韓 瑨 吳燕婷 萬嗣寶 吳正鈞

(1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院, 上海 200436;2.上海大學生命科學學院, 上海 200444)

齲病是一種多因素復合作用導致的慢性感染性牙科疾病, 其表型特征為無機質(zhì)礦化.齲齒成因與口腔細菌的不平衡發(fā)展關聯(lián)密切, 而變形鏈球菌(Streptococcus mutans)是目前被公認的主要致齲菌之一, 其能在牙齒表面形成牙菌斑生物膜, 為致病菌的聚集和生長提供微生態(tài)環(huán)境, 增強致病菌本身的致病力[1].在口腔中, 生物膜的形成是具有平衡代謝活動的永久過程, 因此減少甚至抑制生物膜的產(chǎn)生是防治齲齒的重要手段.

目前, 治療齲病的主要方法是抗生素治療法和傳統(tǒng)藥物[2-3].長期使用抗生素不但會破壞正?？谇晃⑸锞? 引起口腔微生態(tài)失衡, 而且會增強口腔致病菌的耐藥性, 導致療效降低甚至產(chǎn)生潛在的致病風險.傳統(tǒng)藥物如黃連等由于氣味特殊而難被病患接受.因此, 研究人員開始將目光轉向益生菌, 關注益生菌對齲病的干預效果.

大量研究表明, 益生菌可以緩解多種胃腸道疾病, 防治上呼吸道感染等[4], 然而對口腔健康的促進作用卻是一個相對生疏的研究領域.利用無致病性的細菌(益生菌)替代口腔中的致病微生物, 從而調(diào)整口腔菌群的生態(tài)平衡, 達到防齲治齲的目的便是口腔益生菌療法的核心目標.S¨oderling 等[5]發(fā)現(xiàn)4 種益生菌乳桿菌菌株(Lactobacillus rhamnosusGG、Lactobacillus229v、Lactobacillus reuteriSD2112、PTA5289)均能抑制玻璃表面上變形鏈球菌生物膜的形成.Megha 等[6]指出嗜酸乳桿菌La-1 和La-2 可以顯著降低唾液中變形鏈球菌水平和斑塊生物膜量.通過篩選獲得具有特定生理功能(如抑制變形鏈球菌)的益生菌可在齲齒人群中發(fā)揮其特異性干擾口腔微生態(tài)的潛力, 因此, 益生菌可能是繼抗生素、傳統(tǒng)藥物之后的第三類防齲治齲手段.

發(fā)酵乳桿菌是食品中常見的乳酸菌之一, 其安全性相對較高.本實驗所用供試菌株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)B44 分離自保加利亞家庭手工制作酸奶, 通過體外實驗研究了該菌株對變形鏈球菌生物膜的抑制作用, 并分析了其作為口腔益生菌防治齲病的應用潛力.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

變形鏈球菌(S.mutansCGMCC1.2499), 中國普通微生物保藏中心.

發(fā)酵乳桿菌B44, 乳業(yè)生物技術國家重點實驗室.

MRS(de Man-Rogosa-Sharpe) 培養(yǎng)基: 酪蛋白胨(10 g/L), 牛肉提取物(8 g/L), 酵母抽提物(4 g/L), 葡萄糖(20 g/L), 磷酸氫二鉀(2 g/L), 檸檬酸氫二銨(2 g/L), 醋酸鈉(5 g/L),MgSO4·7H2O(0.2 g/L), MnSO4·4H2O(0.04 g/L).調(diào)節(jié)pH=6.2～6.6.

BHI 培養(yǎng)基、M17 培養(yǎng)基, 英國OXOID 公司.

TPY 培養(yǎng)基, 青島海博生物技術有限公司.

結晶紫染料、99%乙醇、TYC 培養(yǎng)基(酪朊水解物、L-胱氨酸: 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Na2SO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、NaHCO3、蔗糖、酵母提取物、乙酸鈉).

