余厚美 王琴飛 林立銘 徐緩 李其鑄 范武波 張振文

摘要：【目的】基于酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測原理，建立高靈敏度的直接競爭法檢測木薯粉及其制品中的黃曲霉毒素B1（AFB1），為木薯食品安全提供技術(shù)支持。【方法】通過對AFB1抗原結(jié)構(gòu)改造、免疫和細胞融合等過程獲得抗原抗體，建立高靈敏度檢測方法，并進行木薯粉及其制品樣本的實例驗證?！窘Y(jié)果】制備的AFB1抗原和抗體，其抗體亞型均為IgG1，靈敏度最高的3F2細胞株產(chǎn)生的抗體對黃曲霉毒素G1、G2和B2交叉反應(yīng)率分別為21.4%、1.9%和8.8%，且對其他毒素類無交叉反應(yīng)，建立的ELISA線性區(qū)間為0.02～0.48 μg/kg，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.047 μg/kg，標準方程為y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978）。以35%甲醇水溶液作為標準品稀釋液，木薯食品原料用70%甲醇水溶液加0.2 g NaCl作為提取液，含油脂的木薯糕點用70%甲醇水溶液作為提取液，所有樣本均為10倍稀釋，檢測限0.2～4.8 μg/kg，樣品添加回收率81.5%～120.0%，變異系數(shù)均小于8.5%。應(yīng)用驗證試驗表明，自建ELISA試劑盒對96份樣本檢出19份陽性樣本，購買試劑盒檢出7份陽性，大于2.0 μg/kg的樣本檢測結(jié)果完全符合，自建ELISA試劑盒方法靈敏度優(yōu)于購買的ELISA試劑盒?！窘Y(jié)論】本研究建立的直接競爭ELISA方法靈敏度高，操作簡單，可廣泛應(yīng)用于木薯粉及其制品樣本中AFB1的快速測定。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1;快速檢測;酶聯(lián)免疫分析;木薯粉

中圖分類號：S379.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2824-10

Abstract：【Objective】Based on the principle of enzyme-linked immunoassay（ELISA），to establish high-sensitive direct competitive ELISA for detecting aflatoxin B1（AFB1） in cassava flour and based products samples，provide technical support for cassava food processing and utilization. 【Method】Antigen and antibody were obtained through structural modification of AFB1 antigen，immunization，cell fusion and others protocol. Then the highly sensitive rapid test was established，and it was carries on to test examples comparison with kits from market for verification for cassava flour and based products sample. 【Result】The results showed that AFB1 antigen and antibody were successfully synthesized，whose antibody subtypes were all IgG1. One of the most sensitive 3F2 cell line had a cross-reactivity to aflatoxins G1，G2，and B2 for 21.4%，1.9%，8.8% respectively，and they had no cross-reactivity to other toxins. The linear range of ELISA was 0.02-0.48 μg/kg，half inhibitory concentration（IC50） was 0.047 μg/kg，the standard equation was y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978）. With 35% methanol aqueous solution as standard diluent，cassava food raw materials were extracted with 70% methanol aqueous solution and 0.2 g NaCl，the oil-containing cassava pastries were using 70% methanol aqueous solution as the extract，all samples were 10 times diluted. It also found the detection limit was 0.2-4.8 μg/kg and，the recovery rate of cassava flour and based products samples addition was 81.5%-120.0%，whose coefficient of variation was less than 8.5%. While，the test results showed that，the self-built ELISA kit detected 19 positive samples from 96 samples，and the purchased ELISA kit detected 7 positive samples. The detection results of samples more than 2.0 μg/kg were in complete agreement，self-developed ELISA kit was more sensitive than the ELISA kits from market. 【Conclusion】The direct competitive ELISA method established in this study has high sensitivity，simple operation to be widely used for rapid determination for AFB1 in cassava flour and based products.

Key words：aflatoxin B1; rapid test; enzyme-linked immunoassay（ELISA）; cassava flour

Foundation item：National Key Research and Development Program（2018YFF0213502）;Modern Agricultural Industrial Technology System Construction Project（CARS-11-HNZZW）;Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630052020018）

