碼類肌球蛋白卷曲螺旋蛋白，在人和小鼠的細胞內(nèi)囊泡運輸中發(fā)揮作用，可能參與調(diào)控細胞周期和調(diào)節(jié)骨密度，該基因的表達可能引起脂多糖的上調(diào)；肽酶M20結(jié)構(gòu)域(peptidase M20 domain containing 2,PM20D2)編碼氨基酰化酶和氨基水解酶，催化蛋白質(zhì)水解；X-脯氨酰氨肽酶2(X-prolyl aminopeptidase 2,XPNPEP2)基因編碼氨基肽酶，催化鄰近脯氨酸殘基的N端裂解。

根據(jù)CA5B蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中互作蛋白的功能，推測CA5B可能參與調(diào)節(jié)生長和發(fā)育，線粒體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和線粒體外跨膜運輸，并且可能與骨骼肌鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細胞蛋白質(zhì)分解、脂多糖代謝調(diào)控有關(guān)。

2.4 CA5B基因的組織表達譜

為了研究CA5B在各組織器官中的表達特點，本研究利用已有的貴州小型豬心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、背最長肌、睪丸、卵巢9種組織的RNA數(shù)據(jù)[20]，分析CA5B在各種組織器官中的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CA5B在成年豬的脂肪、睪丸、卵巢中高表達，在骨骼肌、心肌和腎中表達水平較低(圖4)。

圖4 CA5B基因在豬中的組織表達譜

2.5 CA5B在骨骼肌生長發(fā)育中的時序表達

為了了解CA5B在骨骼肌生長發(fā)育過程中的作用，本研究利用已有的高通量測序數(shù)據(jù)，首次分析了該基因在通城豬和長白豬27個生長發(fā)育時間點(E33-D180)中骨骼肌的動態(tài)表達。發(fā)現(xiàn)，CA5B的表達水平在通城豬和長白豬的胚胎期高于出生后時期，在胚胎期逐漸升高，出生后降低；并且在胚胎發(fā)育后期80 d(E80)到出生0 d(D0)表達水平較高，通城豬在胚胎期80 d(E80)時表達水平最高，而長白豬在胚胎期85 d(E85)時表達水平最高(圖5)?？梢酝茢?，在通城豬和長白豬骨骼肌生長發(fā)育過程中，CA5B基因在胚胎期有重要作用，并且在胚胎骨骼肌發(fā)育后期至出生前發(fā)揮重要功能。

圖5 CA5B在通城豬和長白豬27個生長發(fā)育時間點骨骼肌中的動態(tài)表達

2.6 CA5B的RNA編輯

為探究CA5B的RNA編輯位點，在DREP[19]數(shù)據(jù)庫(http://www.rnanet.org/editing/)中分析CA5B潛在的RNA編輯位點，結(jié)果在CA5B基因的內(nèi)含子區(qū)域和3′UTR區(qū)域分別找到了1個和2個A-to-G類型的RNA編輯位點，這3個位點均位于重復(fù)元件Pre0_SS區(qū)域，屬于SINE/tRNA家族(表1)。

表1 CA5B的RNA編輯位點信息

2.7 CA5B與miRNA結(jié)合的生物信息分析

為找到可能調(diào)節(jié)CA5B的miRNA，本研究利用Targetscan、PicTar和miRanda工具預(yù)測CA5B基因的 3′UTR區(qū)域與miRNA的結(jié)合位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ssc-miR-22-5p可以與CA5B基因 3′UTR靶向結(jié)合(圖6)。通過計算CA5B基因和miRNA表達量之間的相關(guān)系數(shù)和P值，發(fā)現(xiàn)CA5B與ssc-miR-22-5p在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中的表達呈顯著負相關(guān)(R=-0.31,P=0.022，圖7)。表明CA5B的表達潛在受ssc-miR-22-5p調(diào)控。

