劉 英

（中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520）

火力楠（Michelia macclurei Dandy）又名醉香含笑，為木蘭科（Dagnoliaceae）含笑屬（Magnolia）常綠喬木，分布于我國廣東、海南和廣西北部以及越南北部，在我國福建、云南等地亦有引種。其生長速度快，適應(yīng)性強(qiáng)，已成為我國南方主要造林樹種之一。其樹干通直，木材紋理美觀，有香氣，硬度較高且耐腐，易干燥，少開裂而不反翹，是優(yōu)良的家具和建筑用材。其樹型美觀、花朵艷麗，是優(yōu)良的木本花卉、園林樹種；因其燃燒性差，也是我國南方一個(gè)主要的防火林帶樹種［1］。

近年來，林業(yè)科技工作者從火力楠種質(zhì)資源收集與評價(jià)［2］、苗木培育及栽培技術(shù)［3］、木材與林副產(chǎn)加工［4］等方面開展系列研究，拓展了火力楠開發(fā)應(yīng)用前景，造林規(guī)模日益增大。目前生產(chǎn)上主要應(yīng)用種子繁育造林苗，由于種苗差異大，林木分化嚴(yán)重，林分生產(chǎn)力難以提高。應(yīng)用前期優(yōu)良種質(zhì)材料開展組培快繁研究，將有利于良種壯苗的規(guī)?；a(chǎn)，推動(dòng)火力楠種植業(yè)的快速發(fā)展。

木蘭科植物含有較多的酚類物質(zhì)，容易褐化造成組織壞死而引發(fā)組培失敗［5］，增大組培難度。褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生因物種、品種及個(gè)體而異［6］，亦與無機(jī)鹽濃度［6～7］、培養(yǎng)基的NH4+、NO3-濃度［8］有關(guān)，選擇合適的基本培養(yǎng)基以及探究適宜的抗褐化措施是木蘭科植物組培快繁成功的關(guān)鍵所在。對于火力楠而言，僅柳曼瓊等［9］和李雪等［10］開展過增殖和生根培養(yǎng)的初步研究，由于二者增殖苗生長矮小，在生根培養(yǎng)之前均需要經(jīng)過壯苗環(huán)節(jié)才能達(dá)到生根瓶苗標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間長，生產(chǎn)成本升高，污染概率亦增大，不利于組培苗高效生產(chǎn)；二者均以個(gè)別材料為對象，其生根培養(yǎng)基及生根效果差異大，說明個(gè)體間存在組培難易程度差異。因此，改善火力楠繼代培養(yǎng)基配方，促進(jìn)增殖培養(yǎng)中芽苗的抽高生長，提高生根芽苗的出苗率，可提升組培苗生產(chǎn)效率；而且研究諸多個(gè)體間組培配方差異，對于火力楠組培苗規(guī)?；咝a(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究以火力楠2個(gè)優(yōu)良家系10個(gè)胚系為試驗(yàn)材料，從基本培養(yǎng)基、抗褐化、生根誘導(dǎo)等方面開展組培研究，旨在探索出適應(yīng)大多數(shù)胚系生長的組培配方，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)苗木的規(guī)?；a(chǎn)，亦為優(yōu)良火力楠無性系的組培快繁研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

消毒試驗(yàn)選用家系A(chǔ) 和B 的種子與種胚，其種子采自廣東省云浮市廣東省仙菊林場火力楠采種母樹林?；九囵B(yǎng)基篩選及聚乙烯比洛烷酮（簡稱PVP）抗褐化濃度篩選試驗(yàn)應(yīng)用A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、B1 和B2 無性胚系。生根促進(jìn)劑類型及濃度試驗(yàn)選擇能抽高生長的A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、B1和B2無性胚系。

1.2 方法

1.2.1外植體消毒及初代培養(yǎng)

采用0.1%的升汞溶液分別對洗凈后種子浸泡處理15、20、30 和40 min，對洗凈后剝殼的胚浸泡處理3、6、9 和12 min，然后用無菌水浸泡清洗，5 min一次，處理4～5次，接種于初代培養(yǎng)基上，每瓶1粒種子，每個(gè)處理30瓶，重復(fù)3次。

采用MS+0.5 mg·L-16BA+0.2 mg·L-1IBA 為初代培養(yǎng)基，pH6.0～6.2，35 g·L-1蔗糖。在光照強(qiáng)度為2 000～3 500 lx，室溫25±1℃，光照時(shí)間8 h·d-1的條件下培養(yǎng)30、60 和90 d 后調(diào)查消毒效果，統(tǒng)計(jì)染菌數(shù)、胚死數(shù)、無菌活胚數(shù)，匯總統(tǒng)計(jì)分析染菌率、胚死率、無菌胚成活率和胚萌發(fā)率。