0 引言

【研究意義】黃曲霉毒素（Aflatoxins）是黃曲霉菌及曲霉寄生菌族類產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)類似物的總稱（李少暉等，2015），在各種糧食、食品和飼料中廣泛存在（劉偉偉等，2011），且理化性質(zhì)穩(wěn)定，現(xiàn)有的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝無法避免和消除污染（孫清，2017）。其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性和“三致”（致癌、致畸、致突變）均居首位（王督等，2014）。歐盟規(guī)定AFB1含量不得高于2 μg/kg，我國國家標準GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》規(guī)定糧食中AFB1含量不得超過5 μg/kg，特殊膳食用食品不得超過0.5 μg/kg。木薯是一種重要的塊根糧食作物（朱艷梅等，2016;胡廣和梁大成，2019），全世界木薯產(chǎn)量的65%左右用于人類食物（韓和悅，2017）。我國是世界木薯第一進口大國，現(xiàn)行國家標準GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》第五法中AFB1在薯干中的檢出限是5 μg/kg。因此，制備抗原和單克隆抗體，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)檢測原理，建立高靈敏度的檢測方法檢測木薯粉及其制品中AFB1，對木薯粉及其食品制品的推廣和木薯食用化利用具有重要意義。【前人研究進展】檢測AFB1含量的方法主要有液相色譜法、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器方法（趙浩軍等，2013;謝潔，2017;任宏彬等，2019）和ELISA、免疫層析試紙條等快速檢測方法（王春燕等，2019;李丹陽等，2020;張敏等，2020）。儀器方法雖然靈敏、準確，但儀器昂貴、耗時長，無法滿足基層對大量樣本的篩查。ELISA利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，具有靈敏度高、通量大、耗時短和成本低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于源頭監(jiān)測和成規(guī)模的樣本篩查（蔡雪等，2019;Satyanarayana et al.，2019）。蔣佳伊等（2020）利用ELISA檢測中藥材酸棗仁中AFB1，線性范圍為0.05～0.58 μg/kg，檢測限達1.69 μg/kg，與超高液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測結(jié)果符合良好。真菌毒素污染廣泛，王國強等（2019）對來自不同省份的飼料及其原料進行霉菌毒素檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣本均被污染，同時被3種以上毒素污染的樣本高達76.55%。在喀麥隆、貝寧、尼日利亞等國家有木薯中檢測出AFB1的報道，除尼日利亞木薯樣本的檢測方法為薄層色譜法外，喀麥隆和貝寧木薯的檢測方法均為液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Adegoke et al.，1991，1993;Ediage et al.，2011，2014）。【本研究切入點】雖然國內(nèi)外己有AFB1的很多快速檢測產(chǎn)品出現(xiàn)，但目前未見有針對木薯粉及其制成的系列食品進行AFB1定量檢測的相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】經(jīng)制備單克隆抗體，建立直接競爭ELISA法，檢測木薯粉及其制品中的AFB1，為木薯食品安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

標準品黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素M1（AFM1）、黃曲霉毒素M2（AFM2）、赭曲霉毒素A（OTA）、嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）購自天津阿爾塔科技有限公司;AFB1 ELISA試劑盒購自河北伊萊莎生物技術(shù)有限公司;AFB1-BSA抗原和AFB1抗體購自海南億康生物科技有限公司;小鼠抗體亞型鑒定試劑盒和辣根過氧化物酶（HRP）購自Sigma公司;氯化鈉和甲醇等化學(xué)試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;Balb/C小鼠購自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)中心;木薯全粉（Whole cassava flour，WCF）、 木薯淀粉（Cassava starch，CS）、木薯粉（Cassava flour，CF）、木薯干片（Dry cassava chips，DCC）、木薯面條（Cassava noodle，CN）、木薯粉條（Casssava starch noodles，CSN）、木薯粉酥餅（Cassava flour shortbread，CFS）、木薯蔓越莓餅干（Cassava cranberry cookies，CCC）和木薯蛋糕（Cassava cake，CC）樣品參照《木薯及其食品加工技術(shù)》（張振文和李開綿，2019）進行制作，木薯由國家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心提供;玉米和大豆購自當?shù)厥袌?。主要儀器設(shè)備：Multiskan FC酶標儀（美國Thermo公司）、DT5-2B離心機（北京時代北利離心機有限公司）、AWL-0501-B純化儀（美國艾科浦公司）、SRY-150生化培養(yǎng)箱（寧波賽福實驗儀器有限公司）、MCO-18AC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）和BDS200倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責任公司）。

1. 2 AFB1抗原抗體的制備及鑒定

1. 2. 1 AFB1抗原制備及鑒定 偶聯(lián)物制備：參考鄧娟（2016）、孫清（2017）的方法合成AFB1肟化物（AFB1·O），經(jīng)質(zhì)譜掃描鑒定正確。用碳化二亞胺法（DCC法）將AFB1·O與載體蛋白BSA、OVA和HRP分別進行偶聯(lián)，然后在pH 7.2的PBS中透析48 h，分裝保存于-20 ℃。

偶聯(lián)物鑒定：取偶聯(lián)產(chǎn)物AFB1-BSA、AFB1-OVA、AFB1-HRP和陰性對照BSA、OVA、HRP，與購買的AFB1-BSA抗原作為包被抗原包被于酶標板，同時包被PBS作空白對照，以購買的AFB1抗體作為一抗、HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗進行間接ELISA鑒定偶聯(lián)效果。

