(常建偉 楊潤強 王 沛 顧振新

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，南京 210095)

小麥(TriticumaestivumL.)為禾本科單子葉植物，是我國北方地區(qū)重要的糧食作物。小麥籽粒主要用于制粉并加工成面制品。由于小麥磨粉時剔除的胚芽和麩皮中富含蛋白質(zhì)、脂肪和膳食纖維等營養(yǎng)素[1]，因而小麥籽粒全利用技術(shù)研發(fā)備受科技工作者的關(guān)注。小麥籽粒經(jīng)發(fā)芽形成麥苗后可以進一步提高其營養(yǎng)與保健價值，以此為原料開發(fā)功能性食品，達到小麥籽粒及其芽苗全利用的目的。

植物籽粒萌發(fā)后，內(nèi)源酶系被激活，大分子儲存性物質(zhì)降解成更易為人體消化吸收的小分子物質(zhì)[2]。同時，膳食纖維、葉綠素和維生素，以及酚類物質(zhì)和葉酸等生物活性物質(zhì)含量顯著增加[3]。研究表明，小麥芽苗有增強人體免疫力、抗氧化、抗疲勞、促進微循環(huán)和降低慢性疾病的風險等作用[4]。這些保健作用與其芽苗中獨特的酚類物質(zhì)及其抗氧化特性密切相關(guān)[5]。植物酚類化合物主要通過苯丙烷類代謝途徑生物合成[6]。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)、4-香豆酸-CoA連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)和肉桂酸4-羥化酶(Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)是酚類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶[7, 8]。酚類物質(zhì)的合成與積累與這些酶的基因表達密切相關(guān)。光照不僅為植物光合作用提供能量，而且還是植物體生長和發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子[9]。種子在萌發(fā)和芽苗生長時對光等環(huán)境變化尤為敏感[10]。光可以促進植物體內(nèi)酚酸等次級代謝產(chǎn)物的合成[9]。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)藍光處理顯著增加豌豆幼苗中綠原酸、沒食子酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸含量。紫外光(UV-B)和藍光處理顯著增加蘿卜芽苗菜中酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力[12,13]。青錢柳葉在藍光和綠光處理后酚類含量及抗氧化活性提升[14]。藍光連續(xù)照射顯著提高大豆芽苗中黃酮類化合物的含量[15]。這些研究僅在光質(zhì)對總酚含量和抗氧化能力的變化層面，鮮有涉及酚類物質(zhì)合成相關(guān)酶活性及其基因表達在光質(zhì)調(diào)控酚類物質(zhì)積累中的作用機制。

本研究用LED光源的白光、紅光、藍光、綠光及黃光處理小麥芽苗，探討了不同光質(zhì)下小麥芽苗生長狀況、總酚含量、酚酸組成及其抗氧化能力變化，研究了不同光質(zhì)對小麥芽苗酚類合成關(guān)鍵酶PAL、C4H和4CL活力及其基因表達量的影響，以揭示光質(zhì)調(diào)控酚類物質(zhì)積累的作用機理，為開發(fā)富含酚類的食品用小麥芽苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥(品種：淮麥33號)；酚酸標品：香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸和芥子酸均為分析純；DPPH(>97%)、ABTS(>98%)、Trolox(>97%)為分析純；甲醇、乙腈、乙酸為色譜純。

1.2 主要儀器設(shè)備

康麗CB-A321發(fā)芽機，LB-300-II光照培養(yǎng)箱，755B 型分光光度計，冷凍離心機，LC-20A型高效液相色譜儀(HPLC)。

1.3 實驗設(shè)計

小麥籽粒用去離子水沖洗干凈，置于1%(V/V)的次氯酸鈉水溶液浸泡消毒15 min，然后用去離子水漂洗至pH中性，洗凈的小麥籽粒在去離子水中于25 ℃浸泡6 h。籽粒浸泡后移入自動發(fā)芽機中，在溫度25 ℃、相對濕度85%條件下避光催芽2 d，剔除敗芽和死粒后，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。設(shè)定白光(W，400～690 nm)、紅光(R，600～690 nm，峰值655 nm)、綠光(G，460～597 nm，峰值 520 nm)、藍光(B，400～500 nm，峰值 445 nm)和黃光(Y，560～650 nm，峰值 595 nm)5種光處理，光照強度為(30±2) μmol/(m2·s)，光周期為光照16 h和黑暗8 h交替進行，光照培養(yǎng)箱內(nèi)相對濕度為85%，晝夜溫度均為25 ℃，以黑暗(D，不進行光照處理)為對照。芽苗生長期間，每小時噴淋1次去離子水，每次1 min，每24 h更換1次培養(yǎng)液。照光培養(yǎng)4 d后取樣。

