趙馨儀，范冰倩，鄭 宇，宋 佳*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

食醋作為中國(guó)傳統(tǒng)的酸性調(diào)味品，已經(jīng)有3 000多年的歷史。山西老陳醋是以高粱為主要原料，以麩皮、稻殼和谷殼為輔料，以大麥、豌豆為原料制作的大曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)酒精發(fā)酵后采用固態(tài)醋酸發(fā)酵，再經(jīng)熏醅、陳釀等工藝釀制而成，是中國(guó)四大名醋之首，其釀造工藝被評(píng)為國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[1-2]。山西老陳醋中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如：有機(jī)酸、氨基酸、還原糖、酯類、醛類、酮類、無(wú)機(jī)鹽類、維生素[3-4]，具有色、香、醇、濃、酸五大特征。食醋作為調(diào)味品，除了具有酸味、鮮味、甜味和香氣以外，還有增進(jìn)食欲、幫助消化等保健功能。明代李時(shí)珍在《本草綱目》中記載：“醋能消腫、散火氣、殺邪毒、理諸藥之功效”[5]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，食醋具有殺菌消炎、抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖、護(hù)肝養(yǎng)腎、促進(jìn)鈣吸收、緩解疲勞、美容減肥等功效[6-8]。

山西老陳醋的發(fā)酵過(guò)程采用半固態(tài)和固態(tài)發(fā)酵工藝，即酒精發(fā)酵為半固態(tài)發(fā)酵，醋酸發(fā)酵為固態(tài)發(fā)酵。醋酸發(fā)酵階段是食醋風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段，多種微生物在發(fā)酵過(guò)程中富集和演替[9]。對(duì)發(fā)酵醋醅中細(xì)菌菌群研究發(fā)現(xiàn)，參與醋酸發(fā)酵的細(xì)菌菌群主要包括醋桿菌屬（Acetobacte）、乳酸菌屬（Lactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus），其中醋桿菌屬和乳桿菌屬是醋酸發(fā)酵過(guò)程的主導(dǎo)菌群[2]。醋酸菌可以將酒精氧化為乙酸，是提供食醋酸味的主要微生物，且有研究證實(shí)乙酸具有降血脂、降血糖、降血壓、消炎、護(hù)肝等功效[10-11]，也是賦予食醋功能性的主要微生物。乳酸是乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物，能夠緩解乙酸給食醋帶來(lái)的刺激性，使食醋口感柔和，有助于改善食醋的風(fēng)味；此外，乳酸也具有降血脂、提高免疫力、緩解酒精性脂肪肝等健康作用[12-13]，因此，乳酸菌在食醋釀造中也有至關(guān)重要的作用。芽孢桿菌可產(chǎn)生高度活性的蛋白酶，可以將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，這些氨基酸對(duì)食醋的風(fēng)味和顏色起到重要作用，此外，芽孢桿菌對(duì)食醋活性成分之一——四甲基吡嗪的生成有一定作用[14-15]。在醋酸發(fā)酵過(guò)程中，多種微生物通過(guò)代謝產(chǎn)生豐富的有機(jī)酸，尤其是醋酸菌將酒精發(fā)酵階段形成的大量乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，為食醋提供酸味[16-18]。因此，產(chǎn)酸微生物對(duì)食醋的酸味形成尤為重要。同時(shí)，醋酸發(fā)酵過(guò)程中的大量的乙醇和有機(jī)酸也會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生影響，這就要求產(chǎn)酸微生物在產(chǎn)酸同時(shí)，還需具有較強(qiáng)的醇酸耐受性。因此，本研究以山西老陳醋醋酸發(fā)酵醋醅為研究對(duì)象，從中篩選產(chǎn)酸微生物，并進(jìn)行醇酸耐受分析，以期得到高產(chǎn)酸和高耐受的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品：山西老陳醋某醋廠醋醅。取醋酸發(fā)酵1 d、3 d、5 d、7 d和9 d的樣品適量，混合均勻后作為菌種篩選的醋醅樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）富集培養(yǎng)基：葡萄糖3%，酵母膏1%，蛋白胨1%，乙醇3.5%（V/V）。