1.1.2 實驗儀器

超凈工作臺(TH-CB-402), 英國Labconco 公司;高壓蒸汽滅菌鍋(HVE-50), 日本Hirayama 公司;厭氧培養(yǎng)箱(Bug Box DUAL), 英國Jouan S.A公司;酶標儀(Spectra M5 型), 美國Molecular Devices 公司;紫外可見分光光度計(SPECORD), 德國耶拿公司;微生物全自動生長曲線分析儀(Bioscreen C), 上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司;電子天平(XW-80A), 美國奧立龍公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

將新鮮活化的B44 和S.mutans分別接種于MRS 和腦心浸液(brain heart infusion,BHI)液體培養(yǎng)基中, 37?C 厭氧培養(yǎng)24 h, 離心(4?C, 10 000 g, 10 min)取菌體;用pH 值為6.8 的無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered, saline, PBS)洗滌菌體3 次, 重懸于少量PBS 中,分別調(diào)整菌懸液至光密度(optical density, OD)OD600=0.1±0.02, 0.6±0.02 備用.

1.2.2 最適生長培養(yǎng)基的篩選

將新鮮平板上的B44 挑于MRS 液體培養(yǎng)基中制成菌懸液,并調(diào)節(jié)活菌數(shù)為106CFU/mL,取50μL 菌懸液于100 孔板,分別加入200μL 的MRS、M17、TPY、TYC 液體培養(yǎng)基,并置于37?C 靜置培養(yǎng)24 h, 用微生物全自動生長曲線分析儀每隔1 h 測一次OD600值, 每組測試3個平行組, 實驗重復2 次.以培養(yǎng)時間為橫坐標, OD600為縱坐標, 繪制生長曲線.

1.2.3 最適生長溫度的選擇

將B44 菌懸液(初始OD600=0.1±0.02)分別置于37、42、45?C 中水浴培養(yǎng), 每隔1 h 測定600 nm 處的吸光值.每個溫度設置3 個平行組, 實驗重復2 次.

1.2.4L.fermentumB44 對口腔中溶菌酶的耐受性

將10 μL B44 菌懸液(初始OD600為0.1±0.02)與100 μL 不同濃度梯度的溶菌酶溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)混合均勻, 并分別處理1、2、3 h, 之后取20 μL 處理后的菌懸液與180 μL 空白MRS 混合均勻, 加入100 孔板, 37?C靜置培養(yǎng)24 h, 用全自動微生物生長曲線分析儀每隔1 h 測定OD600的值, 共測24 h.實驗重復2 次實驗, 每組設置2 個平行組.

1.2.5L.fermentumB44 的疏水性

菌體表面的疏水性能可通過菌株對碳氫化合物的親和力來反映, 通常采取微生物粘著碳氫化合物法測定菌株細胞表面疏水性[7].實驗步驟如下: 取3 mL B44 菌懸液(初始OD600=0.6±0.02)與200 μL十六烷和1 mL 二甲苯混合(PBS 為空白對照), 充分振蕩1 min 后靜置15 min, 分層后取水相, 以PBS 為空白對照測定OD600, 記為A1.上述實驗獨立進行5次, 每組設置5 個平行, 分別記錄吸光值再將吸光值代入下式計算表面疏水率Sw,

式中:A0為B44 菌懸液初始吸光值;A1為靜置分層后水相部分的吸光值.

1.2.6L.fermentumB44 的表面電荷量

選擇乙酸乙酯作為路易斯堿, 三氯甲烷作為路易斯酸[8], 參照1.2.7 節(jié)的方法測試菌株B44 的表面電荷量.

1.2.7L.fermentumB44 的自動聚集能力

在24 孔板中添加1 mL B44 菌懸液(初始OD600= 0.6±0.02), 于37?C 厭氧培養(yǎng), 每隔1 h 測定上清在600 nm 處的吸光值, 共測3 h, 每組設置3 個平行實驗, 再將吸光值代入下式計算自聚集率J0,

式中:A0為B44 菌懸液初始吸光值;At為靜置培養(yǎng)th 后B44 菌懸液上清液的吸光值.

1.2.8L.fermentumB44 和變形鏈球菌的共聚集率測定

將兩種菌懸液(初始OD600=0.6±0.02)等比混合, 分別取1 mL 于24 孔板中, 37?C 厭氧培養(yǎng), 具體測定方法參照1.2.7 節(jié).將吸光值代入下式計算共聚集率J:

式中:Ax為S.mutans菌懸液初始吸光值;Ay為B44菌懸液初始吸光值;At(x+y)為靜置培養(yǎng)th 后混合菌懸液上清液的吸光值.