1.4 測定指標與方法1.5 主要生理指標

芽長和根長：隨機選取30株小麥芽苗，用游標卡尺測定其芽長和根長，取其平均值，結(jié)果表示為cm/株。

鮮質(zhì)量/干質(zhì)量：隨機選取100株小麥芽苗，準確稱取其鮮質(zhì)量，冷凍干燥后再稱取其質(zhì)量，即為100株小麥芽苗的干質(zhì)量，重復稱量3組，取其平均值。

葉綠素含量：在黑暗條件下，小麥芽苗中葉綠素經(jīng)80%丙酮提取后，提取液分別在663 nm和645 nm下測定吸光值。

葉綠素a=12.72A663-2.59A645

葉綠素b=22.88A645-4.67A663

1.4.2 酚類化合物含量

采用Chen等[4]方法提取發(fā)芽小麥的游離酚和結(jié)合酚。總酚含量采用福林-酚法測定[16]，以沒食子酸配制標準曲線，總酚含量以 mg GAE/100 g DW 計。酚酸含量參考Wang等[17]的方法測定。樣品通過HPLC分析(島津LC-20A高效液相色譜)，配備C18 110A(5 μm粒徑，4.6×150 mm)，流動相A為0.1%的醋酸水溶液，流動相B為甲醇，柱溫35 ℃，波長280 nm。根據(jù)酚酸標品進行分析和定量，酚酸含量以 μg/g DW計。

1.4.3 自由基清除能力

ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力：參照Chen等[18]和Ma等[16]方法。以Trolox作為標準品，分別在734 nm和515 nm波長下測定吸光值。自由基清除活性用 μmol TE(Trolox equivalents)/g DW表示。

1.4.4 酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶活力

PAL活力：參照Chen等[18]的方法，在290 nm下測定OD值。以每小時每克小麥芽苗(鮮質(zhì)量)酶促反應(yīng)體系吸光度增加0.01為1個PAL活性單位(U)，表示為0.01ΔOD290/h·g FW。

C4H活力：參照Yan等[19]的方法，在340 nm下測定OD值。以每分鐘每克小麥芽苗(鮮質(zhì)量)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為1個C4H活性單位(U)，表示為0.01ΔOD340/min·g FW。

4CL活力：參照陳雷等[20]的方法，在333 nm下測定OD值。以每分鐘每克小麥芽苗(鮮質(zhì)量)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為1個4CL活性單位(U)，表示為0.01 ΔOD333/min·g FW。

1.4.5 基因表達分析

PAL、C4H和4CL的引物參考Chen 等[18]的引物序列，如表1所示，由南京某公司合成。取10株液氮速凍后的小麥芽苗，按照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara, RT-PCR Mater Mix Kit, Catalog No. RR036A)合成第一鏈cDNA。

表1 qRT-PCR分析引物序列

使用SYBR Premix Ex Taq (Takara, catalog no. RR420A)試劑盒和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System進行實時熒光定量PCR分析，熒光定量PCR擴增程序為：第一步(預變性)，95 ℃，30 s；第二步(PCR反應(yīng))，95 ℃，30 s，再 60 ℃，30 s，循環(huán)40次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗設(shè)3次生物學重復，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SAS 9.2軟件Duncan’s多重比較法進行顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥芽苗主要生理代謝