（2）分離培養(yǎng)基：葡萄糖3%，酵母膏1%，蛋白胨1%，碳酸鈣0.5%，瓊脂2.5%，乙醇3.5%（V/V）。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基

醋酸菌培養(yǎng)基：葡萄糖3%，酵母膏1%，蛋白胨1%，乙醇5%（V/V）。

乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，無(wú)水乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%（V/V），檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，pH 6.2～6.8。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S精密天平：北京賽多利斯儀器有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；1X2-1LLJ100普通光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；WS2-134-75電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；ChemiDoc TMXRS+凝膠分析儀：美國(guó)Bio Rad公司；T-1基因擴(kuò)增儀：德國(guó)Eppendorf公司；XLFX-SBA-40E生物傳感儀：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酸細(xì)菌的分離純化

取5 g醋醅置于盛有45 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/min均質(zhì)2 min，取菌懸液以2%接種量接種于富集培養(yǎng)基。菌體富集條件為30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取1 mL增殖培養(yǎng)液，制備10倍系列稀釋樣品勻液。取適量系列稀釋后的菌懸液涂布至分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄平板中菌落形態(tài)以及是否產(chǎn)生透明圈。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好、產(chǎn)生透明圈的典型單菌落，采用三區(qū)劃線法在新的平板中進(jìn)行菌種純化。

1.3.2 分離菌株的種屬鑒定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒要求步驟提取細(xì)菌DNA。采用超微量紫外光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。以27F/1492R為引物擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA，引物序列為：27F，5'-AGAGTTTGAT（C/T）（A/C）TGGCTCAG-3'；1492R，5'-TACCTTGTTA（C/T）GACTT-3'。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增條件為：a.94 ℃預(yù)變性3 min；b.94 ℃變性30 s；c.54 ℃退火40 s；d.72 ℃延伸100 s；e.72 ℃延伸10 min。b-d步驟循環(huán)30次。采用瓊脂糖凝膠電泳法驗(yàn)證PCR所得16S rDNA片段大小。PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序。采用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果（abi文件）進(jìn)行拼接，去除兩端質(zhì)量差的兩部分，所得序列以FASTA形式保存。將所得序列輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，以同源性大于99%鑒定菌株種屬。采用MEGA 4.0軟件進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[19-20]。

1.3.3 高產(chǎn)酸菌株的篩選與總酸含量的測(cè)定

將篩選菌株接種于對(duì)應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中總酸含量，篩選產(chǎn)酸能力較高產(chǎn)酸菌株?？偹岷坎捎盟釅A滴定的方法測(cè)定[21]。

1.3.4 乙醇對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

（1）對(duì)醋酸菌的影響：以醋酸菌培養(yǎng)基為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基初始乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為：7%、9%、11%、13%、15%，在30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)0、12 h、24 h、36 h、48 h后測(cè)定OD600nm值。

（2）對(duì)乳酸菌的影響：以MRS培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)5%乙醇為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基初始乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為：7%、9%、11%、13%、15%，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)0、12 h、24 h、36 h、48 h測(cè)定OD600nm值。

1.3.5 乙酸對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

醋酸菌以醋酸菌培養(yǎng)基為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基初始乙酸體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為：1%、2%、3%、4%，在30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)0、12 h、24 h、48 h、72 h后測(cè)定OD600nm值。

乳酸菌以MRS培養(yǎng)基為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基初始乙酸體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為：1%、2%、3%、4%，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)0、12 h、24 h、48 h、72 h后測(cè)定OD600nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸菌株的篩選及鑒定

2.1.1 產(chǎn)酸菌的分離篩選

通過(guò)涂布觀察，從醋醅中分離篩選得到7株有明顯透明圈、菌落形態(tài)有差異的的菌株，初步判斷為產(chǎn)酸菌株。所有菌落形態(tài)為乳白色突起，較濕潤(rùn)、邊緣不整齊，3株革蘭氏陰性菌和4株革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞形態(tài)均為桿狀。依據(jù)篩選順序命名為SAV-1、SAV-2、SAV-5、SAV-6、SAV-7、SAV-8、SAV-9。

