高葦 楊利娟 劉春艷 張春祥 王勇

摘 要：為了從豐富的土壤微生物資源中挖掘?qū)ξ鞴峡菸∮休^高防效的生防菌株，通過梯度稀釋和平板涂布法分離獲得西瓜根際土壤主要細(xì)菌，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)和測(cè)定盆栽防效的方法，從中篩選出對(duì)西瓜枯萎病有較強(qiáng)拮抗活性的菌株，并通過菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA和gyrA基因序列比對(duì)獲得生防菌株的分類地位。結(jié)果表明，從8份西瓜根際土壤中分離純化到182個(gè)細(xì)菌單菌落，并篩選獲得對(duì)西瓜枯萎病防效較高的3株拮抗細(xì)菌，接種30 d后盆栽防效均高于75%，與30%噁霉靈水劑防效無顯著差異。綜合形態(tài)特征、生理生化特性及序列分析結(jié)果，明確拮抗菌株JHXG0406為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），拮抗菌株JHXG0221和XQXG0111為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。獲得了3株對(duì)西瓜枯萎病有較好防效的菌株，具有作為生防菌劑開發(fā)應(yīng)用的潛力。

關(guān)鍵詞：西瓜;枯萎病;拮抗細(xì)菌;防治效果;鑒定

中圖分類號(hào)：S651+S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）01-019-05

Screening and identification biocontrol strain to watermelon Fusarium wilt

GAO Wei， YANG Lijuan， LIU Chunyan， ZHANG Chunxiang， WANG Yong

（Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China）

Abstract： The efficient antagonistic bacteria against watermelon Fusarium wilt were screened from rhizosphere soil. The bacteria in rhizosphere soil of watermelon were isolated by gradient dilution and spread， and antagonistic strains against watermelon Fusarium wilt were screened by confront culture and pot experiment. The taxonomic status was determined by colony morphology， physiological and biochemical identification， and 16S rDNA and gyrA gene sequencing. 182 bacterial colonies were isolated and purified from 8 watermelon rhizosphere soils. Three antagonistic strains with high control effect against watermelon Fusarium wilt were obtained. The control efficacy of three strains were above 75%， with no significant difference to 30% oxamyl aqueous solutions.The antagonistic JHXG0406 strain was identified as Bacillus subtilis， JHXG0221 and XQXG0111 were identified as Bacillus amyloliquefaciens. Three strains against watermelon Fusarium wilt were obtained in this study， which have potential as biocontrol agent for application.

Key words： Watermelon; Fusarium wilt; Antagonistic bacteria; Control efficiency; Identification

西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. niveum）侵染所引起的、發(fā)生在西瓜上的病害，也是世界性范圍的病害，一旦發(fā)生，很難防治，且隨著栽培年限的增加逐年加重[1]。我國(guó)是世界上最重要的西瓜生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[2]。近年來，隨著設(shè)施栽培的迅速發(fā)展和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)的連年種植，連作障礙日益嚴(yán)重，西瓜枯萎病發(fā)病率不斷升高，對(duì)西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)造成了極大的影響，限制了西瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3-4]。選育應(yīng)用抗枯萎病的西瓜品種是西瓜枯萎病最安全有效的防控途徑，但目前仍未發(fā)現(xiàn)對(duì)西瓜枯萎病免疫的西瓜種質(zhì)資源[5-6]。砧木嫁接是生產(chǎn)上防治枯萎病的有效途徑，但嫁接栽培后，西瓜品質(zhì)受到明顯影響[7-8]?；瘜W(xué)防治對(duì)西瓜枯萎病防效低，極易產(chǎn)生抗藥性，且造成環(huán)境污染和食品安全等問題，導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥在西瓜枯萎病防治上的應(yīng)用逐漸被弱化[9-10]。

以微生態(tài)調(diào)控為基礎(chǔ)的土傳病害生物防治具有安全、無污染等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)中日益受到重視。從根際土壤中分離出大量的拮抗菌株，將其定殖于寄主植物根際，維持根際周圍有益微生物菌群數(shù)量，可有效干擾病原菌的定殖侵染，是枯萎病等土傳病害有效防控的主要途徑[11]。關(guān)于西瓜枯萎病拮抗菌株的篩選應(yīng)用已有大量研究報(bào)道[11-19]，但由于其生產(chǎn)應(yīng)用防效不理想，西瓜枯萎病的生物防控還未得到種植者的廣泛認(rèn)可。因此，篩選挖掘西瓜枯萎病有效生防資源，獲得拮抗菌株抑制作用的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)應(yīng)用是目前首要解決的關(guān)鍵問題。筆者旨在篩選對(duì)西瓜枯萎病病原具有較高防效的生防細(xì)菌，為生防菌制劑的開發(fā)利用提供充分的菌株資源。通過平板對(duì)峙培養(yǎng)和盆栽活體試驗(yàn)從西瓜根際土壤中篩選對(duì)西瓜枯萎病具有較強(qiáng)防效的拮抗菌株，并對(duì)其進(jìn)行生理生化特性和分子鑒定，以期為西瓜枯萎病的有效控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