1.2.2增殖培養(yǎng)

基本培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)：剪取1.0 cm 左右的頂芽或側(cè)芽，設(shè)置MS、3/4MS、2/4MS、1/4MS和LY等5個(gè)基本培養(yǎng)基。LY培養(yǎng)基是由MS改良而來，其大量元素含量為：250 mg·L-1NH4NO3、340 mg·L-1KH2PO4、555 mg·L-1MgSO4、1 900 mg·L-1KNO3、332 mg·L-1CaCl2、85 mg·L-1Ca（NO3）2。各培養(yǎng)基均添加0.2 mg·L-16BA、0.2 mg·L-1IBA、35 g·L-1蔗糖，微量元素和有機(jī)質(zhì)含量均為MS。

聚乙烯比洛烷酮（簡稱PVP）抗褐化濃度篩選試驗(yàn)：采用LY 基本培養(yǎng)基，設(shè)置0、2、4、6和8 g·L-15個(gè)PVP濃度梯度開展抗褐化試驗(yàn)。

培養(yǎng)35 d，調(diào)查統(tǒng)計(jì)以下指標(biāo)：

同時(shí)，調(diào)查培養(yǎng)基褐化情況。培養(yǎng)基褐化分級標(biāo)準(zhǔn)為：1 級，培養(yǎng)基無褐化；2 級，25%培養(yǎng)基淺色褐化；3級，50%培養(yǎng)基淺色褐化；4級，75%培養(yǎng)基淺色褐化；5 級，100%培養(yǎng)基淺色褐化；6 級，100%培養(yǎng)基深色褐化。

以上試驗(yàn)每個(gè)胚系均設(shè)置5 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)15瓶。

1.2.3生根培養(yǎng)

選取苗高≥3.0 cm且具3片以上充分展開葉子的芽苗，應(yīng)用IBA 及ABT 2 號生根粉兩種生根促進(jìn)劑設(shè)置5 個(gè)濃度梯度開展雙因素試驗(yàn)。兩種生根促進(jìn)劑的濃度處理均為0（對照）、2.5、5.5、8.5、和11.5 mg·L-1?；诹偟龋?4］和李雪等［15］的生根誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基，調(diào)整生根基本培養(yǎng)基為0.4MS，添加380 mg·L-1Ca（NO3）2、25 g·L-1蔗糖，微量元素和有機(jī)質(zhì)含量均為MS。每個(gè)胚系10 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)20 瓶，培養(yǎng)40 d 時(shí)調(diào)查生根條數(shù)和生根率。

1.2.4煉苗與田間移植

生根培養(yǎng)45 d后，在光照強(qiáng)度5 000～10 000 lx的條件下煉苗7～15 d，然后分生根與未生根瓶苗進(jìn)行移植。移植前用0.5%高錳酸鉀消毒育苗基質(zhì)（黃心土∶草炭土=7∶3，體積比），移植后一個(gè)星期內(nèi)蓋薄膜，并適當(dāng)遮蔭，按常規(guī)方法進(jìn)行組培苗管理。對于未生根瓶苗，移植前還需用500 mg·L-1的2 號生根粉浸泡10 min。移植30 和60 d 后分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)生根和未生根瓶苗的移植成活情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒

應(yīng)用0.1%升汞溶液對火力楠種子消毒15～45 min，均未獲得無菌種子，即使是最長的45 min處理，90 d 后依然從種孔內(nèi)長出霉菌，污染率達(dá)100%。而應(yīng)用0.1%升汞溶液消毒胚的5 個(gè)處理中，除15 min 消毒處理胚全部殺死之外，其余4 個(gè)處理（消毒3～12 min）均能獲得無菌胚（見表1）。尤以6 和9 min 處理最好，無菌胚成活率和萌發(fā)率顯著高于其他處理（P＜0.05），萌發(fā)率高達(dá)60%～65%，胚在消毒10～30 d 后萌發(fā)。3 min 處理略差，染菌率顯著增高；12 min 處理時(shí)間過長，胚死率顯著增高，萌發(fā)率顯著降低。