1.2.9L.fermentumB44 對S.mutans生物膜形成量的影響

將Ciandrini 等[9]提出的生物膜量化方案稍作修改, 得到圖1 所示的生物膜檢測方法.收集健康志愿者的唾液, 離心(4?C、15 000 g、15 min)取上清, 以0.22 μm 無菌水相濾膜進行過濾除菌.將磁力攪拌子(5 mm×10 mm)沸水浴滅菌后放入上述唾液中溫和振蕩孵育4 h, 取出用pH=7 PBS 淋洗攪拌子, 備用.調(diào)整S.mutans和B44 活菌數(shù)為106CFU/mL, 分別取200 μL 于24 孔培養(yǎng)板, 同時加入1.6 mL 液體BHI 培養(yǎng)基, 最后加入上述攪拌子進行共培養(yǎng),以空白MRS 液體培養(yǎng)基作為陰性對照, 置于37?C 厭氧培養(yǎng)24 h.取出攪拌子用pH=7 PBS淋洗數(shù)次, 接著浸入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的結晶紫(crystal, violet, CV)染料中孵育15 min.接著取出攪拌子以PBS 淋洗除去未結合的CV, 自然干燥后, 用無水乙醇將結合于攪拌子表面上生物膜的CV 染料溶解下來, 取上述無水乙醇200 μL 轉移至96 孔板內(nèi), 測定OD570(CV 濃度所對應的OD570與生物膜形成量呈線性關系).每組設置3 個平行組, 實驗3 次重復.菌株對S.mutans生物膜形成量的生物膜抑制率(biofilm inhibition, BI)BI= (A1?A2)/A1×100%, 其中A1為對照組生物膜的形成量,A2為實驗組生物膜的形成量.

圖1 生物膜檢測方法Fig.1 Biofilm detection method

2 結果與分析

2.1 L.fermentum B44 最適生長環(huán)境

通過濁度測定法對接種于不同培養(yǎng)基中的B44 的生長情況進行對較, 繪制不同營養(yǎng)環(huán)境下的生長曲線(見圖2), 篩選出適合B44 生長的優(yōu)選培養(yǎng)基.接種于TYC、M17、BHI(brainheart infusion)和TPY 4 種培養(yǎng)基的B44, 其OD600基本不變或略微增加, 說明B44 無法正常代謝上述培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)來增殖, 因而生長緩慢甚至停滯.但在MRS 培養(yǎng)基中, B44 在接種后4 h 即可進入生長對數(shù)期, 并于12 h 后進入穩(wěn)定期.經(jīng)測定, 發(fā)酵終點處(24 h)活菌總數(shù)達108CFU /mL 以上, 顯著高于其他培養(yǎng)基.上述現(xiàn)象表明, MRS 培養(yǎng)基中可能含有B44迅速代謝增殖所必需的特定組分, 因此是培養(yǎng)B44 的最適培養(yǎng)基.從最適培養(yǎng)基而言, B44 與大部分乳桿菌類似, 如干酪乳桿菌[10]、植物乳桿菌[11]等菌株的優(yōu)選培養(yǎng)介質(zhì)均與MRS 培養(yǎng)基有關.然而, 從對培養(yǎng)基的苛刻度而言, B44 又不同于常規(guī)乳桿菌, 前者只在MRS 中有增殖效果, 后者除了最適培養(yǎng)基外, 往往還有一種或多種其他備選的發(fā)酵介質(zhì), 如植物乳桿菌可通過TPY 等多種介質(zhì)達到增殖目的.