西瓜枯萎病病原菌XGKW01（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）由天津市植物保護(hù)研究所種苗病害研究室保存。拮抗菌株來源：從土壤中分離純化獲得182株菌株。西瓜品種為‘京欣一號(hào)，是北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心選育的早熟品種。對(duì)照藥劑為30%噁霉靈水劑，由山東省青島潤(rùn)生農(nóng)化有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌分離與初篩 2017年4—6月從天津市西青、靜海等西瓜種植地采集健康植株根際土壤樣品8份，每份樣品不少于50 g，將采集的土壤樣品保存于天津市植物保護(hù)研究所種苗病害研究室，4 ℃冷藏箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

土壤根際細(xì)菌的分離純化：將采集的土樣放入盛有250 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃ 120 r·min-1搖床震蕩1 h使其充分混勻后，靜置15 min，取上清液稀釋105、106和107倍，每個(gè)稀釋度取50 μL稀釋液在NA平板上涂布，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h后挑取形態(tài)不同的單菌落，試管純化待用。

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定土壤中分離的182株菌株對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制作用。在PDA平板中央接種直徑為4 mm的病原靶標(biāo)菌株XGKW01，分離純化的細(xì)菌劃線接種在距XGKW01菌株20 mm的左右2點(diǎn)，每皿接種2個(gè)供試細(xì)菌，以不接種細(xì)菌的XGKW01平板為空白對(duì)照。25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測(cè)量對(duì)照靶標(biāo)病原XGKW01的菌落生長(zhǎng)直徑及對(duì)峙培養(yǎng)平板的菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。采用SPSS 19.0軟件鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)不同菌株對(duì)XGKW01的抑菌率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

抑菌率/%=

[對(duì)照病原菌菌落直徑-病原菌菌落直徑對(duì)照病原菌菌落直徑]×100

1.2.2 拮抗細(xì)菌對(duì)西瓜枯萎病苗期防效測(cè)定 將初篩獲得的16株對(duì)XGKW01抑菌率大于50%的菌株進(jìn)行苗期盆栽試驗(yàn)。西瓜種子催芽后播種于營(yíng)養(yǎng)缽（口徑7 cm×高7 cm）中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中2株西瓜苗，在2～3片真葉期（2017年10月11日），選取長(zhǎng)勢(shì)一致的西瓜苗進(jìn)行盆栽接種試驗(yàn)，試驗(yàn)在天津市農(nóng)科院武清創(chuàng)新基地植保所設(shè)施溫室中進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)18個(gè)處理，其中1至16號(hào)處理為拮抗菌株灌根處理，將各處理西瓜苗采用灌根法接種10 mL濃度為108 cfu·mL-1拮抗菌株菌懸液;17號(hào)處理為藥劑對(duì)照處理，灌根施用10 mL 30%噁霉靈水劑1 000倍液;18號(hào)為清水對(duì)照處理。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)20株幼苗。各處理灌根接種拮抗菌株和化學(xué)藥劑2 h后，將其分別灌根接種10 mL 106個(gè)孢子·mL-1的XGKW01孢子懸浮液。接種 15 d（10月26日）和30 d（11月10日）后調(diào)查各處理西瓜病情指數(shù)[12]，獲得數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件計(jì)算防效，利用SPSS 19.0軟件采用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)不同處理間的防效差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 對(duì)篩選獲得的西瓜枯萎病拮抗菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化和分子生物學(xué)鑒定。將菌株于NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化測(cè)定[13]。提取拮抗菌株的基因組DNA采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根DP302），采用細(xì)菌16s rDNA通用引物（16s-27F/ 16s-1492R）和gyrA基因序列擴(kuò)增引物（gyrA-f/ gyrA-r）對(duì)提取的拮抗菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]，擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物由蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，并選取相似性較高的菌株，利用MEGA 6.06軟件采用鄰接法（Neighbour-Joining， NJ， bootstrap 1000）進(jìn)行序列同源性分析，明確篩選到的拮抗菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選

從西瓜種植地采集的8份未發(fā)病的西瓜根際土壤中分離純化得到182個(gè)細(xì)菌單菌落，其中從靜海地區(qū)采集5份土樣，分離得到143個(gè)細(xì)菌菌落;從西青區(qū)采集3份土樣，分離得到39個(gè)細(xì)菌菌落。將分離得到的182個(gè)菌落分別與西瓜枯萎病病原菌在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)后，篩選到16株菌株，對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率均高于50%，其中菌株JHXG0316的抑菌率最高，為63.98%（表1）。