表1 火力楠胚外植體的消毒效果Table 1 DisinfectioneffectforembryoexplantsofM.mac?clurei

2.2 初代培養(yǎng)基對胚培養(yǎng)的影響

各胚系在MS 培養(yǎng)基（MS+6BA 0.5mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1）上進(jìn)行初代培養(yǎng)（見圖1），第一代（培養(yǎng)45 d）形態(tài)生長正常，不同胚對6BA 的敏感程度差異明顯，出現(xiàn)直接誘導(dǎo)叢芽、單芽、未長芽等現(xiàn)象。轉(zhuǎn)接3 代時(shí)，胚生長嚴(yán)重分化，出現(xiàn)正常生長、葉片及芽黃化及培養(yǎng)基褐化、頂芽枯死、葉片變形、生根后側(cè)芽仍然死亡等情況。由此可見，大多數(shù)火力楠胚在MS培養(yǎng)基上生長不良，而且對于部分胚系而言，6BA 濃度（0.5 mg·L-1）偏高，存在玻璃化風(fēng)險(xiǎn)。因此，增殖培養(yǎng)時(shí)需要優(yōu)化基本培養(yǎng)基，降低6BA濃度。

2.3 大量元素對火力楠增殖培養(yǎng)的影響

大量元素含量對各胚系增殖影響顯著（見表2～3），5 個(gè)處理間差異達(dá)到顯著水平。采用MS 基本培養(yǎng)基（大量元素含量為4 410 mg·L-1），80%的胚系出現(xiàn)嚴(yán)重玻璃化及褐化、爛芽、死芽等現(xiàn)象；1/4MS 基本培養(yǎng)基（含量為1 102.5 mg·L-1）處理的增殖芽少，葉片變形，生長緩慢；3/4MS 基本培養(yǎng)基（含量為3 307.5 mg·L-1）可以緩解前二者的部分問題，但不能生產(chǎn)高3 cm 以上的芽苗；采用1/2 MS基本培養(yǎng)基（含量為2 205 mg·L-1），A6、B1、B2 等3個(gè)胚系可生產(chǎn)高3 cm 以上的芽苗，但其比例小于10%，其余70%的胚系不能產(chǎn)苗；LY 基本培養(yǎng)基（含量為3 520 mg·L-1）處理的芽苗生長正常，80%胚系（A2 和A4 例外）的平均增殖芽數(shù)達(dá)到2.5 個(gè)以上，90%胚系（A8 未抽高）明顯抽高，3 cm 以上芽苗占比最高達(dá)到50.8%，各項(xiàng)指標(biāo)顯著優(yōu)于其他4個(gè)培養(yǎng)基處理。

各胚系對大量元素含量的需求差異顯著，A6和B1在1/4MS～MS 各種培養(yǎng)基上均能正常生長，其他80%胚系只能在1/4MS～1/2MS 培養(yǎng)基上正常生長良好，但是所有胚系在LY 培養(yǎng)基上生長最好。各胚系的平均芽數(shù)、平均芽高、高3 cm以上芽苗平均占比在相同培養(yǎng)基上差異亦達(dá)到顯著水平。

大量元素含量對增殖培養(yǎng)基的褐化影響差異顯著（見表4），各胚系在1/4MS～MS 的總鹽份含量中，隨著含量的增大褐化顯著加??；1/4MS 培養(yǎng)基的褐化程度顯著高于LY，1/2MS～MS 培養(yǎng)基的褐化程度則極顯著高于LY（P<0.01）。由此可見，LY 基本培養(yǎng)基抗褐效果最好。對于每個(gè)培養(yǎng)基處理，各胚系間褐化程度均差異顯著。

2.4 抗氧化劑對火力楠增殖培養(yǎng)的影響

添加PVP 能夠有效吸附酚類化合物，降低醌的合成，從而減小褐化為害。在0～4 g·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加各胚系褐化為害顯著降低（見表5）；4～8 g·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加褐化為害差異不顯著（P≥0.05）；因此，4 g·L-1為最佳使用濃度。在0～8 g·L-1PVP 濃度范圍內(nèi)，各胚系間的褐化為害差異顯著，褐化最輕的胚系A(chǔ)6 和B1 與褐化最重的A5、A7 和A8 差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

PVP的添加對增殖芽數(shù)的影響不大（見表6）。在0～8 g·L-1濃度范圍內(nèi)，各胚系平均芽數(shù)隨濃度的增加小幅升高，但差異未達(dá)顯著水平。胚系間平均芽數(shù)差異顯著。B2 平均芽數(shù)最多，與A3、A5、A6 大多差異不顯著，而顯著高于其他胚系；A2、A4平均芽數(shù)最少，顯著低于其他胚系。

PVP 的添加有利于增殖芽苗的抽高生長（見表6）。在0～8 g·L-1的濃度范圍內(nèi)，各胚系隨PVP濃度的增加苗高生長增大。A8在6 g·L-1濃度時(shí)才顯著抽高生長，且無高3 cm以上的芽苗產(chǎn)出；其他9 個(gè)胚系在4 g·L-1濃度時(shí)，苗高生長顯著增大，且隨PVP 濃度的增加，高3 cm 以上芽苗占比亦增大，且濃度達(dá)4 g·L-1以上時(shí)基本穩(wěn)定。

