(馬夢(mèng)瑤 謝巖黎 范亭亭 高 浦

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院1，鄭州 450001)

(河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，鄭州 450001)

小麥蛋白也稱(chēng)谷朊粉，是從小麥粉中分離得到的符合現(xiàn)代膳食營(yíng)養(yǎng)需求的天然蛋白質(zhì)[1]。小麥蛋白富含二硫鍵，根據(jù)其在乙醇溶液中的溶解性可分為可溶性的單體小麥醇溶蛋白和不溶性的聚集體小麥谷蛋白，麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)有四種類(lèi)型：α、β、γ和ω型；分子形狀為球形，分子量小，延展性好，彈性小[2]；麥谷蛋白是由多肽鏈的分子間二硫鍵形成的大分子聚合物，主要由2種亞基組成，分別為低分子量亞基和高分子量亞基，其分子內(nèi)含有較多的β-折疊結(jié)構(gòu)，易發(fā)生聚集作用，分子結(jié)構(gòu)呈纖維狀，具有彈性，延伸性小[3]。面筋蛋白是多數(shù)烘焙產(chǎn)品的主要原料，有助于改善加工過(guò)程中面團(tuán)的流變特性，因此，面筋蛋白在一定程度上決定了小麥粉產(chǎn)品的質(zhì)量[4,5]。小麥蛋白由于自身獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而含有大量的疏水性和不帶電荷的氨基酸，具有溶解性差、不易消化的特點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)和生活應(yīng)用里受到限制[6,7]。因此，研究提高面筋蛋白的溶解度，改善其功能性質(zhì)，拓寬其應(yīng)用范圍十分重要。

物理改性是利用超高壓、超聲波、熱處理及冷凍、超微粉碎等物理方式改變食品中蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與理化特性的方法, 可以顯著改善蛋白質(zhì)質(zhì)地、口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 有利于人體消化吸收，提高蛋白質(zhì)的利用率。面制品在凍藏過(guò)程中, 冰晶會(huì)發(fā)生遷移和重結(jié)晶, 導(dǎo)致面筋蛋白變性出現(xiàn)風(fēng)味減退等問(wèn)題[8]。WANG 等[9]研究結(jié)果表明，面筋蛋白在凍藏后發(fā)生解聚現(xiàn)象，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得疏松，熱穩(wěn)定性下降。黃達(dá)維等[10]研究了超聲對(duì)面筋蛋白功能性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，可提高面筋蛋白的起泡性和乳化性。熱加工是食品加工中的主要手段，研究表明熱加工可使蛋白發(fā)生降解或聚集，導(dǎo)致含量下降[11]。但是對(duì)蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)臒峒庸た梢酝ㄟ^(guò)增加蛋白酶的接觸位點(diǎn)來(lái)提高其功能特性[12,13]。王曉琳等[14]發(fā)現(xiàn)在100 ℃條件下加熱5 min時(shí),花生蛋白的乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值。齊寶坤等[15]研究了不同加熱溫度(80、90、100 ℃)對(duì)大豆11S球蛋白處理0～90 min后發(fā)現(xiàn)，熱處理會(huì)改變大豆11S球蛋白的Zeta電位和平均粒徑。陶汝清等[16]研究發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量下降、無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)顯著增加。

目前，關(guān)于熱處理對(duì)面筋蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性影響的報(bào)道較多，但缺乏對(duì)麥谷蛋白、麥醇溶蛋白單體深入的研究。本研究以麥谷蛋白、麥醇溶蛋白為原料，采用不同程度的熱處理，利用激光粒度分布儀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜和凱氏定氮儀研究不同熱處理時(shí)間對(duì)小麥蛋白粒徑、亞基、微觀結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及消化特性的影響，以期為改善面筋蛋白的功能特性及新產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥谷蛋白(Glu)；麥醇溶蛋白(Gli)；胃蛋白酶(2 940 U/mg)、胰蛋白酶(300 U/mg)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHA 傅里葉紅外光譜儀，DL-5-B低速離心機(jī)， SU3500掃描電子顯微鏡，BT-9300ST激光粒度分布儀，K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

