侯瑋瓊，姜 北，趙 巖，楊勛超，毛文超，吳欣芳

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)內(nèi)一科，北京 102618)

高血壓是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，左心室肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)是高血壓病主要的并發(fā)癥之一。一方面，由于血壓升高，人體左心室代償性增厚；另一方面，高血壓也成為肥厚性心肌病、心力衰竭等心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。有文獻(xiàn)記載，高血壓病合并LVH在心肌梗死的致病因素中占有重要地位。因此，LVH成為心血管疾病研究的重點(diǎn)。Ras同族體基因家族成員A(Ras homolog gene family member A,RhoA)/Rho激酶(Rho-associated kinase,ROCK)通路作為與心肌細(xì)胞病理密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，活化后可以促進(jìn)多種物質(zhì)的合成，從而直接或間接導(dǎo)致心肌細(xì)胞重塑的效果。因此，抑制RhoA/ROCK通路也許是治療LVH的重要手段。天麻素作為中草藥天麻的提取物，具有鎮(zhèn)靜、催眠、擴(kuò)張血管、降低外周阻力、改善微循環(huán)、增加心肌血流量、保護(hù)心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡等作用。研究表明，天麻素可降低高血壓病大鼠血清超氧化物歧化酶和丙二醛水平，通過抗脂質(zhì)過氧化損傷達(dá)到保護(hù)血管的作用并降低血壓。本實(shí)驗(yàn)通過腹主動(dòng)脈縮窄法復(fù)制LVH動(dòng)物模型，觀察天麻素對(duì)大鼠心室重構(gòu)的影響并探究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠100只，清潔級(jí)，8周齡，體質(zhì)量為(240±20)g，購(gòu)自珠海百試通生物科技有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2020—0051]。所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為25 ℃，濕度為60%，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 藥物和試劑 依蘇牌馬來酸依那普利片(批號(hào) 20150902)：揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司；精和牌乙酰天麻素片(批號(hào) 20013048)：云南省昆明制藥集團(tuán)股份有限公司；大鼠血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)ELISA試劑盒(批號(hào)20071015)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(批號(hào) 20100328)：上海江萊生物；qRT-PCR擴(kuò)增引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；TRIzol試劑(貨號(hào) 15596026)：Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào) R123-01)、qRT-PCR試劑盒(貨號(hào) Q121-02)：南京諾唯贊公司；Western blot所用抗體：Abcam公司；一抗為兔抗RhoA單克隆抗體(ab40673)、兔抗ROCK2單克隆抗體(ab125025)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab205718)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，天麻素低、中、高劑量組，依那普利組，每組15只。除假手術(shù)組外，均采用腹主動(dòng)脈縮窄法復(fù)制高血壓病LVH模型。腹腔注射戊巴比妥鈉全身麻醉，固定，備皮，沿腹白線逐層開腹至劍突下1 cm處，以腦銀夾夾住腹主動(dòng)脈分叉處，使之部分狹窄，用慶大霉素沖洗傷口，逐層關(guān)腹。假手術(shù)組按同樣方法分離腹主動(dòng)脈，但不夾腹主動(dòng)脈。術(shù)后2周，使用無創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠收縮壓。大鼠收縮壓較模型復(fù)制前提高20 mmHg以上，且高于135 mmHg，提示LVH模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)過程中如有大鼠死亡或模型復(fù)制失敗，則及時(shí)補(bǔ)充大鼠。依那普利組給藥劑量為每日1.5 mg/kg，天麻素低、中、高劑量分別為每日16、24、32 mg/kg。每日灌胃給藥1次，共8周。假手術(shù)組和模型組用等容量生理鹽水灌胃。期間每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

2.2 收縮壓測(cè)定 模型復(fù)制前，模型復(fù)制后2、4、8周，分別測(cè)量各組大鼠在安靜、清醒狀態(tài)時(shí)尾動(dòng)脈收縮壓，連續(xù)測(cè)量3次，取平均值。

2.3 ELISA法測(cè)定大鼠血清AngⅡ、IL-6水平 用藥8周后，各組大鼠主動(dòng)脈采血，2 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清AngⅡ、IL-6水平。