2.2 拮抗細(xì)菌對(duì)西瓜枯萎病的苗期防效測(cè)定

在西瓜2～3片真葉期采用苗期盆栽接種試驗(yàn)評(píng)價(jià)拮抗菌株對(duì)西瓜枯萎病的防治效果。由表2可知，接種處理15 d后，清水對(duì)照的西瓜苗發(fā)病明顯，出現(xiàn)葉片萎蔫、枯萎等癥狀，病情指數(shù)達(dá)到30.00;而各拮抗菌劑處理的西瓜苗，病情指數(shù)為5.00～10.83，明顯低于清水對(duì)照，其中拮抗菌株JHXG0221處理的防效為83.33%，顯著高于其他拮抗菌劑處理，且與對(duì)照藥劑30%噁霉靈水劑1 000倍液處理無顯著差異;拮抗菌劑JHXG0406和XQXG0111處理的防效為80.56%和81.94%，與對(duì)照藥劑處理無顯著差異。接種處理30 d后，清水對(duì)照處理的西瓜枯萎病病情指數(shù)上升為51.25，其他各處理發(fā)病程度緩慢，病情指數(shù)擴(kuò)展為10.42 ～23.75，拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111處理的防效為79.67%、77.24%和77.24%，與對(duì)照藥劑處理無顯著差異。因此，篩選到的拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111在使用濃度為108 cfu·mL-1條件下對(duì)西瓜枯萎病具有顯著的防治效果。

2.3 拮抗菌株的鑒定

拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，其單菌落圓形隆起，邊緣整齊，乳白色不透明，菌株JHXG0221和XQXG0111菌落邊緣有褶皺，JHXG0406菌落邊緣相對(duì)光滑。由表3可知，3株菌株均為革蘭氏陽性菌株，能夠水解淀粉和明膠，可以利用精氨酸，可以還原硝酸鹽，接觸酶反應(yīng)、V-P試驗(yàn)均為陽性。其中，JHXG0221和XQXG0111菌株不能利用檸檬酸鹽和賴氨酸，氧化酶反應(yīng)為陽性，甲基紅反應(yīng)、吲哚試驗(yàn)為陰性;而菌株JHXG0406能夠利用檸檬酸鹽和賴氨酸，氧化酶反應(yīng)為陰性，甲基紅反應(yīng)和吲哚試驗(yàn)為陽性。

以3株拮抗菌株基因組DNA為模板，對(duì)其16s rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得1.1 kb左右條帶，測(cè)序后獲得的堿基序列在GenBank進(jìn)行比對(duì)分析，可將其確定為芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）菌株。對(duì)3株菌株的gyrA基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1 kb左右片段，基于測(cè)序后獲得的各菌株gyrA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），發(fā)現(xiàn)菌株JHXG0221和XQXG0111與解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens（EF026702和HE617159）同屬于一個(gè)遺傳分支，同源性在97%以上，鑒定其為解淀粉芽胞桿菌;菌株JHXG0406和枯草芽胞桿菌B. subtilis（AY663693）同屬于一個(gè)遺傳分支，序列同源性達(dá)97%，鑒定為枯草芽胞桿菌。

3 討論與結(jié)論

芽胞桿菌是植物病害主要的生防菌株，在土傳病害生物防治中得到廣泛的開發(fā)利用[15]。目前，研究獲得的對(duì)西瓜枯萎病病原具有較強(qiáng)抑制作用的生防芽胞桿菌主要包括枯草芽胞桿菌（B. subtilis）、解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus）、死谷芽胞桿菌（B. vallismortis）、多黏類芽胞桿菌（B. polymyxa）和蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）等[16-19]。篩選獲得的許多拮抗菌株在室內(nèi)與病原相互作用時(shí)雖然表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，但實(shí)際應(yīng)用中由于受到土壤條件、溫濕度差異等環(huán)境因素的影響，其防效大大降低，因此拮抗菌株資源的儲(chǔ)備與篩選在生物菌劑的開發(fā)應(yīng)用中具有重要意義。筆者通過離體對(duì)峙培養(yǎng)和活體苗期試驗(yàn)綜合篩選評(píng)價(jià)菌株對(duì)病原的抑制作用，獲得對(duì)西瓜枯萎病防效高、持效期長(zhǎng)的3株菌株。其中，解淀粉芽胞桿菌JHXG0221和XQXG0111施用30 d后，對(duì)西瓜枯萎病的防效為79.67%和77.24%，高于已登記的解淀粉芽胞桿菌B1619的防效[16];枯草芽胞桿菌JHXG0406對(duì)西瓜枯萎病的防效為77.24%，高于已登記的枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（保定市科綠豐生化科技公司產(chǎn)品）的防效[20]。因此，筆者獲得的3株菌株對(duì)西瓜枯萎病的防效較高，具有作為生防制劑產(chǎn)品開發(fā)的潛力，為西瓜枯萎病的生物防治工作的開展奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將開展系統(tǒng)的田間試驗(yàn)，明確生防菌劑的田間應(yīng)用劑量、時(shí)期及防治效果，通過深入研究生防菌的定殖力、抗病促生等作用機(jī)制，指導(dǎo)田間應(yīng)用，為西瓜枯萎病的生物防治提供新的生防資源與技術(shù)支撐。