從圖1可以看出，與對照(D)相比，紅光和黃光提高了小麥芽苗芽長和鮮/干質(zhì)量比，說明紅光和黃光增加芽苗含水量，促進其生長。紅光和黃光處理的小麥芽苗芽長分別是對照的1.26 倍和1.20倍(圖1c)。白光和藍光顯著減少了小麥芽苗的根長，其中白光處理下小麥芽苗根長最短，相較對照減少了9.25%，紅光、綠光和黃光對小麥根長無顯著影響。小麥芽苗中葉綠素a占總?cè)~綠素含量的77.75%～87.90%(圖1b)。白光處理下總?cè)~綠素含量最高，綠光處理下總?cè)~綠素含量最低，較白光(W)下降34.47%，說明綠光不利于葉綠素的積累。圖1d顯示，紅光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗的鮮/干質(zhì)量比，分別為對照的1.11 倍和1.09 倍；白光、綠光和藍光對其則無顯著影響。

注：D：黑暗；W：白光；R：紅光；B：藍光；G：綠光；Y：黃光；下同。不同光質(zhì)處理的前2 d為黑暗催芽，第3天開始照光處理4 d，光強為30 μmol/(m2·s)，光周期為白天16 h，黑暗8 h，取生長6 d的小麥芽苗供實驗研究；葉綠素測定時取籽粒上方綠色的莖葉部位作為材料進行葉綠素測定。同一顏色柱上小寫字母不同表示不同處理間存在顯著差異(P<0.05)，下同。

2.2 小麥芽苗總酚含量

由圖2可知，光照處理顯著增加了小麥芽苗中總酚含量，以黃光、綠光和藍光處理的小麥芽苗增加最多，較對照(D)分別增加19.64%、18.21% 和17.99%；白光處理增加最少，僅為對照(D)的1.05倍。光照處理下小麥芽苗中結(jié)合酚含量顯著高于游離酚含量(P<0.05)，且經(jīng)過光照處理后，結(jié)合酚增加幅度大于游離酚。與對照相比，光照處理顯著增加了小麥芽苗中結(jié)合酚含量。黃光處理下結(jié)合酚含量最高，是對照的1.33 倍。藍光、綠光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗中游離酚含量，其中以藍光處理為最高，達到858.65 mg GAE/100 g DW，較對照增加12.40 %。

注：同一顏色柱子上不同小寫字母表示不同處理間存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 小麥芽苗酚酸含量

不同光質(zhì)對小麥芽苗中6種主要酚酸含量的影響見表2。小麥芽苗中酚酸以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式存在，其中阿魏酸最高，達2 420.59～2 668.53 μg/g DW。

表2 不同光質(zhì)處理下小麥芽苗酚酸含量變化

綠光處理顯著增加了小麥芽苗總阿魏酸質(zhì)量分數(shù)，較對照(D)增加了10.24%，其他光質(zhì)處理對總阿魏酸含量無顯著影響。結(jié)合態(tài)阿魏酸是小麥芽苗中阿魏酸的主要形式，其占總阿魏酸質(zhì)量分數(shù)的76.77%～83.52%。光照處理顯著增加了結(jié)合態(tài)阿魏酸含量，其中綠光處理下結(jié)合態(tài)阿魏酸含量最高，是對照的1.12倍。而光照處理顯著降低了游離態(tài)阿魏酸含量。表明光處理使小麥芽苗中阿魏酸由游離態(tài)向結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化。

光照處理顯著增加了小麥芽苗中總對香豆酸含量，其中黃光處理下總對香豆酸含量最高，較對照增加78.36%。除黃光外，其余光處理顯著降低了游離態(tài)對香豆酸質(zhì)量分數(shù)，降低了15.13%～47.07%；同時，結(jié)合態(tài)對香豆酸質(zhì)量分數(shù)顯著提高，較對照增加43.95%～85.61%。

綠光和黃光處理下總咖啡酸含量顯著增加，分別為對照的1.16 倍和1.25 倍。白光處理顯著降低了總咖啡酸含量。小麥芽苗中咖啡酸主要以游離態(tài)形式存在，其占總咖啡酸的78.51%～87.65%。與對照相比，黃光和綠光顯著增加了游離態(tài)咖啡酸含量，分別為對照的1.11倍和1.26倍。光照處理均顯著增加了結(jié)合態(tài)咖啡酸含量，其中黃光處理下最高，是對照的1.35 倍。