2.5 生根促進(jìn)劑對火力楠生根培養(yǎng)的影響

ABT 2 號生根粉生根誘導(dǎo)效果極顯著高于IBA（見表7）。2.5 mg·L-1濃度時(shí)，2 號生根粉誘導(dǎo)50%以上胚系生根；8.5 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)近70%胚系生根，最高生根率達(dá)為93.6%。IBA 在2.5～5.5 mg·L-1濃度范圍內(nèi)僅誘導(dǎo)10%胚系生根，8.5 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)50%以上胚系生根，生根率均極顯著低于ABT2 號生根粉。9 個(gè)胚系間生根誘導(dǎo)差異極顯著。以ABT2 生根粉的處理效果比較，A1、A3 生根率最高，達(dá)到80%以上，A5、B1、A6 分別為55.8%、61.5%、35.6%，A4 僅5%，A2、A7、B2 不生根。

A1 胚系在2.5～8.5 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，生根率隨濃度升高而極顯著升高，8.5 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值；11.5 mg·L-1時(shí)，生根率又極顯著降低。生根條數(shù)隨濃度的升高而增多，8.5 和11.5 mg·L-1濃度處理顯著高于其他處理。其他胚系得生根率變化規(guī)律與A1相似。

表2 大量元素濃度對火力楠繼代苗生長的影響Table 2 Effects of macro-element concentration on growth of subculture plantlets for M.macclurei

表3 大量元素濃度對火力楠增殖苗生長的影響Table 3 Effects of macro-element concentration on growth of proliferating plantlets for M.macclurei

表4 大量元素濃度對培養(yǎng)基褐化的影響Table 4 Effect of macro-element concentration on medium browning

表5 PVP濃度對培養(yǎng)基褐化的影響Table 5 Effect of PVP concentration on medium browning

表6 PVP濃度對增殖苗抽高生長的影響Table 6 Effect of PVP concentration on height growth of plantlets

2.6 瓶苗移植效果

煉苗后，將瓶苗分類移植。30 d 后生根芽苗移植成活率高達(dá)90%以上，60 d 后未生根芽苗移植成活率達(dá)80%以上。

3 討論

利用種胚開展組培研究，能否獲得無菌外植體，主要與種子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、消毒方法有關(guān)。對于種孔緊密、外菌不易侵入的種子而言，確定好藥劑和消毒時(shí)間即可直接消毒種子獲得無菌外植體［11～12］；帶胚蓋的棕櫚科種子，種子消毒后還需要去除胚蓋［13］；火力楠種孔不緊密、無胚蓋，胚表面存有雜菌，消毒難度大，只有去除種殼取出胚進(jìn)行消毒才能成功。應(yīng)用0.1%升汞溶液消毒胚6～9 min，能獲得60%～65%無菌且可萌發(fā)的外植體。

基本培養(yǎng)基是影響組培苗正常增殖的重要因素，也是引起褐化發(fā)生的主要因素之一［14］。大量研究表明，低濃度無機(jī)鹽有利于降低褐化［6～7］，降低NH4+、提高NO3-濃度能減輕組織褐化［8］。有人采用1/2MS［9］和1/3MS［10］大量元素開展火力楠增殖培養(yǎng)，盡管繁殖系數(shù)高，但其芽苗矮小，需經(jīng)30～35 d 壯苗培養(yǎng)方可進(jìn)行生根培養(yǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)胚系在1/4～1MS 各種培養(yǎng)基上均能正常生長；其他8 個(gè)胚系在1/4～1/2MS 上才能正常生長，若大量元素濃度再增加，則導(dǎo)致增殖苗玻璃化及褐化加劇，與以往研究結(jié)果基本一致。所有胚系均在LY 培養(yǎng)基上增殖效果最佳，究其原因，與大量元素配比有關(guān)。LY 培養(yǎng)基調(diào)整了NH4NO3、KH2PO4和MgSO4的含量，并添加Ca（NO3）2，各元素配比發(fā)生變化，其鹽分含量為3 520 mg·L-1，比MS含量低，比其他1/4～3/4MS含量高，增殖芽苗生長正常，極顯著降低褐化程度、提高增殖倍數(shù)和生根有效苗率。由此可見，調(diào)整大量元素配比相較鹽分濃度，對火力楠組培增殖效果影響更大。采用LY 培養(yǎng)基，僅A8 胚系難抽高，其余9 個(gè)胚系抽高生長明顯，6 個(gè)胚系3 cm 以上高度芽苗占比在30%以上，2個(gè)胚系在50%。在最優(yōu)培養(yǎng)基LY 上，各胚系間褐化差異并沒有1/4MS～MS系列培養(yǎng)基明顯，說明LY培養(yǎng)基具有其普適性。

