吳祁生 王芳 聶代靜 周曉蘇 陳佳琦，劉紅星，，*

血液腫瘤是發(fā)生于造血或淋巴組織的具有高度異質(zhì)性的疾病，其臨床診療需要結(jié)合病理、血細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞遺傳、分子生物學(xué)和臨床表現(xiàn)進(jìn)綜合分析。世界衛(wèi)生組織（world health or-ganization，WHO）的《造血與淋巴組織腫瘤分類》［1-2］與美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national compre-hensive cancer network，NCCN）的血液腫瘤臨床診療指南［3-5］都越來越多納入了具有臨床診斷分型和/或預(yù)后意義的基因變異指標(biāo)，包括基因突變、融合基因及基因異常表達(dá)等。這些基因變異在血液腫瘤的診斷分型、預(yù)后分層、治療指導(dǎo)、微小殘留病監(jiān)測(cè)和耐藥突變監(jiān)測(cè)等方面有重要臨床應(yīng)用價(jià)值［1-5］。下一代高通量基因測(cè)序（next generation se-quencing，NGS）可一次對(duì)多個(gè)腫瘤相關(guān)基因、全外顯子或基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測(cè)，具有通量高、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢(shì)［6-7］。

血液腫瘤臨床診療對(duì)NGS 的應(yīng)用有著迫切的需求。相對(duì)于病理機(jī)制研究和治療手段的巨大進(jìn)步，血液腫瘤的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)嚴(yán)重滯后，尤其是NGS的應(yīng)用方面。不同于傳統(tǒng)的分子診斷技術(shù)，血液腫瘤NGS 技術(shù)流程復(fù)雜，除核酸提取、PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物分析等步驟，還有文庫構(gòu)建、文庫富集和上機(jī)測(cè)序過程，更有測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析［8-9］。這套復(fù)雜的系統(tǒng)對(duì)“人、機(jī)、料、法、環(huán)”各方面的質(zhì)量管理和保證提出了更高的要求［10］。本文基于NGS 在血液腫瘤臨床應(yīng)用中的質(zhì)量管理要素現(xiàn)狀提出見解，并做以展望，以期為血液腫瘤NGS 臨床應(yīng)用的規(guī)范化起到正向作用。

1 “人”

NGS 技術(shù)操作步驟多、程序復(fù)雜，需不同崗位的專業(yè)人員分工協(xié)作，包括做“濕實(shí)驗(yàn)”的操作人員、“干實(shí)驗(yàn)”的生物信息分析人員和報(bào)告分析解讀人員等。雖然不同的崗位人員需要具備不同的技術(shù)能力，但又非截然分開，需要實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人統(tǒng)籌分配和崗位間的互相配合。國家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心2019年白血病融合基因BCR-ABL1的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)數(shù)據(jù)顯示，95%的做血液腫瘤基因檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室為血液科自建實(shí)驗(yàn)室［11］。

開展血液腫瘤NGS 檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備獲得國家要求的相應(yīng)資質(zhì)的專業(yè)人員（如醫(yī)師、技師和研究員等系列），實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS 知識(shí)和質(zhì)量管理能力，人員能力和數(shù)量應(yīng)滿足所開展檢測(cè)項(xiàng)目的要求。目前除少數(shù)血液病?？苹蛱厣t(yī)院外，血液科自建實(shí)驗(yàn)室基本都存在專業(yè)人員配置和崗位資質(zhì)考核等方面的欠缺。另外，國家和行業(yè)層面尚無針對(duì)血液腫瘤NGS“濕/干實(shí)驗(yàn)”的專業(yè)技術(shù)人員的能力評(píng)估和培訓(xùn)，臨床實(shí)驗(yàn)室也欠缺相應(yīng)的制度。目前血液腫瘤NGS 檢測(cè)均是使用實(shí)驗(yàn)室自建方法（laboratory developed tests，LDTs），“濕/干實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)目研發(fā)人員的短缺也是臨床實(shí)驗(yàn)室常態(tài)。當(dāng)前血液腫瘤NGS檢測(cè)專業(yè)技術(shù)人員的培養(yǎng)和儲(chǔ)備尚顯薄弱，有待進(jìn)一步的行業(yè)建設(shè)和發(fā)展。

2 “機(jī)”