與對照相比，光照處理均顯著增加了總香草酸含量，綠光和黃光處理顯著增加了丁香酸總含量，藍光、紅光和白光處理顯著增加總芥子酸含量。

2.4 小麥芽苗酚酸合成關(guān)鍵酶活力

如圖3a所示，發(fā)芽4 d時，白光、紅光和黃光處理下PAL活力相較于對照(D)分別增加19.13%、34.82%和30.67%，藍光和綠光處理下PAL活力與對照無顯著差異。發(fā)芽6 d時，各光質(zhì)處理下PAL活力均顯著高于對照，其中綠光處理下小麥幼苗中PAL活力最高，是對照的1.51 倍，其次是黃光和藍光，分別為對照的1.48 倍和1.45 倍。不同發(fā)芽時間下光照對C4H的影響存在差異。發(fā)芽4 d時，光照處理對小麥苗C4H活力無顯著影響，但在發(fā)芽6 d時，光照處理均顯著提升了C4H活力，且綠光處理下C4H活力最高，是對照的2.29 倍(圖3b)。不同的光質(zhì)處理均顯著提升了4CL活力，且綠光處理下4CL活力最高(圖3c)。

圖3 不同光質(zhì)處理下小麥芽苗酚類合成關(guān)鍵酶活力變化

2.5 小麥芽苗酚類合成基因表達

如圖4a所示，發(fā)芽4 d時，白光和綠光處理下PAL表達量較對照(D)分別增加了26.67%和31.50%；發(fā)芽6 d時，除紅光外，其他光質(zhì)處理顯著增加了PAL表達量，其中藍光處理下PAL表達量最高，是對照的1.54 倍。由圖4b可知，發(fā)芽4 d時，綠光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗中C4H表達量，分別是對照的1.31 倍和1.29 倍；發(fā)芽6 d時，光照處理顯著提高了小麥芽苗C4H表達量，且綠光處理組C4H表達量最高。4CL表達量在光照處理下顯著增加，發(fā)芽4 d時，綠光處理組4CL表達量最高，是對照的2.13倍；發(fā)芽6 d時，藍光處理組4CL表達量最高，是對照的2.27倍(圖4c)。

圖4 不同光質(zhì)處理下小麥芽苗PAL(a)、C4H(b)和4CL(c)表達量變化

2.6 小麥芽苗抗氧化能力

由圖5可知，與對照(D)相比，藍光、綠光和黃光處理顯著增加了小麥芽苗DPPH·和ABTS+·清除能力，各處理組中結(jié)合酚的DPPH·和ABTS+·清除活性均顯著高于游離酚，這與不同光質(zhì)處理下總酚含量的變化趨勢一致。游離酚中，藍光、綠光和黃光處理組DPPH·清除活性分別是對照的1.15倍、1.15倍和1.14倍，ABTS+·清除活性分別是對照的1.13倍、1.18倍和1.21倍。結(jié)合酚中，藍光、綠光和黃光處理組DPPH·清除活性分別是對照的1.30倍、1.35倍和1.31倍，ABTS+·清除活性分別是對照的1.12倍、1.18倍和1.14倍。

圖5 不同光質(zhì)處理小麥芽苗ABTS +·和DPPH·清除能力變化

3 討論

作為冷光源的LED具有光譜集中、光效高、波長類型豐富、光量可調(diào)節(jié)、環(huán)境友好等優(yōu)點，近年來被廣泛應(yīng)用于設(shè)施作物的生理研究與生產(chǎn)中。研究表明，紅光在增加小麥芽苗長度、促進細胞呼吸和干物質(zhì)積累方面有重要作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅光和黃光顯著提高了小麥芽苗的苗長和鮮/干質(zhì)量比，增加小麥芽苗產(chǎn)量和提高營養(yǎng)價值[22]。另外，紅光對小麥芽苗根長的抑制最為顯著，這與黃瓜和蘿卜離體培養(yǎng)中紅光抑制根的生長結(jié)果一致[23,24]。光在刺激葉片伸展和葉肉細胞分化的同時，促進原質(zhì)體或黃化體向葉綠體轉(zhuǎn)化[25]。本研究中，小麥芽苗經(jīng)光照處理后葉綠素含量增加，且在單色光中以紅光處理下總?cè)~綠素和葉綠素a含量最高。據(jù)報道[25]，紅光可顯著提高葉綠素a/b比值，改善葉色。因此，食品用小麥芽苗生產(chǎn)中可以適度提高紅光的比例，以增加葉綠素含量。