1. 2. 2 AFB1單克隆抗體制備 用免疫原皮下多點注射免疫Balb/C小鼠，用免疫前的小鼠血清作陰性對照，小鼠血清梯度稀釋，分別用間接競爭ELISA檢測效價和AFB1、AFB2、AFM1、AFM2、AFG1、AFG2標準品20 μg/kg對抗原抗體結(jié)合抑制的情況，挑選效價和抑制率高（劉偉偉等，2011）的小鼠，加強免疫后取小鼠脾細胞與SP2/0融合，挑選抑制率高的陽性細胞克隆至陽性單克隆率為100%，小鼠體內(nèi)誘生腹水，硫酸銨純化后-20 ℃分裝保存。

1. 2. 3 AFB1單克隆抗體效價及亞型鑒定 梯度稀釋包被抗原包被于酶標板，梯度稀釋抗體，采用間接法檢測抗體效價，選擇陽性孔OD值1.8～2.1的最高稀釋倍數(shù)為抗原抗體的效價;亞型的測定根據(jù)Sigma試劑盒說明書進行。

1. 3 競爭ELISA檢測方法建立

1. 3. 1 AFB1標準曲線建立 采用競爭ELISA棋盤方陣測定效價，選取OD450最接近2.0的抗原、抗體和酶標抗原稀釋倍數(shù)作為效價，將標準品濃度倍比稀釋進行競爭ELISA，以標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標、吸光度值的logit值為縱坐標，建立ELISA標準曲線，獲得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1. 3. 2 單克隆抗體的特異性測定 以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、OTA、ZEN、DON和BSA分別作為標準品，采用已建立的ELISA曲線進行檢測，分別計算半數(shù)抑制濃度（IC50），以AFB1的IC50為標準，各標準品IC50與標準品AFB1的IC50比值即為交叉反應(yīng)率，比值越大，交叉反應(yīng)率越高。

1. 3. 3 快速檢測方法的穩(wěn)定性測試 將上述包被好單克隆抗體的酶標板、HRP·AFB1酶標抗原工作液和不同濃度的標準品液體等，分別分裝置于4 ℃冰箱和37 ℃生化培養(yǎng)箱保存，保存前和保存后第1、3、5、7、10和15 d分別對比保存在不同溫度條件試劑盒的OD值和IC50變化，根據(jù)檢測結(jié)果推斷試劑盒儲存穩(wěn)定性。用不同批次制備的試劑盒分別做多個批次內(nèi)和批次間平行曲線，檢測其變異系數(shù)。

1. 3. 4 樣本中標準品的添加回收試驗與樣本實測 參照謝琿等（2015）、宋衛(wèi)得等（2016）的方法進行優(yōu)化。對木薯干片、木薯蔓越莓餅干、木薯粉條、木薯面條、木薯蛋糕、玉米和大豆等大塊樣本進行烘干粉碎，過80目篩。準確稱取樣本2 g，分別加入一定量的AFB1標準品溶液，使其濃度為0、0.5和2.0 μg/kg，再加入10 mL 60%～80%的甲醇水溶液（含0.2 g NaCl）作為提取液，封口后強力振蕩5 min，3500 r/min離心5 min后取上清液，用去離子水稀釋2～5倍，取50 μL進行檢測，并計算樣本的回收率。木薯蔓越莓餅干和木薯蛋糕等木薯食品樣本含油脂，在樣本中加70%甲醇水溶液作提取液，提取后取1.0 mL上清液，加入0.8 mL正己烷，封口后強力振蕩5 min，3500 r/min離心5 min后取下層上清液，用去離子水稀釋2～3倍，取50 μL進行檢測?；厥章剩?）=實測濃度/添加濃度×100，回收率越接近100%表明檢測結(jié)果越準確。同時將檢測結(jié)果與外購AFB1 ELISA試劑盒進行結(jié)果比對，判斷該方法的準確性。

1. 4 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Excel 2010分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 AFB1抗原鑒定結(jié)果

2. 1. 1 半抗原的鑒定 將AFB1肟化生成半抗原AFB1·O，AFB1的分子量為321，偶聯(lián)間隔臂羧甲基羥胺后，半抗原的分子量為385，半抗原作質(zhì)譜鑒定，正離子峰為386，結(jié)構(gòu)正確（圖1）。經(jīng)質(zhì)譜分析有AFB1·O單體峰存在，且AFB1特征峰消失，證明該物質(zhì)合成成功。