Gli樣品制備：用75%的乙醇溶解適量的Gli，將形成的Gli溶液放置100 ℃的水浴鍋里分別加熱5、15、30 min，在干燥箱里干燥36 h后得到樣品A1、A2、A3。

Glu樣品制備：將適量的Glu溶于少量的NaOH中，形成的Glu溶液放置在100 ℃的水浴鍋里分別加熱5、15、30 min，在干燥箱里干燥36 h后得到樣品 B1、B2、B3。

1.3.2 粒徑測(cè)定

選用BT-9300ST激光粒度分布儀進(jìn)行粒度測(cè)定，以超純水為分散劑，設(shè)定實(shí)部折射率1.46，虛部折射率0.1。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)Laemmli[17]報(bào)道的方法, 在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)上進(jìn)行SDS-PAGE分析, 分別取麥醇溶蛋白、麥谷蛋白0.01 g放入小試管中，加入1 mL的樣品緩沖液，混勻后放入沸水中水浴加熱5 min，冷卻之后離心。電泳條件：縮膠濃度6%，分離膠濃度15%，上樣量10 μL，以10 μL Maker用作分子量標(biāo)記，先將電壓調(diào)至80 V至樣品進(jìn)入分離膠后再將電壓調(diào)至120 V直至電泳完成。然后將膠取出，染色，脫色，照相分析。

1.3.4 掃描電鏡分析

使用SU3500掃描電子顯微鏡觀察小麥蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，取干燥后的樣品平整處進(jìn)行噴金處理，于2 000倍放大倍數(shù)下觀察結(jié)構(gòu)，加速電壓為1.5 kV。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)小麥蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。紅外光譜采用OPUS軟件進(jìn)行掃描，測(cè)試參數(shù)為：分辨率：32-1；掃描次數(shù)：16次；掃描范圍：4 000～400 cm-1。樣品粉末與溴化鉀粉末按1∶50(m/m)比例混合后，置于模具中壓片后進(jìn)行測(cè)試。所有樣品圖譜采用OPUS和Peak Fit v4.12件進(jìn)行校正分析，確定各子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算各子峰面積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 體外消化率測(cè)定

小麥蛋白體外消化率的測(cè)定采用胃-胰蛋白酶兩步消化法[18]，樣品蛋白含量和沉淀蛋白含量的測(cè)定采用GB 5009.5—2010中的凱氏定氮法。模擬胃液：0.1 g胃蛋白酶溶于1 L濃HCl(pH=1.5)；模擬腸液：0.533 g胰酶溶于1 L磷酸鹽緩沖液中(pH=8)。具體方法如下：稱(chēng)取0.5 g樣品于三角瓶中，添加15 mL模擬胃液后在恒溫37 ℃振蕩水浴鍋中以190 r/min 轉(zhuǎn)速消化3 h；用0.2 mol/L的NaOH將消化液pH調(diào)至8.0，添加7.5 mL的模擬胃液后在恒溫37 ℃振蕩水浴鍋中消化2 h。模擬消化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即加入10 mL 20%的TCA終止反應(yīng)，離心30 min后取沉淀。體外消化率=(粗蛋白含量-沉淀蛋白含量)/粗蛋白含量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行初步整理，使用Oringin8.5軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，方差分析采用Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)小麥蛋白粒徑的影響

