王衛(wèi)敏，李長安，鄭輝，狄貫騰(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，.感染科，.檢驗科，.公共衛(wèi)生科，河南新鄉(xiāng) 453000)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是嚴重影響人類生命健康的疾病，而肝纖維化是乙肝最為顯著的特征之一[1]。肝纖維化的早期診斷和持續(xù)隨訪對于預防肝硬化和終末期肝病至關重要。非創(chuàng)性血清學指標對于預測疾病進展具有重要的意義。研究表明，在HBV相關的肝纖維化過程中，多伴隨著微小RNA(microRNA, miRNA)表達量的改變[2]。miRNA有望成為HBV相關肝纖維化的生物學標志物[3]。本研究旨在檢測HBV相關肝纖維化患者血清中差異表達的miRNA，初步探討該類差異表達的miRNA在HBV相關肝纖維化進展過程中的作用機制。

1 材料和方法

1.1研究對象 選擇2019年3月至2020年3月于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院感染科經(jīng)組織活檢診斷為肝纖維化(S2～S3期)的患者70例作為研究對象，其中包括乙肝患者35例[男15例，女20例，年齡(46.27±18.62)歲]，非乙肝患者(除乙肝外的慢性肝病所致的肝纖維化患者)35例[男18例，女17例，年齡(40.59±14.77)歲]，納入標準：6個月內(nèi)未經(jīng)核苷(酸)類抗病毒治療且至少間隔3個月的2次丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測超過參考值上限的2倍；組織活檢診斷為纖維化S2～S3期。乙肝納入：符合《慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版》中的診斷標準[4]。排除標準：(1)感染人類免疫缺陷病毒的患者；(2)由其他病因(包括丙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、藥物攝入、酒精攝入、自身免疫性肝炎等)造成肝損傷的患者；(3)有嚴重系統(tǒng)性疾病者；(4)懷孕和哺乳者。收集同期體檢健康者35例作為健康人對照組，男21例，女14例，年齡(47.45±12.51)歲。本研究通過新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(批準文號：20190601)，各研究對象均簽署知情同意書。

1.2標本采集 取上述肝纖維化患者治療前(健康者于體檢時采集)的空腹外周血標本10 mL，經(jīng)2 500 r/min離心10 min,分離血清，10 000 r/min離心10 min,完全清除細胞碎片。將血清收集于含EDTA-K2的抗凝管中，置于-80 ℃保存。

1.3主要儀器及試劑 TruSeq小RNA樣品制備試劑盒(TruSeq Small RNA Sample Prep Kit，美國Illumina公司)，TRIzol LS試劑(美國Invitrogen公司)，RevertAid逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)，miRNA qPCR master mix 試劑盒(上海生工公司)，膠回收試劑盒(北京天根公司)。 NanoDrop ND-2000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)， Agilent 生物分析儀(美國Agilent公司)，Illumina GA IIx測序儀(美國Illumina公司)，Qubit 2.0熒光定量儀、E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國Invitrogen公司)。

1.4血清中總RNA提取 取上述各研究對象的血清標本6 mL，采用TRIzol LS試劑提取血清總RNA。采用NanoDrop ND-2000分光光度計檢測并分析RNA的純度及濃度，取吸光度A260 nm/A280 nm>2.0、A230 nm/A260 nm>1.8的樣本，置于-80 ℃保存。

1.5文庫構建、測序及分析 按照TruSeq小RNA樣品制備試劑盒說明書進行文庫構建。通過兩步法將RNA 3′接頭和5′接頭連接至miRNA。通過RevertAid逆轉錄試劑盒合成單鏈cDNA，對樣本進行PCR擴增，通過膠回收試劑盒回收目的片段，即得到miRNA文庫。取1 μL產(chǎn)物上樣至 Agilent 生物分析儀，采用Qubit 2.0熒光定量儀分析樣本的大小、純度和濃度。文庫質(zhì)量控制的標準：將質(zhì)量值低的序列去掉；去除未知堿基含量超過10%的序列；去除無接頭的序列；去除<18 bp或>30 bp的序列。以差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)表示兩樣本間表達量的比值。在差異表達miRNA檢測過程中，使用∣log2(FC)∣≥1且FDR≤0.1作為篩選標準。

1.6qRT-PCR檢測血清中miRNA的表達 參考 RevertAid逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA，cDNA產(chǎn)物置于-80 ℃保存。按照miRNA qPCR說明書對miRNA進行相對定量，根據(jù)GenBank中U6(NR_004394.1)、miR-197-3p(NR_029583.1)、miR-500a-3p(NR_030224.1) 、miR-33a-5p(NR_029507.1) 基因的序列號，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并送上海生工公司合成。U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，目的產(chǎn)物長度77 bp；miR-505-3p上游引物序列：5′-GCGAGCACCGTCAACACT-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′，目的產(chǎn)物長度67 bp；miR-197-3p上游引物序列：5′-GGGTGGCAGTGTCTTAGC-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGTCCGAGGT-3′，目的產(chǎn)物長度73 bp；miR-500a-3p上游引物序列：5′-GGGGGCAGATAGACGCT-3′，下游引物序列：5′-TGCACGAACTCTATCTC-3′，目的產(chǎn)物長度64 bp；miR-33a-5p上游引物序列：5′-GGGATTCTCCCCCTGCC-3′，下游引物序列：5′-AAGAGAGTACCGGC-3′，目的產(chǎn)物長度73 bp。PCR總反應體系為50 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×miRNA qPCR master mix 10 μL，1 μL cDNA，1 μL ROX Reference Dye (H)，無菌ddH2O補足體積至50 μL。PCR反應參數(shù):95 ℃預變性20 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取擴增產(chǎn)物2 μL，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并用E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照。結果以2-△△Ct法表示。