2. 1. 2 偶聯(lián)產(chǎn)物的ELISA鑒定 利用間接ELISA鑒定載體蛋白和半抗原的偶聯(lián)效果，購買的偶聯(lián)抗原（AFB1-BSA）和偶聯(lián)產(chǎn)物（AFB1-BSA、AFB1-OVA、AFB1-HRP）的OD450遠大于陰性對照（BSA、OVA、HRP）和空白對照（PBS）OD450的2.1倍，確定偶聯(lián)成功（圖2）。

2. 2 小鼠血清效價及抑制率的測定結(jié)果

5只小鼠血清檢測抑制率結(jié)果如表1所示，2#鼠和3#鼠的血清在20 μg/kg的抑制率均超過50.0%，且對其他黃曲霉類標準品交叉率也較其他小鼠高，故挑選對標準品抑制效果好的2#鼠和3#鼠進行細胞融合。

2. 3 單抗的效價及亞型測定結(jié)果

融合后的雜交瘤細胞經(jīng)克隆篩選，得到9株陽性單克隆細胞（表2），7株陽性單克隆細胞體外誘導(dǎo)法制備的腹水效價均達到106及以上，抗體亞型均為IgG1型。9株單克隆抗體對AFB1標準品的抑制率有所差別，細胞株3F2的抑制率最高（72.0%），故選擇細胞株3F2產(chǎn)生的抗體用以建立間接競爭ELISA方法。

2. 4 競爭ELISA標準曲線的建立

如圖3所示，建立的間接競爭ELISA和直接競爭ELISA均隨著反應(yīng)時間延長，IC50明顯降低，反應(yīng)時間同為30 min時，直接競爭ELISA法IC50為0.029 μg/kg，間接競爭ELISA法IC50為1.040 μg/kg。直接競爭法更靈敏，IC50更低，更穩(wěn)定，加樣方法也更簡單，故選取直接競爭ELISA方法體系進行后續(xù)試驗。以AFB1標準品濃度的對數(shù)值作橫坐標、吸光度值的logit值為縱坐標繪制標準曲線，當標準品AFB1濃度在0.02～0.48 μg/kg時有較好的線性關(guān)系，得到標準方程y=-3.074x-4.3066（R2=0.9978），靈敏度為0.02 μg/kg，IC50為0.047 μg/kg。

2. 5 單克隆抗體特異性測定結(jié)果

將不同種類標準品帶入建立的ELISA中檢測，結(jié)果（表3）顯示，該單克隆抗體對AFB1抑制效果最好，其次是AFG1、AFB2和AFG2，對AFM1、AFM2、OTA、ZEN、DON和BSA的交叉反應(yīng)率均小于1.0%，說明制備的AFB1單克隆抗體的特異性良好。

2. 6 檢測方法的穩(wěn)定性測試結(jié)果

對比4和37 ℃保存不同時間條件的穩(wěn)定性，經(jīng)ELISA檢測，試劑盒空白OD值（B0）在37 ℃生化培養(yǎng)箱中保存7 d后下降了0.411，10 d下降0.587，15 d下降0.560，但IC50未見明顯變化。試劑盒在37 ℃生化培養(yǎng)箱保存10和15 d OD值下降不明顯，說明試劑盒在下降到一定程度后較穩(wěn)定。按照37 ℃保存1 d相當于4 ℃保存一個半月的模型計算，在37 ℃保存7 d穩(wěn)定的試劑盒，理論上在4 ℃可以保存10個月左右，保存15 d后IC50變化不大，只是OD值下降，不影響試劑盒的使用。經(jīng)檢測，批內(nèi)差異和批間差異均小于8.5%，說明該檢測產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。

2. 7 標準品AFB1的添加回收率

2. 7. 1 樣本提取方法的確定 60%甲醇水溶液提取后直接檢測回收率為64%，70%和80%甲醇水溶液提取后直接檢測ELISA不顯色，可能是過高的甲醇會影響抗原抗體結(jié)合所致?；厥章孰S著甲醇溶液濃度升高而降低，80%甲醇水溶液的回收率最低;添加的NaCl越多，回收率越高，但本底和假陽性也越高;相同的提取方法，回收率隨著檢測前稀釋倍數(shù)增大而升高。為避免假陽性率，對比在60%和70%甲醇水溶液中加入不同NaCl和標準品的量，分別進行10倍、15倍和25倍稀釋。如圖4所示，添加0.2 g NaCl時，回收率也可達100%左右，回收率隨樣本稀釋倍數(shù)增大而升高，添加0.5 μg/kg的回收率高于2.0 μg/kg，且70%甲醇水溶液提取的樣本0.5和2.0 μg/kg回收率差異更小，故優(yōu)選70%甲醇水溶液作為樣本提取液。