圖2 B44 在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.2 Growth curve of B44 under different culture condition

將B44 菌懸液置于不同溫度培養(yǎng), 每隔1 h 測定OD600, 結果如圖3 所示.隨著培養(yǎng)時間的延長, 各溫度下培養(yǎng)的菌株均有不同程度的增長, 當培養(yǎng)至3 h 時, 42?C 和45?C 樣品的OD600均達到了目標值0.6.進一步分析后發(fā)現(xiàn), 42?C 樣品組所有時間點的樣品OD600始終高于其他組, 因此, 42?C 是發(fā)酵乳桿菌B44 的優(yōu)選生長溫度.微生物的增殖效果與其菌體內(nèi)部的代謝水平有關, 當B44 的環(huán)境溫度高于或低于最適溫度(42?C)時, 菌體細胞內(nèi)與代謝相關酶會發(fā)生部分失活, 從而無法為菌體提供充足的增殖“原料”.到目前為止, 大部分已披露的發(fā)酵乳桿菌的最適生長溫度主要集中于30～37?C[12-13], 但菌株間存在一定個體差異, 例如洪梅等[14]就從中國青貯窖中分離出一株在42?C 培養(yǎng)條件下生長最為旺盛的發(fā)酵乳酸菌BLF 01,該菌株的發(fā)酵特點與B44 極為相似.

圖3 B44 在不同培養(yǎng)溫度下的生長情況Fig.3 Growth of B44 at different culture temperatures

2.2 對口腔溶菌酶的耐受性分析

口腔是人體抵抗外源性微生物的第一道屏障, 而口腔溶菌酶是該屏障的重要成分之一,這是一類能夠分解細胞壁而殺死多種細菌的蛋白質(zhì), 口服益生菌只有對溶菌酶具有一定耐受性才能以活菌形態(tài)定植于口腔中或進入胃腸道, 進而發(fā)揮益生作用.B44 對不同濃度溶菌酶的耐受性如圖4 所示.由圖4 可以看出, 低質(zhì)量濃度(0.2～0.4 mg/mL)溶菌酶短時間(1～2 h)處理對菌株生長基本沒有影響, 而高質(zhì)量濃度(0.6～1.0 mg/mL)溶菌酶短時間(1～2 h)處理或不同濃度(0.2～1.0 mg/mL)溶菌酶長時間(3 h)處理均會不同程度地延長B44 進入生長指數(shù)期的時間, 但各測試組最終OD600保持一致, 說明菌株B44 至少可耐受1 mg/mL的溶菌酶.健康人群口腔內(nèi)的溶菌酶質(zhì)量濃度為1～57 μg/mL[15], 遠低于B44 的耐受值, 由此推測B44 在口腔中存活性能較強.除了發(fā)酵乳桿菌以外, 其他乳酸菌同樣具備這種溶菌酶高耐受能力.Boricha等[16]發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵辣椒和秘魯果實中分離得到的大部分乳酸菌(如Lactobacillus pentosusCHIG、Lactobacillus pentosusNAG1、Lactobacillus fermentumPRS1 等)均對溶菌酶具有較強的耐受性.

圖4 溶菌酶處理不同時間對B44 生長曲線的影響Fig.4 Effects of lysozyme on the growth curve of B44 at different time

2.3 L.fermentum B44 疏水性和靜電作用分析

口腔中的益生菌能否特異或者非特異地黏附于口腔粘膜上, 取決于其黏附能力、疏水性以及表面電荷量.由B44 對二甲苯的黏附實驗可知, 菌株的疏水率為(79.67±1.47)%, 堿電荷占比為(82.10±0.84)%, 酸電荷占比為(13.32±1.67)%, 菌株的疏水性較強.研究表明, 疏水性強的菌株不但能較好地保護細胞, 而且可以促進細胞與口腔粘膜的黏附.Yousra 等[17]從突尼斯自發(fā)發(fā)酵的山羊奶中新近分離的菌株的益生菌特征進行了評估, 發(fā)現(xiàn)表面疏水性高達77.3%.

此外,L.fermentumB44還有低酸、高堿的膜表面電荷分布特點.姚沛琳[18]認為, 擁有此類電荷分布特點的益生菌不僅更容易黏附于口腔, 而且能與變形鏈球菌競爭細胞黏附位點, 進而降低口腔中致齲菌的總量, 減少后者生物膜的形成量, 達到抗齲的益生性能.

2.4 自聚和共聚能力分析

菌株自聚和共聚能力是考察菌株可否作為口腔益生菌發(fā)揮作用的重要指標.菌株的自動聚集能力或共聚能力越強, 越有利于菌株在口腔中定植、繁殖和存活, 這是菌株在口腔中發(fā)揮益生性能的重要前提[19].如圖5 所示, 菌株B44 的自聚率和共聚率與孵育時間正相關, 即孵育時間越長, 菌體的自聚集和共聚集效果越好, 培養(yǎng)2 h 和4 h 后B44 的自聚率分別為6.45%和13.34%, 與變形鏈球菌的共聚率分別為12.49%和17.45%.