由圖1可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白的平均粒徑在加熱30 min時(shí)分別達(dá)到了254.3、237.4 μm，可能是熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，表明較高溫度的熱處理利于大尺寸聚集體的形成。粒徑的D10、D50、D90值可以更加清晰直觀地了解蛋白粒徑的分布情況，D10為累積分布百分比達(dá)到10%時(shí)的粒徑值；D50為累積分布百分比達(dá)到50%時(shí)的粒徑值，也稱(chēng)為中粒徑；D90表示累積分布百分比達(dá)到90%粒徑值時(shí)對(duì)應(yīng)的粒徑。由表1可以看到，隨著熱處理時(shí)間的增加，麥醇溶蛋白的D10逐漸減小，在熱處理30 min后麥醇溶蛋白中粒徑小于15.64 μm 的顆粒只占總顆粒的10%；繼續(xù)觀察D50值，發(fā)現(xiàn)在加熱處理30 min后麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的中粒徑顯著升高，表明在加熱過(guò)程蛋白的粒徑發(fā)生了明顯的變化，且D50處在130～220 μm之間，說(shuō)明蛋白粒度組成中中粒徑占的顆粒多為大蛋白顆，也說(shuō)明顆粒粒徑逐漸增大；麥醇溶蛋白與麥谷蛋白的D90值在未加熱時(shí)分別達(dá)到了288.9、210.4 μm，可能是由于蛋白樣品中本來(lái)就含有大顆粒物質(zhì)，可以看到隨著熱處理時(shí)

表1 不同熱處理后小麥蛋白的粒徑值

注：A0～A3分別為麥醇溶蛋白熱處理0、5、15、30 min；B0～B3分別為麥谷蛋白熱處理0、5、15、30 min，下同。

間的增加，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白的D90表現(xiàn)出大幅度的增長(zhǎng)，蛋白顆粒的粒徑的分布也逐漸向大顆?？拷?，說(shuō)明熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)加速蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，強(qiáng)化蛋白質(zhì)相互間的碰撞幾率，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子聚集現(xiàn)象[19]。

2.2 熱處理過(guò)對(duì)小麥蛋白的SDS-PAGE分析

圖2為麥醇溶蛋白與麥谷蛋白空白組和加熱處理后的SDS-PAGE圖。麥醇溶蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量在3×104～8×104u之間，形成的為球狀單體蛋白質(zhì)；麥谷蛋白是一種可溶性的多肽鏈蛋白質(zhì)，各肽鏈之間通過(guò)二硫鍵連接，相對(duì)分子質(zhì)量在105～107u之間，形成的是高分子聚合物。在SDS電泳系統(tǒng)中，HMW-GS(高分子量麥谷蛋白亞基)在凝膠板的上部，LMW-GS(低分子量麥谷蛋白亞基)處在中部，麥醇溶蛋白在下部[20]。從第一泳道可以明顯看到在分子量75～135 ku內(nèi)有三條很清晰的條帶，屬于高分子量麥谷蛋白亞基，分子量大且遷移速率慢；觀察麥醇溶蛋白的第5～8泳道可以看到，25～48 ku之間的圖譜顏色比較深，含量較多，分子量小遷移速率快。與空白組小麥蛋白相比，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白在經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的熱處理后，其電泳泳帶數(shù)目和相對(duì)遷移率都沒(méi)有發(fā)生顯著的變化，說(shuō)明小麥蛋白亞基沒(méi)有發(fā)生變化。在整個(gè)加熱過(guò)程中，小麥蛋白的亞基不會(huì)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而產(chǎn)生明顯變化。范鵬輝等[21]研究?jī)霾貢r(shí)間對(duì)面筋蛋白亞基的影響，發(fā)現(xiàn)麥谷蛋白和麥醇溶蛋白亞基分子量大小和分布均未發(fā)生明顯變化。