2. 7. 2 不同濃度甲醇水溶液作為標準品稀釋液對樣本回收率的影響 樣品不同稀釋倍數(shù)和不同濃度甲醇水溶液作為標準品稀釋液對樣本添加回收率的影響如圖5所示，樣本10倍稀釋、35%甲醇作為標準品稀釋液的回收率和樣本15倍稀釋、30%甲醇作為標準品稀釋液的回收率更接近100%，添加0.3 g NaCl也得出同樣的結(jié)果。為減少稀釋帶來的誤差，選擇樣本10倍稀釋、35%甲醇水溶液作為標準品稀釋液。

2. 7. 3 不同類型木薯樣本的回收率 不同類型木薯食品原料樣本10倍和15倍稀釋后添加回收率如圖6所示，所有樣本10倍稀釋回收率在81.5%～120.0%，添加0.5 μg/kg的回收率均高于2.0 μg/kg，15倍稀釋的回收率均高于10倍稀釋，且部分回收率高于120.0%，容易造成假陽性，故選用70%甲醇水溶液加0.2 g NaCl提取，封口強力振蕩5 min，3500 r/min離心5 min取上清液，再用去離子水2倍稀釋后檢測，作為木薯食品原料的樣本處理方法。該方法樣本檢測限范圍為0.2～4.8 μg/kg。

木薯蔓越莓餅干和木薯蛋糕等含油脂木薯糕點食品對比10倍和15倍稀釋后檢測，添加回收率如圖7所示，加大稀釋倍數(shù)和提取過程中加NaCl均可使回收率升高，不加NaCl提取的樣本10倍稀釋后樣本回收率為90.8%～103.1%，選用70%甲醇水溶液提取后取上清液1.0 mL，加入0.8 mL正己烷，振蕩離心后取下層上清液2倍稀釋后檢測，作為含油脂的木薯糕點食品樣本處理方法。該方法樣本檢測限范圍為0.2～4.8 μg/kg。

2. 8 樣本實測結(jié)果

用自建ELISA試劑盒和外購的試劑盒對96份待檢樣本進行初篩檢測，其中包括72份木薯粉及其制品樣本、15份玉米樣本和9份大豆樣本，結(jié)果（表5）顯示，自建ELISA試劑盒共檢出19份陽性樣本，外購ELISA試劑盒檢出7份陽性樣本。

檢測的72份木薯粉及其制品樣本中，自建方法共篩出8份污染樣品，外購試劑盒未篩出陽性樣本。所檢測的36份木薯粉樣本中，4份樣本含有AFB1但未超標，含量在0.32～0.75 μg/kg;其中17份木薯粉樣本敞口置于室溫條件下長達20個月，檢測結(jié)果和密封保存結(jié)果一致。木薯淀粉、木薯全粉、木薯干片、木薯粉條和木薯面條中未檢出AFB1，部分存放最久的木薯粉和木薯干片長達5年仍未檢出AFB1。檢測的21份木薯糕點樣品中17份樣本已室溫存放1年，僅有4份樣本檢出含有AFB1，含量在0.41～0.54 μg/kg。

對15份玉米樣本進行檢測的結(jié)果顯示，自建ELISA試劑盒共檢出6份陽性樣本，其中超過2.0 μg/kg的有3份;外購ELISA試劑盒檢出3份陽性樣本。自建ELISA試劑盒對9份大豆樣本檢出陽性樣本為5份，其中超過2.0 μg/kg的有4份;外購ELISA試劑盒檢出4份大豆陽性樣本。

自建試劑盒檢測區(qū)間為0.2～4.8 μg/kg，外購試劑盒檢測區(qū)間為2～50 μg/kg，所有已檢測出的木薯粉及其制品陽性樣本含量已低于外購試劑盒的檢測范圍，玉米和大豆樣本中大于2.0 μg/kg的樣本檢測結(jié)果完全符合，因此，本研究建立的檢測方法靈敏度優(yōu)于外購試劑盒。

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》中評價方法進行一致性分析，結(jié)果表明，卡方值為10.08，大于3.84，表示自建方法與外購試劑盒的陽性確認比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異;所有樣本假陰性率均為0，假陽性率為13.5%，相對準確度為87.5%。

3 討論

AFB1屬于小分子化合物，需偶聯(lián)大分子蛋白載體后才具有免疫原性（楊利國等，1998;章飚等，2018）。本研究選取BSA作為免疫原的載體蛋白，OVA作為包被原的載體蛋白，這2種蛋白理化性質(zhì)穩(wěn)定，物美價廉。在AFB1全抗原偶聯(lián)鑒定方面，許多文獻均采用紫外掃描，強調(diào)偶聯(lián)比（陳宇熹等，2017;潘明飛等，2019），本研究利用現(xiàn)成的抗原抗體來驗證是否已偶聯(lián)成功是最直觀和最廉價的評價方式，且可操作性強，對后期抗體的驗證也可提供參考。

