王麗娟，劉 燕

（1.中原油田疾控中心臨床醫(yī)療科，河南濮陽 457000； 2.中原油田總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科）

淋巴母細(xì)胞性白血病是一種惡性腫瘤，其中兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）占所有兒童癌癥的25%以上[1-2]。為提高兒童ALL的診治效率，急需尋找與兒童ALL相關(guān)的有效生物標(biāo)志物。

miRNA是一種非編碼的單鏈小RNA，研究報(bào)道，改變miRNA表達(dá)水平與一些實(shí)體腫瘤和血液腫瘤息息相關(guān)[3-4]，例如肺癌[5]和慢性淋巴細(xì)胞白血病[6]等。另有研究表明某些miRNA可以作為ALL診斷的分子標(biāo)記物[7]。MicroRNA-708（miR-708）的異常表達(dá)與細(xì)胞遷移、侵襲、凋亡和增殖密切相關(guān)[8]，然而，miR-708在ALL中臨床價(jià)值的相關(guān)研究較少。

本研究通過分析miR-708在兒童ALL患者血樣中的表達(dá)水平，評(píng)估m(xù)iR-708是否可以作為兒童ALL診斷和預(yù)后的分子標(biāo)記物，以期對兒童ALL的臨床治療提供有效策略。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

采集2015年5月～2016年5月自我院就診的110例兒童外周血液樣本（ALL血樣90例，健康血樣20例），其中ALL血樣來自我院兒科腫瘤科。經(jīng)過臨床、形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞儀和細(xì)胞遺傳學(xué)分析后確定免疫表型和遺傳亞型，其中包括79例急性前B淋巴細(xì)胞白血病（pre-B lymphocytic leukemia，Pre-B-ALL）以及11例急性T淋巴細(xì)胞白血?。╝cute T lymphocytic leukemia，T-ALL），所有病例均符合ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)。從每位新診斷為兒童ALL患者和健康兒童對照組中采集3～6ml血液樣本。本次實(shí)驗(yàn)已獲得兒童法定監(jiān)護(hù)人的知情同意和本市倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照制造廠家的建議并遵循Trizol試劑盒（Thermo Fisher）說明書的實(shí)驗(yàn)步驟提取兒童血液樣本中的總RNA，并在260nm和280nm處用分光光度法測定提取的RNA的濃度和純度；以O(shè)ligodT為引物，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor，貨號(hào)：4374967，Thermo Fisher）的實(shí)驗(yàn)步驟，反轉(zhuǎn)錄得到與miR-708互補(bǔ)的cDNA；按照Fast SYBR?Green Cells-to-CT?Kit 試劑盒（Thermo Fisher，貨號(hào)：4402956）實(shí)驗(yàn)步驟，在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上進(jìn)行qRT-PCR，實(shí)驗(yàn)以U6作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCT方法計(jì)算miR-708在血液樣本中的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95°C持續(xù)10min，95°C持續(xù)15s，60°C持續(xù)1min并做40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR所需引物見表1：

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 隨訪

所有兒童ALL患者每月隨訪一次，隨訪的辦法主要是檢測患者血液中miR-708的表達(dá)水平，來推測患者預(yù)后效果?；颊叩碾S訪期為患者接受治療開始算起截止到2020年5月。一共有90名患者隨訪了10～60個(gè)月，期間有2個(gè)患者失訪，總隨訪率為97.78%。無進(jìn)展生存期的定義為從治療之日至復(fù)發(fā)之前的生存時(shí)間，總生存期的定義為從治療之日到死亡或失訪所經(jīng)歷的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）。所有研究數(shù)據(jù)均應(yīng)用GraphPad Prism 6.0和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析和處理。利用非配對t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)，檢測兩組數(shù)據(jù)之間的差異；利用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，并使用對數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行miR-708高、低表達(dá)組生存曲線之間的比較；應(yīng)用接受者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估m(xù)iR-708的診斷潛力，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-708在兒童ALL患者中顯著上調(diào)