2.1.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

以上述7株菌的16S rDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖膠電泳圖如圖1所示，結(jié)果表明，7株菌擴(kuò)增的條帶明亮、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度在1500bp左右、無(wú)雜帶。

圖1 產(chǎn)酸菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products of acid producing strains

7株菌株的種屬鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，分離出的7株菌中包含4株醋酸菌（SAV-1、SAV-2、SAV-5和SAV-9）和3株乳酸菌（SAV-6、SAV-7和SAV-8）。在種水平上共有4種，其中菌株SAV-1、SAV-2和SAV-5均屬于巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），菌株SAV-9屬于發(fā)霉醋桿菌（Acetobacter pomorum），菌株SAV-7和SAV-8屬于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SAV-6為乳桿菌（Lactobacillussp.）。

表1 所篩菌株的種屬鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of the screened strains

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

采用構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方法對(duì)7株菌的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株SAV-1、SAV-2和SAV-5的親緣關(guān)系相同，均為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），與16S rDNA鑒定結(jié)果一致。與菌株SAV-9親緣關(guān)系最近的菌株為Acetobacter pomorum，與該菌株16S rDNA鑒定結(jié)果一致，所以該菌株為發(fā)霉醋桿菌（A.pomorum）。菌株SAV-7和SAV-8與乳桿菌屬（Lactobacillus）親緣關(guān)系較近，其中與植物乳桿菌（L.plantarum）親緣關(guān)系最近且與16S rDNA鑒定結(jié)果一致。因此，SAV-7和SAV-8兩株菌均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。菌株SAV-6與乳桿菌屬親緣關(guān)系較近，在種水平上與16S rDNA鑒定結(jié)果一致，為L(zhǎng)actobacillussp.。

圖2 基于16S rDNA產(chǎn)酸菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of acidogenic strains

2.2 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

將分離得到的這7株產(chǎn)酸菌接種到相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)96 h后，測(cè)定發(fā)酵液中的總酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 產(chǎn)酸菌株的總酸產(chǎn)量Fig.3 Total acid production of acid producing strains

由圖3可知，7株產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸能力各不相同，其中醋酸菌（SAV-1、SAV-2、SAV-5和SAV-9）的平均產(chǎn)酸水平為1.97 g/100 mL，其中菌株SAV-1產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，總酸產(chǎn)量為3.06 g/100mL，其次為菌株SAV-9，總酸產(chǎn)量為2.92g/100 mL。產(chǎn)酸能力最弱的醋酸菌為SAV-5，總酸產(chǎn)量為0.64 g/100 mL。乳酸菌（SAV-6、SAV-7和SAV-8）的平均產(chǎn)酸水平為1.69 g/100 mL，其中菌株SAV-7產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，總酸產(chǎn)量為2.05 g/100mL，其次為菌株SAV-8，總酸產(chǎn)量為1.73g/100mL。產(chǎn)酸能力最弱的乳酸菌為菌株SAV-6，總酸產(chǎn)量為1.21 g/100 mL。因此，根據(jù)總酸產(chǎn)量高低，產(chǎn)酸能力較高的醋酸菌有SAV-1和SAV-9，產(chǎn)酸能力較高的乳酸菌有SAV-7和SAV-8。

2.3 高產(chǎn)酸菌株的醇酸耐受性

2.3.1 乙醇對(duì)高產(chǎn)酸菌株生長(zhǎng)的影響

乙醇對(duì)高產(chǎn)酸菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。由圖4A可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在5%～13%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，醋酸菌SAV-1的生物量呈現(xiàn)增加的變化趨勢(shì)，但在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到15%時(shí)，醋酸菌的生物量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由圖4B可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在5%～11%時(shí)，醋酸菌SAV-9隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加生物量呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)≥13%時(shí)，生物量呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)。這可能是因?yàn)橐掖际怯袡C(jī)化合物，較低濃度的乙醇可以作為醋酸菌的碳源和能源，有利于醋酸菌進(jìn)行自身代謝和生長(zhǎng)，而超過(guò)一定濃度范圍，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。由圖4C和4D可知乙醇對(duì)乳酸菌產(chǎn)生抑制，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，乳酸菌的生物量呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)。乙醇對(duì)兩株乳酸菌（SAV-7和SAV-8）的抑制作用較為相似，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在5%～9%時(shí)，對(duì)兩株乳酸菌具有一定的抑制作用，然而，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)≥11%時(shí)，對(duì)乳酸菌產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，因此，在乙醇耐受性上，這兩株乳酸菌能夠耐受9%的乙醇。