1.7miRNA靶基因生物信息學分析 通過數(shù)據(jù)庫 TargetScan 和 miRanda 相結合預測miRNAs的靶基因。然后，基于數(shù)據(jù)庫將所有的靶基因進行 GO(Gene ontology)注釋，篩選出靶基因富集的顯著性 GO。最后基于 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫對靶基因進行注釋。

2 結果

2.1各組研究對象的臨床病理參數(shù) 乙肝組與健康人對照組、乙肝組與非乙肝組臨床病理參數(shù)(包括性別、年齡、血液生化指標等)的比較結果見表1。

表1 乙肝組、健康人對照組和非乙肝組的臨床病理參數(shù)比較

2.2差異表達miRNA的聚類分析 根據(jù)miRNA表達FC和P值分析結果表明，與健康人對照組相比，在乙肝組中有53個表達差異的miRNA，其中表達上調(diào)的miRNA有30個(FC>2，P<0.05)，表達下調(diào)的miRNA有23個(FC>2，P<0.05)。與非乙肝組相比，在乙肝組中有23個顯著性表達miRNA，其中表達上調(diào)的miRNA有14個(FC>2，P<0.05)，表達下調(diào)的miRNA有9個(FC>2，P<0.05)。與健康人對照組和非乙肝組相比，miR-505-3p、miR-197-3p、miR-500a-3p、miR-33a-5p在乙肝組中的表達差異最為顯著(表2)。

表2 乙肝組中表達顯著性差異的miRNA

2.3差異表達miRNA的鑒定結果 qRT-PCR結果表明，miR-505-3p、miR-197-3p和miR-500a-3p的表達水平在乙肝組中顯著上調(diào)(P<0.01)，miR-33a-5p的表達水平在乙肝組中顯著下調(diào)(P<0.01)。與健康人對照組和非乙肝組相比，乙肝組中miR-505-3p、miR-197-3p和miR-500a-3p顯著下調(diào)，miR-33a-5p顯著上調(diào)(表3)。

表3 差異表達miRNA在健康人對照組、非乙肝組和乙肝組中的表達

2.4miRNA靶基因和GO注釋 肝纖維化組差異表達miRNA(miR-505-3p、miR-197-3p、miR-500a-3p、miR-139-5p、miR-1273g-5p、miR-33a-5p和miR-3960)的潛在靶基因共59個(表4)。上述差異表達的miRNA所對應的靶基因主要涉及的生物學過程包括細胞的生長、維持和信號轉導等(表5)。

表4 肝纖維化組差異表達miRNA的潛在靶基因

表5 差異表達的miRNA靶基因的功能

3 討論

肝纖維化的早期診斷和持續(xù)隨訪對于預防肝硬化和終末期肝病至關重要。臨床上常用的診斷方法——肝活檢是一種有創(chuàng)性的手術，具有很大的局限性，因此，迫切需要一種新的診斷方法。既往研究證實了循環(huán)miRNAs可作為肝纖維化疾病進展的生物學標志物[5]。另有學者在HBV感染患者S1～S4期組中檢測到140個miRNA，其中有12個miRNA在各個階段均有差異表達[6]。

在本研究中納入了75例肝纖維素化患者，其中包括了35例非乙肝患者和35例乙肝患者，同時以35例健康者作為對照。采用高通量測序?qū)BV相關纖維化差異表達的miRNA進行了篩選。發(fā)現(xiàn)與健康人對照組相比，在乙肝組中有53個表達具有顯著性差異的miRNA，其中表達上調(diào)的miRNA有30個，表達下調(diào)的有23個。與非乙肝組相比，在乙肝組中有23個顯著性表達的miRNA，其中表達上調(diào)的miRNA有14個，表達下調(diào)的miRNA有9個。筆者選取乙肝組中表達差異最為顯著的miR-505-3p、miR-197-3p、miR-500a-3p、miR-33a-5p進行進一步分析。通過GO分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要涉及生物學過程、細胞組分以及分子功能。但本研究報道的差異表達的miRNA通過轉導通路參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，但具體機制仍需進一步驗證。部分miRNA已有相關研究報道。例如，miR-505-3p可以通過上調(diào)趨化因子受體，在高膽固醇血癥中發(fā)揮了重要作用[7]。miR-197-3p在肺癌患者血漿中表達異常，有望成為肺癌的標志物[8]。然而，這些miRNA是否與HBV相關肝纖維化有關，仍需要進一步的實驗驗證。

綜上所述，本研究結果表明，表達差異顯著的miRNA可能作為HBV相關肝纖維化的臨床標志物。然而，本研究分析的樣本量有限，結果還不足以確定miRNA的表達與HBV相關肝纖維化之間的關系存在一定的規(guī)律，但對于研究HBV相關肝纖維化的發(fā)生以及臨床上早期診斷和預防研究具有重要的參考價值，血清中miRNA的含量或可作為肝纖維化的診斷和預后生物學標志物。