實(shí)驗(yàn)研究對象分為兩組，其中確診為ALL的為患者組共90例（81.82%），健康對照組20例（18.18%）。實(shí)驗(yàn)中使用qRT-PCR檢測所有血液樣本中miR-708表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，患者組中miR-708顯著上調(diào)。見圖1：

圖1 miR-708表達(dá)水平箱型圖

2.2 miR-708在兒童ALL患者中的診斷意義

通過繪制受試者操作特征曲線以檢測候選miR-708的診斷價(jià)值，ROC曲線數(shù)據(jù)顯示miR-708的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.882，敏感度為92.2%，特異性為80.0%，Cut Off值為42.13，約登指數(shù)為0.722，95%置信區(qū)間（95% Confidence interval，CI）為0.777～0.986。AUC值＞0.5說明miR-708在兒童ALL中具有良好的診斷潛力，約登指數(shù)說明miR-708作為篩選條件辨別患者與非患者的總能力較高，并且靈敏度和特異性較好。見圖2：

圖2 miR-708在兒童ALL中的診斷價(jià)值

2.3 miR-708表達(dá)水平與兒童ALL患者臨床病理特征因素之間的關(guān)系

以miR-708表達(dá)水平的ROC曲線中的Cut off值（42.13）作為臨界值，將患者分為高表達(dá)組（n=50）和低表達(dá)組（n=40），并利用Fisher精確檢驗(yàn)或者χ2檢驗(yàn)檢測miR-708的表達(dá)水平與兒童ALL患者臨床病理因素之間的相關(guān)性。其中性別、白細(xì)胞數(shù)量、是否涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）、第33天的微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）與miR-708的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（P＞0.05），而年齡和免疫分型與miR-708的表達(dá)水平顯著相關(guān)，見表2：

表2 miR-708 表達(dá)水平與兒童ALL患者臨床病理因素之間的關(guān)系

2.4 兒童年齡和免疫分型與miR-708在ALL患者中的表達(dá)顯著相關(guān)

由表1可知，兒童年齡和免疫分型都與miR-708在兒童ALL患者中的表達(dá)水平具有明顯的相關(guān)性（P＜0.05）。我們進(jìn)一步通過箱型圖驗(yàn)證了兩種病理因素與miR-708的具體相關(guān)性。由圖可知，1～9歲ALL兒童患者中的miR-708表達(dá)水平顯著高于大于9歲的兒童患者（圖3A）；Pre-BALL兒童患者中的 miR-708表達(dá)水平也顯著高于T-ALL患者（圖3B）。

圖3 兒童年齡和免疫分型與miR-708表達(dá)顯著相關(guān)

2.5 miR-708表達(dá)水平在兒童ALL患者中的預(yù)后評(píng)估

隨訪期間，miR-708高表達(dá)組ALL 共有11例復(fù)發(fā)（復(fù)發(fā)率為1-無進(jìn)展生存率），復(fù)發(fā)率為22.0%，miR-708低表達(dá)組ALL 共有1例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為2.5%，高表達(dá)組復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低表達(dá)組；無進(jìn)展生存期曲線顯示，miR-708低表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存期較高表達(dá)組顯著延長（圖4A），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024）?？偵嫫谏娣治鼋Y(jié)果表明，miR-708高表達(dá)組患者和低表達(dá)患者總生存率分別為82.0%和97.5%，且miR-708低表達(dá)組總生存期明顯較高表達(dá)組的總生存期延長（圖4B），說明miR-708低表達(dá)組預(yù)后效果顯著高于miR-708低表達(dá)組（P=0.026）。

圖4 在兒童ALL患者中 miR-708高、低表達(dá)組的生存分析

3 討論

ALL作為一種惡性腫瘤在兒童中十分常見，據(jù)統(tǒng)計(jì)，ALL約占兒童所有癌癥的25%[9]。作為未成熟血細(xì)胞前體，即胚細(xì)胞癌變和惡性增殖的結(jié)果，其特點(diǎn)為增殖速度快且經(jīng)常沒有明顯的預(yù)兆，因此難以發(fā)覺[10]。經(jīng)過生物醫(yī)學(xué)界幾十年的努力，臨床上改進(jìn)的抗白血病藥物、化學(xué)療法以及放射療法都極大改善了ALL治愈率和生存率，使其治愈率提高了近80%，五年生存率提高了近85%，在ALL治療上取得了極大成功[10-12]。為了提高兒童ALL患者的診斷能力以及臨床治療后的預(yù)后情況，臨床上急需一種可靠的生物標(biāo)志物。本文探討了miR-708作為兒童ALL診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物的可能性。