注：1～8泳道分別為B0、B1、B2、B3、A0、A1、A2、A3。

2.3 熱處理對(duì)小麥蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察小麥蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是了解蛋白結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵[22]。圖3為不同加熱時(shí)間下麥醇溶蛋白與麥谷蛋白的微觀結(jié)構(gòu)圖。可以看出，麥谷蛋白比較均勻，表面光滑，呈現(xiàn)規(guī)則的紋路；而醇溶蛋白表面較凹凸不平，紋路不規(guī)則。100 ℃5 min的麥谷蛋白與麥醇溶蛋白微觀結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比有一些差異，蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)少量破裂，完整性降低，繼續(xù)延長(zhǎng)加熱時(shí)間，會(huì)發(fā)現(xiàn)麥谷蛋白和麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重?cái)嗔?，已不能形成連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。可能是較高的溫度處理造成小麥蛋白表面張力變大，形成凹陷甚至破裂的不規(guī)則表面，這說(shuō)明熱處理會(huì)破壞小麥蛋白完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且隨著熱處理時(shí)間的增長(zhǎng)，小麥面筋蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)被進(jìn)一步破壞[23]。

圖3 熱處理后小麥蛋白的微觀結(jié)構(gòu)圖

2.4 傅里葉紅外光譜分析

圖4是麥醇溶蛋白與麥谷蛋白樣品經(jīng)過(guò)傅立葉去卷積處理和peakfit曲線(xiàn)擬合的酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)圖譜，蛋白質(zhì)的酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特有的峰形[24]。各二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例如表2所示，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，隨著100 ℃熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，β-折疊含量增大，加熱30 min后含量增加到35.95%、33.21%；而α-螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減小；β-轉(zhuǎn)角由未加熱的26.92%、28.12%下降到19.67%、17.63%；在熱處理30 min后，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別由21.80%、21.56%達(dá)到了29.78%、29.76%；說(shuō)明在加熱過(guò)程中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角向β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。這應(yīng)該是由于小麥蛋白在加熱過(guò)程中，存在于蛋白質(zhì)分子相鄰肽鍵間的氫鍵被破壞，維持α-螺旋的氫鍵斷裂，發(fā)生解螺旋，α-螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)減?。灰徊糠枝?螺旋結(jié)構(gòu)展開(kāi)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由有序趨向于無(wú)序，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加；另一部分α-螺旋結(jié)構(gòu)在分子間相互作用下轉(zhuǎn)換為β-折疊結(jié)構(gòu)，β-折疊結(jié)構(gòu)存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部折疊區(qū)域，通常造成β-折疊結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，從而改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松不緊密[25]。

表2 熱處理對(duì)小麥蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.5 熱處理對(duì)小麥蛋白體外消化率的影響

蛋白質(zhì)在經(jīng)過(guò)熱處理后，會(huì)改變其結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，導(dǎo)致消化特性發(fā)生改變。由圖4可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)100 ℃的加熱處理后，麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的消化率均有增加；且小麥蛋白在熱處理時(shí)間小于5 min時(shí)其體外消化率變化不大；但當(dāng)熱處理超過(guò)5 min時(shí)，小麥蛋白的體外消化率與熱處理時(shí)間成正比。熱處理破壞了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)增加其消化性[26]，因?yàn)榧訜釙?huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水鍵、氫鍵、二硫鍵、范德華力等發(fā)生斷裂重排，而這些鍵的斷裂重排在一定程度上有利于蛋白消化，此過(guò)程需要一定的作用時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)，作用力越大。

圖4 熱處理對(duì)小麥蛋白體外消化率的影響

3 結(jié)論

研究熱處理對(duì)麥醇溶蛋白和麥谷蛋白結(jié)構(gòu)特征和消化特性的影響，結(jié)果表明：小麥蛋白顆粒受熱發(fā)生聚集，導(dǎo)致蛋白分子粒徑逐漸向大顆粒轉(zhuǎn)變；小麥蛋白在整個(gè)加熱過(guò)程中并不會(huì)因?yàn)槭軣釋?dǎo)致亞基含量發(fā)生變化；隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥蛋白的微觀結(jié)構(gòu)從連續(xù)網(wǎng)狀向破裂無(wú)規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)換；熱處理會(huì)改變小麥蛋白的結(jié)構(gòu)，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白都表現(xiàn)為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小，而β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加；100 ℃的熱處理有利于小麥蛋白的消化吸收，且消化率與熱處理時(shí)間呈正比。