植物生長發(fā)育受到外界環(huán)境的影響，幼苗對外界環(huán)境的變化尤為敏感。本研究使用LED光源通過精確調(diào)節(jié)光譜，系統(tǒng)研究了光質(zhì)對小麥芽苗中酚類化合物積累的影響。小麥芽苗經(jīng)光照處理后總酚含量(圖2)及多種酚酸含量(表2)均有顯著增加，其中藍光、綠光和黃光更有利于酚類物質(zhì)的積累和增強抗氧化能力(圖5)。這可能與緩解植物在單色光脅迫下產(chǎn)生的膜脂過氧化傷害有關(guān)[26]。研究表明，UV-B輻射會引起植物體氧化應(yīng)激反應(yīng)，抗氧化酶被激活，同時酚類、抗壞血酸和谷胱甘肽等抗氧化物質(zhì)大量合成，在不同單色光處理下植次級代謝產(chǎn)物的積累可能是植物應(yīng)對外界環(huán)境改變的一種自我防御機制[27]。當植物處于光脅迫時，光合作用和生物量的積累顯著降低，但會形成酚類化合物等次生代謝產(chǎn)物，以此提高其抗氧化性。本研究中，光照處理顯著提高了小麥芽苗游離和結(jié)合酚提取物 DPPH·和 ABTS+·清除能力，特別是藍光、綠光和黃光對清除率的增加最為顯著，表明酚類物質(zhì)在提高小麥芽苗抗氧化活性方面發(fā)揮了重要作用(圖5)。植物生長過程中細胞分裂、體積增大，而細胞壁中木質(zhì)素合成與酚類物質(zhì)代謝相關(guān)，在植物形成木質(zhì)素的過程中，產(chǎn)生各種酚類中間代謝產(chǎn)物[28]。本研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸是小麥芽苗中主要的酚酸(表2)，這與Chen等[27]的研究結(jié)果一致。藍光、綠光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗中結(jié)合態(tài)阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸含量。這可能與單色光激活小麥芽苗的防御體系，從而激活苯丙烷類及木質(zhì)素合成代謝途徑，進而引起p-香豆酸和阿魏酸的大量形成與積累[27]。香草酸和丁香酸在小麥芽苗中含量較低(表2)，光照對兩者的影響較小。

植物中酚類化合物的合成主要通過苯丙烷類代謝途徑，其含量的增加與苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶基因表達及其酶的活力有關(guān)[29]。苯丙烷途徑基因表達可以被光激活[30]。PAL是該途徑的限速酶，本研究中PAL表達量與小麥芽苗中阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸的積累成正相關(guān)(圖4和表2)，表明PAL表達量及其酶活力的增加使酚類物質(zhì)得以積累。本研究結(jié)果顯示，藍光、綠光和黃光處理可提高小麥芽苗苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵基因C4H和4CL的表達量及其酶活性，從而促進酚類物質(zhì)的積累，這與Liu等[26]和魯燕舞等[13]的研究結(jié)果一致。綠光處理下小麥芽苗有最高的PAL、C4H和4CL表達量及對應(yīng)的酶活力，因而綠光照射有助于刺激苯丙烷代謝途徑，加速小麥芽苗中酚類物質(zhì)的合成，這為富含抗氧化物質(zhì)的功能性小麥芽苗食品開發(fā)提供了原料。

4 結(jié)論

紅光和黃光顯著增加小麥芽苗的芽長和鮮/干質(zhì)量比，促進生長。藍光、綠光和黃光更利于增加小麥芽苗中總酚和酚酸含量，提高抗氧化能力。與對照相比，藍光、綠光和黃光處理下總酚質(zhì)量分數(shù)增加了17.99%、18.21%和19.64%。阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸在藍光、綠光和黃光處理下顯著提高。藍光、綠光和黃光通過上調(diào)小麥芽苗中PAL、C4H和4CL的表達，提升相應(yīng)酶活力，促進了酚類物質(zhì)的合成與積累，從而增強小麥芽苗抗氧化能力。