2.4 左心室質(zhì)量及左心室肥厚指數(shù)(left ventricular hypertrophy index, LVHI)測(cè)定 將禁食12 h的大鼠麻醉后迅速打開胸腔，取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗血液，濾紙吸干水份，取左心室游離壁和室間隔，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，作為左心室質(zhì)量，左心室質(zhì)量與動(dòng)物體質(zhì)量的比值作為L(zhǎng)VHI。

2.5 心肌的組織形態(tài)學(xué)觀察 沿左心室長(zhǎng)軸中點(diǎn)處留取一部分心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)方法制作石蠟切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色和Masson染色，觀察大鼠心肌的組織形態(tài)學(xué)變化及心肌纖維化程度。將另一部分心肌置于液氮中保存。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)各組心肌組織RhoA、ROCK mRNA水平 取液氮中保存的心肌，采用TRIzol等試劑提取總RNA，定量逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用SYBR Green Ⅰ熒光染料技術(shù)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。所用引物見表1。預(yù)變性95 ℃，5 min；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃下反應(yīng)10 s，60 ℃下反應(yīng)30 s，主循環(huán)40個(gè)；溶解曲線：95 ℃下反應(yīng)15 s，60 ℃下反應(yīng)60 s，95 ℃下反應(yīng)15 s。采用2-ΔΔC法，通過C值計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參。

表1 qRT-PCR引物序列

2.7 Western blot法檢測(cè)各組心肌組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)水平 取液氮保存的心肌組織，剪碎，置于玻璃勻漿器中；加入含有PMSF的裂解液，冰上反復(fù)勻漿。30 min后，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，收集上清液。配制10%分離膠、4%濃縮膠；取50 μg蛋白上樣，沸水浴處理5 min使蛋白變性，冷卻后上樣；轉(zhuǎn)膜封閉后4 ℃過夜；用TBS清洗后，加入羊抗兔IgG二抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)，室溫下孵育2 h；TBS清洗、ECL顯色后置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 天麻素對(duì)高血壓病LVH大鼠收縮壓的影響 模型復(fù)制后2、4、8周，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠收縮壓均顯著升高(

P

<0.05)。用藥4周后，與模型組比較，依那普利組和天麻素高劑量組收縮壓明顯下降(

P

<0.05)。用藥8周后，與模型組比較，天麻素低、中、高劑量組和依那普利組大鼠收縮壓均顯著降低(

P

<0.05)。見表2。3.2 天麻素對(duì)高血壓病LVH大鼠血清AngⅡ、IL-6水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AngⅡ、IL-6水平顯著升高(

P

<0.05)。與模型組比較，天麻素低、中、高劑量組以及依那普利組大鼠血清AngⅡ、IL-6水平均顯著降低(

P

<0.05)，且依那普利組大鼠血清AngⅡ、IL-6水平最低(

P

<0.05)。見表3。

表2 天麻素對(duì)高血壓病LVH大鼠收縮壓的影響

表3 天麻素對(duì)高血壓病LVH大鼠血清AngⅡ、IL-6水平的影響

3.3 天麻素對(duì)大鼠左心室重構(gòu)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVHI顯著增加(

P

<0.05)。與模型組比較，天麻素低、中、高劑量組，依那普利組大鼠LVHI均顯著降低(

P

<0.05)，且依那普利組大鼠LVHI顯著低于天麻素高劑量組(

P

<0.05)。見表4。

表4 天麻素對(duì)大鼠左心室質(zhì)量及LVHI的影響

3.4 6組大鼠心肌組織形態(tài)變化 心肌組織經(jīng)HE染色后，假手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)及大小正常，胞漿染色清晰，排列整齊緊湊，纖維組織未見增生。模型組大鼠心肌細(xì)胞胞漿染色不清，排列紊亂，間隙消失，纖維組織大量增生，心肌組織出現(xiàn)增生等重構(gòu)現(xiàn)象。依那普利組大鼠心肌組織與假手術(shù)組類似。天麻素高、中、低劑量組與假手術(shù)組比較，心肌細(xì)胞排列稍紊亂，肌纖維均有不同程度的扭曲斷裂，胞漿染色尚均勻，可見少量細(xì)胞核固縮；與模型組比較，心肌細(xì)胞排列較為整齊，肌纖維斷裂扭曲不明顯。天麻素高、中、低劑量組和依那普利組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。Masson染色后，假手術(shù)組以紅色的心肌細(xì)胞為主，心肌組織分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，且心肌細(xì)胞間質(zhì)僅見少量綠色膠原纖維。模型組大鼠心肌組織分布不均勻，結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)及血管周圍均可見大量綠色膠原纖維沉積，纖維化程度嚴(yán)重。各治療組大鼠心肌間質(zhì)纖維化程度介于假手術(shù)組和模型組之間，較模型組均有不同程度的減輕，尤以依那普利組和天麻素高劑量組減輕最為明顯。見圖1。