抗原抗體結(jié)合受反應(yīng)時間、溫度、pH和緩沖液成分等影響（楊利國等，1998）。試驗用相同的抗原抗體，不同反應(yīng)條件下，靈敏度和IC50差異較大，與反應(yīng)時間和加樣模式有關(guān)，且相同條件下，反應(yīng)時間越短，抗原抗體效價越低，所需抗原抗體用量越大。本研究中雖然直接競爭法和間接競爭法2種反應(yīng)模式的反應(yīng)時間同為30 min，但檢測數(shù)據(jù)差距較大，直接競爭ELISA法IC50為0.029 μg/kg，間接競爭ELISA法IC50為1.040 μg/kg。同樣是直接競爭法，反應(yīng)時間越長，抗原抗體越能充分結(jié)合，但當抗原抗體結(jié)合和解離反應(yīng)達到一個新的平衡后差異減小，結(jié)果趨于平穩(wěn)。

檢測AFB1等小分子物質(zhì)均采用直接競爭ELISA或間接競爭ELISA（詹屋強和王弘，2015）。本研究采用包被固定單克隆抗體，樣本中AFB1和HRP-AFB1酶標抗原均處于游離狀態(tài)，使其均在相同條件下競爭結(jié)合酶標板上的抗體形成復(fù)合物，更具有公平競爭性。本研究采用直接競爭ELISA法，與間接競爭ELISA法相比，加樣更簡單，從方法上減少操作誤差，準確性更高（余厚美等，2017）。

不同樣本類型、稀釋倍數(shù)和標準品添加濃度等因素均對回收率有明顯影響，可能與樣本基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)（秦珊珊，2015）。許嬌嬌等（2017）用直接稀釋—超高液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定谷物及制品中真菌毒素時發(fā)現(xiàn)大部分真菌毒素有基質(zhì)抑制或增強效應(yīng);符金華等（2019）在25種飼料及飼料原料中對16種真菌毒素的添加研究表明絕大多數(shù)真菌毒素在不同樣本中均有基質(zhì)效應(yīng)，AFB1在所有類型的樣本中均有基質(zhì)抑制效應(yīng)。范葉等（2019）在檢測蔬菜農(nóng)藥殘留過程中用相同儀器能減小基質(zhì)效應(yīng)，用與本底一致的基質(zhì)標準溶液校正樣品可有效消除基質(zhì)效應(yīng)。秦珊珊（2015）在采用HPLC-MS/MS檢測食用菌中80種農(nóng)藥殘留分析中發(fā)現(xiàn)稀釋法能消除大多數(shù)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)。凈化和稀釋是常用的去基質(zhì)效應(yīng)方法，但凈化需萃取、層析等步驟，成本高，操作復(fù)雜，本研究在靈敏度和檢測限允許的前提下，適當稀釋樣本，去除基質(zhì)效應(yīng)，是低成本、易操作的一種去除基質(zhì)效應(yīng)的處理方式。評價方法分析中得出該方法有13.5%假陽性，全部樣本無假陰性，是因為自建方法靈敏度高于參比方法所致。在各自檢測限范圍內(nèi)檢測結(jié)果一致，因靈敏度更高，本研究建立的檢測方法實際檢測樣本更精確。

本研究中，部分木薯粉樣品在室溫下放置20個月仍未檢測出AFB1陽性，所有樣本中只有少數(shù)樣本檢測出低陽性，可能與新鮮木薯天然抗黃曲霉毒素污染有關(guān)，但在經(jīng)過烘干、烘焙加工等處理后會喪失這種特性（Adjovi et al.，2014）;也有可能是木薯粉和木薯干片在儲藏過程中受外界環(huán)境影響小;還有可能是木薯粉加工原材料——木薯肉表面原本無菌，在加工過程中感染的概率小。為了保證食用安全性，減少木薯粉中生氰糖苷含量，木薯粉是木薯去除外皮和周皮后加工生產(chǎn)（張振文和李開綿，2019），加工前無黃曲霉菌等產(chǎn)毒菌株污染，所以相對其他農(nóng)作物如玉米、大豆（劉鳳芝等，2017）、花生（張杏等，2019）等在生長過程中受污染，其感染概率低。比較檢測出弱陽性對應(yīng)的木薯粉外觀，所有檢出陽性的樣本顏色均呈褐色，有污染的樣本肉眼可辨。木薯食品中檢測出陽性率稍高可能是加工過程中添加了雞蛋、黃油等高蛋白的原因，有部分有霉變現(xiàn)象但未檢測出AFB1陽性，可能是有霉菌污染未產(chǎn)生毒素，或是其他類型的毒素污染（許嬌嬌等，2017;王國強等，2019）。本研究結(jié)果表明，只要儲藏得當，木薯粉及其制品在一定時期內(nèi)受AFB1污染較少。此外，采用本研究建立的方法對玉米、大豆和花生等樣品進行檢測，結(jié)果和外購試劑盒檢測結(jié)果基本一致，說明本方法也同樣適用于其他糧食樣本的檢測。