筆者從西瓜根際土壤中篩選獲得3株對(duì)西瓜枯萎病具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株，經(jīng)形態(tài)特征觀察生理生化測(cè)定及16S rDNA和gyrA基因序列比對(duì)，明確獲得的拮抗菌株JHXG0221和XQXG0111為解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens），JHXG0406為枯草芽胞桿菌（B. subtilis），其對(duì)西瓜枯萎病的防效與化學(xué)藥劑相當(dāng)，具有作為生物菌劑開發(fā)應(yīng)用的潛力。

參考文獻(xiàn)

[1] ZHANG Z G，ZHANG J Y，WANG Y C，et al.Molecular detection of Fusarium oxysporum f.sp niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil[J].FEMS Microbiology Letters，2005，249（1）：39-47.

[2] 王娟娟，李莉，尚懷國(guó).我國(guó)西瓜甜瓜產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與對(duì)策建議[J].中國(guó)瓜菜，2020，33（5）：69-73.

[3] 吳洪生.西瓜連作土傳枯萎病微生物生態(tài)學(xué)機(jī)理及其生物防治[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[4] MIGUEL A，MAROTO J V，SAN B A，et al.The grafting of triploid watermelon is an advantageous alternative to soil fumigation by methyl bromide for control of Fusarium wilt[J].Scientia Horticulturae，2004，103（1）：9-17.

[5] 王志強(qiáng)，劉聲鋒，尚建立，等.西瓜種質(zhì)資源枯萎病抗性鑒定[J].北方園藝，2019（13）：73-76.

[6] 趙銀平.32份西瓜種質(zhì)資源和品種對(duì)枯萎病抗性鑒定及綜合評(píng)價(jià)[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[7] 應(yīng)泉盛，何勇，王迎兒，等.不同砧木嫁接對(duì)西瓜果實(shí)品質(zhì)的影響機(jī)理研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（4）：590-596.

[8] 趙利強(qiáng).不同種類砧木嫁接對(duì)西瓜生長(zhǎng)發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)的影響[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[9] 王漢榮，方麗，任海英，等.西瓜枯萎病防治藥劑篩選[J].植物保護(hù)，2011，37（1）：150-152.

[10] 呂湘江，李清萍，范淑英.西瓜枯萎病綜合防治研究進(jìn)展[J].北方園藝，2015（6）：187-190.

[11] CAO Y，WANG J D，WU H S，et al.Soil chemical and microbial responses to biogas slurry amendment and its effect on Fusarium wilt suppression[J].Applied Soil Ecology，2016，107：116-123.

[12] 紀(jì)明山，王英姿，程根武，等.西瓜枯萎病拮抗菌株篩選及田間防效試驗(yàn)[J].中國(guó)生物防治，2002（2）：71-74.

[13] 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.8版.北京：科學(xué)出版社，1984：729-741.

[14] XIAO L，XIE C C，CAI J，et al.Identification and characterization of a chitinase-produced Bacillus showing significant antifungal activity[J].Current Microbiology，2009，58（5）：528-533.

[15] 劉國(guó)紅，劉波，王階平，等.芽胞桿菌分類與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2017，44（4）：949-958.

[16] 王夏雯，孟佳麗，劉永鋒，等.解淀粉芽孢桿菌B1619對(duì)連作西瓜生長(zhǎng)及枯萎病發(fā)生的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，34（11）：1302-1308.

[17] 殷曉敏，吳瓊，金志強(qiáng).甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)西瓜枯萎病菌拮抗作用的研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（11）：54-60.

[18] 楊陽，蘇昕，李曉豐. 芽孢桿菌在植物枯萎病生物防治中的作用與研究概況[J].河南農(nóng)業(yè)，2017（5）：23-24.

[19] 張猛，王瓊，萬東光，等. 1株死谷芽孢桿菌的分離、鑒定及防治西瓜枯萎病的效果[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（8）：97-100.

[20] 孫興祥，林紅梅，何春萍，等.嫁接與生物防治對(duì)西瓜枯萎病防治效果的研究[J].中國(guó)蔬菜，2013（14）：88-91.