圖6 CA5B與miR-22-5p靶向結(jié)合序列

圖7 CA5B與miR-22-5p表達相關(guān)性

3 討 論

線粒體在細胞和組織代謝中發(fā)揮重要作用，CA在線粒體內(nèi)不可或缺而被廣泛研究。CA5B和CA5A是線粒體丙酮酸代謝的重要底物，在葡萄糖有氧代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從組織表達情況來看，小鼠CA5B和CA5A的表達呈現(xiàn)出不同的組織特異性，在大多數(shù)組織中都檢測到CA5B，而CA5A的表達僅限于肝、骨骼肌和腎[13]。從序列上來看，CA5A基因序列在小鼠和人之間有78%相似性，CA5B基因序列在小鼠和人之間有95%相似性，CA5B的保守性更高[13]。人和小鼠CA同工酶序列之間的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，CA5B和CA5A都是從人和小鼠的祖先基因進化而來，并已經(jīng)進化出了不同的生理作用[13]。本研究將小鼠CA5B的蛋白結(jié)構(gòu)域序列與人和豬報道的CA5B結(jié)構(gòu)域序列進行比較發(fā)現(xiàn)，CA5B結(jié)構(gòu)域在豬和人之間的保守性(90.5%一致性)高于豬和小鼠CA5B保守性(86.4%一致性)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，人和豬CA5B在進化樹上優(yōu)先聚為一類，最后與小鼠聚在一起。因此，可以推斷CA5B基因在物種間的保守性更高。

根據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CA5B蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的基因編碼肌球蛋白卷曲螺旋蛋白、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白、線粒體跨膜蛋白、線粒體轉(zhuǎn)運蛋白以及氨基水解蛋白。據(jù)文獻報道，離子通道和代謝底物轉(zhuǎn)運中，人線粒體溶質(zhì)載體SLC家族與CA5B蛋白表達相關(guān)[21]，推測CA5B在豬中可能也參與調(diào)控線粒體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程，在線粒體內(nèi)能量代謝中發(fā)揮重要作用。根據(jù)CA5B高表達于豬的脂肪、睪丸和卵巢組織，這些都是ATP合成和利用的重要組織器官。CA5B基因在小鼠成年皮下脂肪和生殖器脂肪表達量最高，其參與調(diào)節(jié)脂肪丙酮酸羧化[15]、糖異生和尿素生成[17]。因此，推測CA5B在豬中可能也參與調(diào)控糖和脂肪的代謝。在豬骨骼肌27個生長發(fā)育時間點中，CA5B基因胚胎期表達水平高于出生后時期。推測豬的CA5B與骨骼肌生長發(fā)育以及能量儲存和利用有密切關(guān)系。與此同時，還發(fā)現(xiàn)CA5B可能受ssc-miR-22-5p調(diào)控。miRNA對機體發(fā)育和代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[22-23]，是靶基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[24]，參與調(diào)節(jié)骨骼肌細胞增殖[25-26]、分化[27-28]和再生[29]，一些miRNA調(diào)節(jié)成脂基因的表達、脂肪的形成[30]和分化[31]、白色脂肪棕色化[32]以及棕色脂肪擴張[33]。據(jù)研究報道，miR-22-5p是脂肪來源間充質(zhì)干細胞的的重要參考基因[34]，還在骨溶解中發(fā)揮重要作用[35]。因而，進一步推測ssc-miR-22-5p可能通過靶向CA5B參與調(diào)節(jié)豬的體內(nèi)發(fā)育和代謝。最后，本研究分析發(fā)現(xiàn)了CA5B基因的3個A-to-G編輯位點。RNA編輯位點可能參與調(diào)節(jié)基因表達和細胞功能[36]、骨骼肌發(fā)育[19]、疾病發(fā)生[37]和腫瘤的發(fā)展[38]，可能對豬基因的表達進行調(diào)控。

豬是重要的家畜，為我們的生活提供大量的蛋白質(zhì)和脂肪。因此，研究分析參與調(diào)節(jié)豬糖代謝和脂肪生成的CA5B基因?qū)τ谌馄焚|(zhì)的改良有一定的參考作用。但是，現(xiàn)在對豬CA5B的研究較少，因此需要對該基因進行深入的挖掘以及功能驗證。

4 結(jié) 論

本研究初步探討了CA5B基因在10個物種間的保守性和進化特征，CA5B蛋白可能參與細胞內(nèi)線粒體內(nèi)外ATP的合成、物質(zhì)轉(zhuǎn)運以及體內(nèi)氨基酸的分解代謝。ssc-miR-22-5p和3個RNA編輯位點潛在參與調(diào)控CA5B基因表達。CA5B可能在豬胚胎期的發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能，在豬出生后能量儲存和利用的組織中有關(guān)鍵作用。以上結(jié)果為更深入研究豬CA5B的功能提供了重要的信息和奠定了基礎(chǔ)。

致謝

感謝北京畜牧獸醫(yī)研究所豬基因工程與種質(zhì)創(chuàng)新團隊提供的科研平臺，感謝實驗室?guī)熜?、師姐、師弟、師妹在樣品采集和?shù)據(jù)分析時提供的幫助和支持，感謝團隊所有人員的照顧和幫助。