4 結(jié)論

本研究成功制備了AFB1抗原和單克隆抗體，并建立直接競爭ELISA法，該方法既能檢測木薯粉及其制品樣本中的AFB1，也能檢測其他糧食樣本中的AFB1。該方法具有靈敏度高、操作簡單、快速、準確、可批量檢測樣本等特點，易于被企業(yè)和基層檢測人員掌握和應(yīng)用，可為木薯食品中AFB1污染篩查提供快速檢測技術(shù)。

參考文獻：

蔡雪，周川，楊淑芬，李夢瑤，黃多. 2019. 大米中黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫法與液相色譜—柱后衍生法的比對探討[J]. 現(xiàn)代食品，（11）：186-188. [Cai X，Zhou C，Yang S F，Li M Y，Huang D. 2019. Comparison of aflatoxin B1 ELISA and liquid chromatography-post-column derivatization in rice[J]. Modern Food，（11）：186-188.] doi：10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2019.11.058.

陳宇熹，方振霞，雷美玲，吳藝嵐，張月珠，牛蓉，葉舟. 2017. 黃曲霉毒素B1人工抗原的制備、鑒定與免疫特性研究[J]. 武夷科學(xué)，33（1）：80-87. [Chen Y X，F(xiàn)ang Z X，Lei M L，Wu Y L，Zhang Y Z，Niu R，Ye Z. 2017. Preparation and identification and immunological properties of aflatoxin B1 artificial antigen[J]. Wuyi Science Journal，33（1）：80-87.] doi：10.15914/j.cnki.wykx.2017.33.12.

鄧娟. 2016. 黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測方法研究[D]. 天津：天津科技大學(xué). [Deng J. 2016. Development of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of aflatoxin B1[D]. Tianjin：Tianjin University of Science and Technology.]

范葉，易澤夫，王壯波. 2019. 蔬菜農(nóng)藥殘留檢測中基質(zhì)效應(yīng)影響因素分析[J]. 蔬菜，（2）：60-64. [Fan Y，Yi Z F，Wang Z B. 2019. Analysis of influencing factors of matrix effect in vegetable pesticide residues detection[J]. Vegetables，（2）：60-64.]

符金華，楊琳芬，董澤民，徐國茂，姜文娟，葉金，吳宇，邢磊，劉國花，樊晶，周仁丹，廖豐. 2019. 飼料和飼料原料等25種樣品中16種真菌毒素超高效液相色譜—三重四級桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法基質(zhì)效應(yīng)的研究[J]. 中國飼料，（21）：66-71. [Fu J H，Yang L F，Dong Z M，Xu G M，Jiang W J，Ye J，Wu Y，Xing L，Liu G H，F(xiàn)an J，Zhou R D，Liao F. 2019. The matrix effect research of determination of 16 mycotoxins by UPLC-Quadrupole/Qtrap mass spectrometry in 25 kinds of feed and feedstuff samples[J]. Chinese Feed，（21）：66-71.] doi：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20192114.

韓和悅. 2017. 11個食用木薯品種的品質(zhì)研究與評價[D]. 廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院. [Han H Y. 2017. Research and evaluation of 11 edible cassava breed quality[D]. Guangzhou：Zhongkai University of Agriculture and Enginee-ring.]

胡廣，梁大成. 2019. 木薯NOX基因家族成員的生物信息學(xué)及其表達分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，50（10）：2178-2187. [Hu G，Liang D C. 2019. Bioinformatics of cassava NOX gene family and its expression analysis[J]. Journal of Southern Agriculture，50（10）：2178-2187.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.10.06.

蔣佳伊，張磊，秦露，駱驕陽，付延偉，秦家安，王長健，歐陽臻，楊美華. 2020. 高靈敏度黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備及其在中藥材酸棗仁污染快速檢測中的應(yīng)用[J]. 中國中藥雜志，45（16）：3900-3907. [Jiang J Y，Zhang L，Qin L，Luo J Y，F(xiàn)u Y W，Qin J A，Wang C J，Ouyang Z，Yang M H. 2020. Preparation of highly sensitive monoclone antibody against aflatoxin B1 and its application in rapid detection of contamination in Ziziphin spinosae Semen[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，45 （16）：3900-3907.] doi：10.19540/j.cnki.cjcmm.2020.0522. 201.