已有學(xué)者表明miRNA可以作為兒童ALL診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，例如：miR-143和miR-182可以作為兒童ALL經(jīng)BFM化療治療后的預(yù)后分子標(biāo)記物[13]；miR-200c和miR-326在兒童ALL中具有潛在的診斷作用，miR-326的下調(diào)可作為兒童ALL耐藥的預(yù)后因素[14]。以上相關(guān)研究提示了miRNA在兒童ALL中的臨床診斷和預(yù)后意義。

有相關(guān)文獻(xiàn)證明，低表達(dá)的miR-708與前列腺患者的診斷和不良預(yù)后相關(guān)[15]；高表達(dá)的miR-708可作為食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）早期診斷的生物標(biāo)志物[16]。有相關(guān)研究利用微陣列分析（n=43）兒童ALL全基因組的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在骨髓樣品中包括miR-708在內(nèi)的13個(gè)miRNA均顯著上調(diào)[17]。此外，有研究者在B淋巴細(xì)胞白血?。˙ lymphocyte leukemia,B-ALL）、T-ALL和急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myelocytic leukemia, AML）患者RNA樣本中測量了人類miRNA的表達(dá)情況，并利用細(xì)胞數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了miRNA網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，miR-708與以B-ALL為中心的miRNA網(wǎng)絡(luò)連接最為緊密，并且在B-ALL網(wǎng)絡(luò)中特異性高表達(dá)，這提示了miR-708可能作為B-ALL的一種分子標(biāo)記物。與T-ALL和AML相比，在大多數(shù)B-ALL細(xì)胞系中的miR-708均上調(diào)，這也進(jìn)一步說明miR-708有可能是B-ALL的生物標(biāo)志物[18]。有趣的是，有的學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-708-5p在兒童ALL中的表達(dá)很有特點(diǎn)，miR-708-5p相對于整個(gè)患者組的BM樣本過表達(dá)。然而，當(dāng)考慮到免疫分型時(shí)，miR-708-5p僅在Pre-B-ALL中過表達(dá)；在Pre-B-ALL患者中，miR-708-5p表達(dá)水平與對照組相當(dāng)；在T-ALL患者中的表達(dá)量顯著低于對照組[19]。實(shí)驗(yàn)中我們采集到了79例Pre-B-ALL兒童血樣和11例T-ALL兒童血樣，并通過qRT-PCR檢測和箱型圖分析得到miR-708在兒童ALL中顯著下調(diào)，研究結(jié)果與其他學(xué)者相一致。

本研究的優(yōu)點(diǎn)在于，基于前人的研究成果深入探究了miR-708在兒童ALL中的診斷和預(yù)后意義。我們的研究結(jié)果表明，ROC曲線下面積為0.882，敏感度為92.2%，特異性為80.0%，說明miR-708在兒童ALL中具有良好的診斷潛力，并且敏感度和特異性較高；約登指數(shù)為0.722，說明以miR-708作為篩選條件來辨別患者與非患者的總能力較高。無進(jìn)展生存期曲線顯示miR-708高表達(dá)組的復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)組，并且低表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存期顯著比高表達(dá)組的患者延長；總生存期曲線顯示miR-708低表達(dá)組預(yù)后效果顯著高于miR-708低表達(dá)組。但由于本次研究的樣本量較少，使得miR-708在兒童ALL中的表達(dá)量的精確度有待提高。在以后的研究中還應(yīng)加大樣本量，使其在兒童ALL中的診斷和預(yù)后價(jià)值更為準(zhǔn)確可信。

綜上所述，miR-708可以在臨床上作為兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。