目前國內(nèi)使用的NGS 儀器主要為Illumina 測(cè)序平臺(tái)、Ion Torrent 半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)和華大基因的CG 測(cè)序平臺(tái)［7］。除高通量基因測(cè)序儀外，開展血液腫瘤NGS 檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)配備滿足所開展檢測(cè)項(xiàng)目需求的其他儀器設(shè)備，如超凈臺(tái)、生物安全柜、純水儀、離心機(jī)、移液器、冰箱、PCR 儀和生物分析儀等。有能力開展血液腫瘤NGS 檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)根據(jù)所開展項(xiàng)目合理選擇測(cè)序平臺(tái)和相關(guān)輔助設(shè)備，還應(yīng)考慮標(biāo)本類型、標(biāo)本量、項(xiàng)目?jī)?nèi)涵、所需測(cè)序通量、周轉(zhuǎn)時(shí)間等因素。

當(dāng)前臨床實(shí)驗(yàn)室購置的高通量測(cè)序儀，大多數(shù)為尚未經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局（national medical product administration，NMPA）批準(zhǔn)的儀器，需要實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，以證明可滿足臨床預(yù)期用途。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立儀器使用、維護(hù)和校準(zhǔn)程序，并在日常工作中例行維護(hù)和定期校準(zhǔn)，以保證儀器設(shè)備的正常運(yùn)行，儀器設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)應(yīng)保存相應(yīng)記錄［12］。

3 “料”

不同于實(shí)體腫瘤的取材困難，血液腫瘤的標(biāo)本類型有骨髓、外周血和淋巴結(jié)等，樣本取材和保存相對(duì)容易，易獲得高質(zhì)量的核酸樣本。這對(duì)開展NGS 檢測(cè)是很大的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)樣本的采集容器、采集量、保存和運(yùn)輸條件等進(jìn)行確認(rèn)，以保證樣本質(zhì)量、避免交叉污染。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)做好樣本不合格率、樣本容器錯(cuò)誤率、標(biāo)本類型錯(cuò)誤率等質(zhì)量指標(biāo)記錄［13］。只有采集到符合質(zhì)量要求的樣本，才能為后續(xù)的NGS“濕實(shí)驗(yàn)”和得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)打好基礎(chǔ)。

在血液腫瘤領(lǐng)域，目前國內(nèi)尚無已通過NMPA 審批的成套的商品化NGS 檢測(cè)試劑。如何嚴(yán)謹(jǐn)負(fù)責(zé)地研發(fā)和建立LDTs 項(xiàng)目，并進(jìn)行性能評(píng)價(jià)（包括性能確認(rèn)和驗(yàn)證），是開展NGS 項(xiàng)目的臨床實(shí)驗(yàn)室必須解決的首要問題［14］。設(shè)計(jì)不合理或結(jié)果不可靠的LDTs 項(xiàng)目不僅不能發(fā)揮應(yīng)有的臨床價(jià)值，甚至可能造成NGS 推廣應(yīng)用的障礙。目前已有血液?？苹蛱厣珜?shí)驗(yàn)室開始積極進(jìn)行LDTs 的性能確認(rèn)工作，這是令人欣慰的事。但是對(duì)于大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室，建立血液腫瘤NGS-LDTs 項(xiàng)目的全流程工作，包括項(xiàng)目設(shè)計(jì)、技術(shù)路線選擇和試劑性能評(píng)價(jià)等，仍然存在很大挑戰(zhàn)。由于高建設(shè)門檻，很多醫(yī)院沒有能力開展NGS 檢測(cè)項(xiàng)目，這部分檢測(cè)需求被轉(zhuǎn)移到有能力的第三方獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室。

4 “法”

開展血液腫瘤NGS 檢測(cè)，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過試劑方法建立和性能確認(rèn)的過程，建立及完善整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)（包括“干/濕”實(shí)驗(yàn)流程），明確日常檢測(cè)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及關(guān)鍵點(diǎn)，形成檢測(cè)操作全過程的標(biāo)準(zhǔn)程序文件，并明確檢測(cè)系統(tǒng)的性能指標(biāo)和檢測(cè)局限性［15-16］。血液腫瘤NGS-LDTs 項(xiàng)目的全流程性能評(píng)價(jià)是人、機(jī)、料、法、環(huán)等要素的全面評(píng)價(jià)，相應(yīng)的指標(biāo)包括精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報(bào)告范圍等［17-18］。