蔗糖是引發(fā)齲齒的重要誘因之一[20], 本研究進一步探索了蔗糖濃度對B44 聚集率的影響.結果發(fā)現(xiàn), 蔗糖對菌株B44 自聚能力的影響不顯著, 含不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基中B44自聚率基本處于同一水平.然而, B44 與S.mutans的共聚率與蔗糖質(zhì)量分數(shù)、孵育時間正相關, 增加培養(yǎng)基中蔗糖含量或延長孵育時間, 可增強共聚效果.由圖5 可知, 培養(yǎng)體系中的蔗糖質(zhì)量分數(shù)分別為0.25%、0.5%、2%、5% 時, B44 與S.mutans的共聚能力分別為31.15%、35.74%、36.76%和46.23%.從效果來看, 高糖環(huán)境確實對B44 菌株與致齲菌的共聚性有積極作用, 但鑒于蔗糖自身存在誘發(fā)齲齒的潛在風險.因此, 在實際應用過程中需進行多角度、全方位的綜合權衡, 力求實現(xiàn)B44 菌株高成效、低風險的治齲應用.

圖5 B44、S.mutans 共聚和B44 自動聚集能力Fig.5 Self-aggregation of B44 and coaggregation of B44 with S.mutans

2.5 L.fermentum B44 對S.mutans 生物膜形成量的影響

眾所周知,S.mutans可利用蔗糖合成(不溶性)胞外多糖, 并通過后者在牙釉表面的黏附作用與其他細菌發(fā)生共聚, 且黏附于牙齒表面形成牙菌斑生物膜.其中定植的致齲菌在特定生境中進一步發(fā)酵產(chǎn)酸致使牙齒無機質(zhì)脫礦, 進而侵蝕牙面或牙根形成齲洞, 即為齲齒[21].因而從根源上控制S.mutans定植口腔的關鍵性物質(zhì)基礎——生物膜的形成便可有效控制齲齒的產(chǎn)生.本工作考察了B44 對S.mutans生物膜的影響, 結果如圖6 所示.可以看出: 與B44 菌體共培養(yǎng)的S.mutans的生物膜形成量比單獨培養(yǎng)時降低了63.043%(P <0.01), 表明B44 可有效調(diào)控S.mutans生物膜的形成, 具備防齲治齲的應用前景.楊娟等[22]從健康志愿者的牙菌斑樣品中分離獲得一株具備防治口腔疾病能力的發(fā)酵乳桿菌Y29, 該菌株對S.mutans的生長有抑制作用, 因而其益生機制與本研究完全不同.

圖6 B44 對S.mutans 生物膜形成的影響Fig.6 Effect of B44 on the formation of S.mutans biofilm

3 結束語

發(fā)酵乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬, 廣泛分布于植物和胃腸道中.其作為一類典型的異型發(fā)酵乳酸菌, 在傳統(tǒng)上多用于谷類食品的發(fā)酵和生產(chǎn), 此外, 在發(fā)酵食品(如面包、酸奶、泡菜等)的制備中也有應用.研究表明,L.fermentans在促進胃腸道蠕動、防治上呼吸道感染、促進B 族維生素的吸收等領域發(fā)揮著重要功能, 然而在改善口腔健康方面的研究尚處于起步階段.

本工作采用的發(fā)酵乳桿菌B44 是一株分離自保加利亞手工酸奶的乳酸菌, 其最適生長培養(yǎng)基是MRS 培養(yǎng)基, 最適生長溫度為42?C.該菌株具有較強的疏水性和低酸高堿的表面電荷分布, 在口腔中具有良好的黏附能力.較強的溶菌酶耐受能力、自聚能力以及共聚能力有利于其菌體在口腔中的定植、存活以及與S.mutans競爭占位.更重要的是, B44 還能有效遏制S.mutans牙菌斑生物膜的形成, 從而達到防治齲病的目的.綜上所述,L.fermentansB44 具備作為一株口腔益生菌應用的潛力.