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)高產(chǎn)酸菌株生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the growth of high acid-producing strains

2.3.2 乙酸對(duì)高產(chǎn)酸菌株生長(zhǎng)的影響

乙酸對(duì)4株菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。由圖5A可知，低含量的乙酸（1%）對(duì)醋酸菌SAV-1的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。乙酸含量在2%～3%時(shí)，對(duì)菌株SAV-1的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但乙酸含量達(dá)到4%時(shí)，該菌株的生物量呈現(xiàn)急劇下降的變化趨勢(shì)，乙酸對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用。因此，乙酸含量在3%時(shí)，該菌株具有較好的耐受性。由圖5B可知，隨著乙酸含量的增加，醋酸菌SAV-9的生物量呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)乙酸含量為1%時(shí)，對(duì)菌株SAV-9有一定的抑制作用，當(dāng)乙酸含量≥2%時(shí)，該菌株的生物量急劇下降，因此，相對(duì)于菌株SAV-1，菌株SAV-9乙酸耐受性較差。由圖5C和5D可知，乙酸對(duì)兩株乳酸菌（菌株SAV-7和SAV-8）的影響較為相似，均是隨著乙酸含量的增加，菌株的生物量呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)乙酸含量在1%～2%時(shí)，菌株生長(zhǎng)雖受到抑制，生物量降低，但乳酸菌仍然能夠生長(zhǎng)，但當(dāng)乙酸含量≥3%時(shí)，乙酸對(duì)乳酸菌產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制，菌株SAV-7僅能夠少量生長(zhǎng)，而菌株SAV-8幾乎不生長(zhǎng)，因此，這兩株乳酸菌能夠耐受2%的乙酸。乙酸是弱有機(jī)酸，乙酸分子能夠跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且在胞內(nèi)解離產(chǎn)生質(zhì)子和醋酸陰離子，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。這可能是乙酸對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用的主要原因之一。

圖5 不同乙酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)高產(chǎn)酸菌株生長(zhǎng)影響Fig.5 Effect of different acetic acid volume fraction on the growth of high acid-producing strains

2.4 小結(jié)

綜上，通過(guò)對(duì)醋酸菌和乳酸菌的醇酸耐受性分析，醋酸菌SAV-1具有較高的醇酸耐受性，能夠耐受體積分?jǐn)?shù)為13%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為3%的乙酸；乳酸菌SAV-7和SAV-8均具有較高的醇酸耐受性，能夠耐受體積分?jǐn)?shù)為9%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸。該3株產(chǎn)酸菌具有高產(chǎn)酸性和高醇酸耐受性，可以作為潛在的食醋生產(chǎn)優(yōu)良菌株。

3 結(jié)論

本研究從山西老陳醋醋醅中篩選得到7株產(chǎn)酸菌，經(jīng)鑒定醋酸菌有4株，均屬于醋桿菌屬（Acetobacter），乳酸菌有3株，均屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）。通過(guò)菌株產(chǎn)酸性分析、乙醇耐受性分析和乙酸耐受性分析，從中篩選獲得了3株具有高產(chǎn)酸、高醇酸耐受性的優(yōu)良菌株，分別鑒定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）SAV-1、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SAV-7和SAV-8。其中巴氏醋桿菌SAV-1能夠耐受體積分?jǐn)?shù)為13%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為3%的乙酸。植物乳桿菌SAV-7和SAV-8能夠耐受體積分?jǐn)?shù)為9%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸，是潛在的食醋生長(zhǎng)優(yōu)良菌株。