與其他實(shí)體腫瘤相比，血液腫瘤的發(fā)生率相對(duì)較低，臨床血液病實(shí)驗(yàn)室可能在人力、物力和財(cái)力上得到的支持有限。因此，首先需要清楚本實(shí)驗(yàn)室使用NGS 的臨床預(yù)期用途是什么？比如融合基因篩查對(duì)白血病的診療、危險(xiǎn)度分層和預(yù)后判斷都有重要的意義，但用逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR 進(jìn)行有限數(shù)量的融合基因篩查會(huì)漏檢未涵蓋在檢測(cè)范圍內(nèi)的融合基因，只能解決部分問題［19-20］。使用轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）［21］，可接近全面地分析血液腫瘤中各種可能存在的融合轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)還能顯示基因變異的表達(dá)量［15］。如果將RNA-seq 融合基因篩查的LDTs 應(yīng)用于臨床檢測(cè)，就必須對(duì)該檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，用客觀數(shù)據(jù)證實(shí)其可顯著提高融合基因篩查的陽性率。

除了性能評(píng)價(jià)外，血液腫瘤NGS 臨床檢測(cè)還面臨著無商品化室內(nèi)質(zhì)量控制品（internal quality control，IQC）和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃（external quali-ty assessment，EQA）的難題。臨床血液病實(shí)驗(yàn)室需主動(dòng)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，以監(jiān)控每一次NGS 檢測(cè)結(jié)果，并且進(jìn)行周期性評(píng)價(jià)，以保證檢測(cè)系統(tǒng)的精密度。有少數(shù)臨床血液病實(shí)驗(yàn)室參加了國家衛(wèi)健委臨檢中心的“全國實(shí)體腫瘤體細(xì)胞突變高通量測(cè)序檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)”項(xiàng)目，以考核所開展的NGS 項(xiàng)目的結(jié)果準(zhǔn)確性。但是，血液腫瘤與實(shí)體腫瘤的體細(xì)胞突變頻率、樣本類型和處理方式均有很大不同，針對(duì)實(shí)體腫瘤設(shè)計(jì)的EQA 計(jì)劃并不完全適合血液腫瘤。臨床實(shí)驗(yàn)室還可選擇與已獲得能力認(rèn)可或使用相同測(cè)序平臺(tái)的外部實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行NGS 項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，以達(dá)到能力驗(yàn)證的目的。

5 “環(huán)”

開展血液腫瘤NGS 臨床檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)擬開展的檢測(cè)項(xiàng)目數(shù)量、所用技術(shù)流程、測(cè)序平臺(tái)和標(biāo)本量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室環(huán)境設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少設(shè)置5個(gè)功能區(qū)：試劑存儲(chǔ)和準(zhǔn)備區(qū)、樣本與文庫制備區(qū)、文庫擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)、上機(jī)測(cè)序區(qū)、數(shù)據(jù)分析和報(bào)告解讀區(qū)［12］。對(duì)開展測(cè)序深度及檢測(cè)限有很大差別的NGS 測(cè)序項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)室宜設(shè)置不同的樣本制備和文庫制備區(qū)域，以防止交叉污染發(fā)生。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境需注意通風(fēng)、潔凈度、溫濕度、震動(dòng)和光照等要求，以保證儀器設(shè)備的正常運(yùn)行和實(shí)驗(yàn)過程的穩(wěn)定性。

6 小結(jié)和展望

血液腫瘤標(biāo)本容易獲得，進(jìn)行NGS 檢測(cè)有著先天的優(yōu)勢(shì)。自從“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)（precision medi-cine）”的概念提出以來，血液腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用也走在各種腫瘤的前列。NGS 已在血液腫瘤臨床診療方面顯示出很好的應(yīng)用價(jià)值，例如：用RNA-seq 較為全面分析常見和少見型融合基因，用于血液腫瘤有明確意義的突變基因的靶向測(cè)序，用于指導(dǎo)個(gè)體化用藥的藥物基因組分析，用于血液腫瘤遺傳病基因突變篩查等。

NGS 提供了分析基因變異的強(qiáng)大工具，但檢測(cè)系統(tǒng)的復(fù)雜性增加了NMPA 審核的難度，限制了其落地臨床檢測(cè)的速度。建立和使用NGS-LDTs 是一種可行的方案，但應(yīng)堅(jiān)持嚴(yán)格的考查和準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)，即有明確的臨床預(yù)期用途，在臨床應(yīng)用中始終基于醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)和數(shù)據(jù)支持。國內(nèi)血液腫瘤和分子診斷領(lǐng)域的專家們已經(jīng)開始商討和制定一些NGS 在血液腫瘤應(yīng)用方面規(guī)范化的專家共識(shí)或?qū)＜医ㄗh，這將有助于促進(jìn)NGS 技術(shù)在臨床診療中的規(guī)范化應(yīng)用。