3.5 6組大鼠心肌組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(

P

<0.05)。與模型組比較，依那普利組和天麻素低、中、高劑量組大鼠心肌組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(

P

<0.05)，依那普利組大鼠心肌組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平最低，天麻素的作用呈劑量依賴性。見表5和圖2。

圖1 6組大鼠心肌組織形態(tài)變化(10×20倍)

4 討論

LVH是高血壓病常見的器官損害之一，是機(jī)體對(duì)血液動(dòng)力學(xué)負(fù)荷長(zhǎng)期增加的一種適應(yīng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為心室壁增厚、心肌質(zhì)量增加等心室重塑、炎癥反應(yīng)以及心肌纖維化等，其形成過程涉及多種因素。LVH是高血壓病維持、惡化及心力衰竭發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，長(zhǎng)期如此，會(huì)增加冠心病、腦卒中等嚴(yán)重疾病風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄法復(fù)制LVH大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠血壓升高，LVHI增加，心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，纖維化程度高，在間質(zhì)可見水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有大面積細(xì)胞壞死。

天麻素作為天麻的主要有效成分，具有降低血清炎癥因子水平，抑制炎癥發(fā)生，減弱氧化應(yīng)激損傷的療效。天麻可顯著降低高血壓病LVH患者血壓，提高左心室舒張及收縮功能，對(duì)主要心血管事件的發(fā)生起到積極的預(yù)防作用，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。AngⅡ不僅可以作用于血管平滑肌細(xì)胞，造成血管張力增加，而且能通過與其受體結(jié)合，提高胞內(nèi)Ca濃度，促進(jìn)血壓升高，誘發(fā)心肌炎癥肥大和纖維化。而IL-6是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的典型因子。本實(shí)驗(yàn)中，相比于模型組，天麻素各劑量組血壓、LVHI、心肌纖維化程度以及AngⅡ、IL-6水平均明顯下降。本實(shí)驗(yàn)所用西藥為依那普利，是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，能夠通過降低AngⅡ水平，從而舒張血管，達(dá)到降血壓的效果。臨床上也有用天麻素聯(lián)合依那普利治療高血壓病LVH的報(bào)道，效果良好。結(jié)果提示天麻素對(duì)治療高血壓病LVH大鼠心室重構(gòu)具有一定效果，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

近年來，RhoA/ROCK通路在高血壓病所導(dǎo)致的LVH模型中發(fā)病作用引起人們的廣泛重視。Rho是一類Ras相關(guān)單體GTP酶，具有多種亞型，其中RhoA在介導(dǎo)細(xì)胞聚集和基因轉(zhuǎn)錄翻譯中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。ROCK是Rho下游的表達(dá)效應(yīng)子，參與許多心腦血管疾病(如高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、缺血再灌注損傷)的發(fā)病。研究表明，高表達(dá)ROCK的大鼠模型中，血管平滑肌的緊張程度增加，從而導(dǎo)致血管收縮，血壓升高。本實(shí)驗(yàn)中，模型組RhoA、ROCK mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，而天麻素組及依那普利組RhoA、ROCK mRNA及蛋白表達(dá)水平較模型組均顯著降低，且天麻素組RhoA、ROCK mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降呈一定劑量依賴性，提示天麻素可能通過抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用。

表5 6組大鼠心肌組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.天麻素低劑量組；D.天麻素中劑量組；E.天麻素高劑量組；F.依那普利組

綜上所述，天麻素處理能夠抑制大鼠RhoA/ROCK通路，進(jìn)而減輕高血壓病LVH的病理變化，其作用與依那普利類似，這可能是其防治心室重構(gòu)的作用機(jī)制之一。