酚類物質(zhì)經(jīng)氧化形成醌類化合物，在氨酸酶的作用下，與繁殖材料的蛋白質(zhì)聚合，造成其他酶系統(tǒng)的失活而致代謝混亂，影響植物生長。因此，對于酚類物質(zhì)含量高的木蘭科植物而言，解決褐化毒害問題是實(shí)現(xiàn)其組培成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。選擇適宜外植體［6］、基本培養(yǎng)基［6～7］、生根促進(jìn)劑類型及濃度［15～16］、添加抗氧化劑［15～18］是抗褐化的主要方法。PVP 是一種酚類物質(zhì)吸附劑，通過吸附酚類物質(zhì)阻止醌類物質(zhì)形成，達(dá)到抗褐化之目的［19］。如，天女木蘭在PVP 1 g·L-1濃度時(shí)，能有效降低褐化傷害［17］；景寧木蘭在PVP 0.5～2.0 g·L-1濃度內(nèi)，褐化率隨濃度增加而顯著降低［18］。本研究中，在0～8 g·L-1PVP 濃度范圍內(nèi)，各火力楠胚系褐化為害均先隨PVP 濃度增加而降低，到4 g·L-1時(shí)抗褐化效果顯著最佳，此后抗褐化效果趨于穩(wěn)定，說明4 mg·L-1PVP 能有效地消除火力楠的褐化為害，PVP 用量較天女木蘭和景寧木蘭大得多。比較表3 和表6 可以看出，對于最佳抗褐化培養(yǎng)基LY 而言，添加PVP對于增殖芽數(shù)量效果不明顯，但能夠明顯提高增殖苗的抽高生長，表現(xiàn)在高3 cm 以上芽苗占比明顯增大，由15.2%～50.8%增至34.4%～75.8%。

生根是植物的一個(gè)復(fù)雜生理生化過程，多數(shù)木蘭科植物組培生根難［20］，其難易程度因樹種而異。李艷等添加NAA 1.0 mg·L-1在1/2MS 基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)白玉蘭、二喬玉蘭、紫玉蘭生根，生根率分別為68%、81%、43%［21］；利用1/2MS 基本培養(yǎng)基開展火力楠生根培養(yǎng)，柳曼瓊等添加細(xì)胞分裂素（ZT 0.5～0.6 mg·L-1）、生長素（NAA 1.5～2.0 mg·L-1、IAA 2～2.5 mg·L-1）以及椰乳（15%～20%）誘導(dǎo)生根，獲得約29.4%的生根率［9］，李雪等僅添加生長素（IBA 2.0 mg·L-1及NAA 3.0 mg·L-1）即獲得93.25%的生根率［10］，其生根難易程度差異可能與個(gè)體有關(guān)。這種現(xiàn)象在本研究中亦得到證實(shí)，在最佳處理（8.5 mg·L-1ABT 2 號生根粉）下，生根率為0%～93.6%，胚系間差異極顯著，可能與個(gè)體的遺傳基因有關(guān)。ABT 2 號生根粉的生根效果極顯著優(yōu)于IBA，無論是ABT 2 號生根粉還是IBA，火力楠生根率隨著生根促進(jìn)劑濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在濃度為8.5 mg·L-1時(shí)生根效果最佳。究其原因，適宜濃度的IBA 有利于植株內(nèi)源IAA 的合成，促進(jìn)植物生根，過高濃度反而降低［22～23］；ABT 2 號生根粉為廣譜性生根劑［24］，其生根誘導(dǎo)效應(yīng)亦是如此。

4 結(jié)論

應(yīng)用0.1%升汞溶液消毒火力楠胚6～9 min，能成功獲得無菌胚系，其萌發(fā)率為60%～65%。采用LY 基本培養(yǎng)基，添加4 g·L-1PVP 進(jìn)行增殖培養(yǎng)，能有效降低LY 培養(yǎng)基的褐化程度，促進(jìn)瓶苗抽高生長，顯著提高生根瓶苗出苗率。采用8.5 mg·L-1ABT2 號生根粉進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率可達(dá)93.6%。瓶苗移植成活率在80%以上?？偠灾狙芯揩@得以火力楠種胚為外植體的組培方案，為后續(xù)火力楠無性系組培研究和優(yōu)質(zhì)苗木生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。