李丹陽，李立煌，艾超超，任磊. 2020. 上轉(zhuǎn)換熒光—適配體免疫層析試紙條的構(gòu)建及其在黃曲霉毒素B1檢測上的應(yīng)用[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），59（2）：238-245. [Li D Y，Li L H，Ai C C，Ren L. 2020. Construction of immunochromatographic strip based on upconversion fluorescence-aptamer and its application for detection of aflatoxin B1[J]. Journal of Xiamen University（Natural Scien-ce），59（2）：238-245.] doi：10.6043/j.issn.0438-0479. 201906026.

李少暉，任丹丹，謝云峰，劉佳，楊永壇. 2015. 食品中黃曲霉毒素檢測方法研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，6（4）：1107-1115. [Li S H，Ren D D，Xie Y F，Liu J，Yang Y T. 2015. Research progress on determination methods of aflatoxins in foodstuffs[J]. Journal of Food Safety and Quality，6（4）：1107-1115.] doi：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2015.04.002.

劉鳳芝，李鋒，王永麗. 2017. 2017年上半年我國部分地區(qū)飼料及飼料原料中霉菌毒素的污染狀況分析[J]. 糧食與飼料工業(yè)，（11）：46-50. [Liu F Z，Li F，Wang Y L. 2017. Investigation of mycotoxins contamination in feeds and feed ingredients in the first half of 2017 in some parts of China[J]. Cereal & Feed Industry，（11）：46-50.]

劉偉偉，孫秀蘭，張銀志，樊惠良，陳文君，李在均. 2011. 超順磁性免疫磁珠體系用于植物油中黃曲霉毒素B1的檢測研究[J]. 分析測試學(xué)報，30（12）：1345-1350. [Liu W W，Sun X L，Zhang Y Z，F(xiàn)an H L，Chen W J，Li Z J. 2011. Research of the super paramagnetic immune magnetic beads system for detection aflatoxin B1 vegetable oil[J]. Journal of Instrumental Analysis，30（12）：1345-1350.] doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2011.12.003.

潘明飛，李詩潔，郭丹丹，王俊平，王碩. 2019. 間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法檢測花生中黃曲霉毒素B1[J]. 中國食品學(xué)報，19（9）：255-261. [Pan M F，Li S J，Guo D D，Wang J P，Wang S. 2019. Determination of aflatoxin B1 in peanut by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，19（9）：255-261.] doi：10.16429/j.1009-7848. 2019.09.030.

秦姍姍. 2015. 農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留分析方法研究及基質(zhì)效應(yīng)探討[D]. 鄭州：鄭州大學(xué). [Qin S S. 2015. Studies on determination of pesticides residues and matrix effects in agricultural products[D]. Zhengzhou：Zhengzhou University.]

任宏彬，賈曉婷，楊曉偉，楊蒲晨，張志華，郭素平. 2019. 高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1的含量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，10（19）：6438-6442. [Ren H B，Jia X T，Yang X W，Yang P C，Zhang Z H，Guo S P. 2019. Rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Food Safety and Quality，10（19）：6438-6442.] doi：10. 19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2019.19.005.

宋衛(wèi)得，厲雪芹，高堯華，劉培海，劉冰，盧志曉，孫燦. 2016. 高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度評定[J]. 釀酒科技，（4）：93-95. [Song W D，Li X Q，Gao Y H，Liu P H，Liu B，Lu Z X，Sun C. 2016. Evaluation of the uncertainties in the determination of aflatoxins B1 in dry cassava by HPLC[J]. Liquor-Making Science & Technology，（4）：93-95.] doi：10.13746/j.njkj.2015 415.

孫清. 2017. 食品及飼料中黃曲霉毒素的快速免疫檢測試劑盒研究[D]. 北京：北京科技大學(xué). [Sun Q. 2017. Study on rapid immunoassay test kits for aflatoxins in food and feed[D]. Beijing： University of Science and Technology Beijing.]

王春燕，蔣曉青，周泊. 2019. 基于Cu-TPA的電化學(xué)生物傳感器對黃曲霉毒素B1的檢測[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，40（11）：2301-2307. [Wang C Y，Jiang X Q，Zhou B. 2019. An electrochemical biosensor based on Cu-TPA for determination of aflatoxin B1[J]. Chemical Journal of Chinese Universities，40（11）：2301-2307.] doi：10.7503/cjcu2019 0233.

王督，張文，李培武，張奇，張兆威，丁小霞，姜俊. 2014. 膠體金免疫層析法快速定量分析糧油農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1[J]. 中國油料作物學(xué)報，36（4）：529-532. [Wang D，Zhang W，Li P W，Zhang Q，Zhang Z W，Ding X X，Jiang J. 2014. Rapid and quantitative of aflatoxin B1 in plant grain and oilseeds products using colloid golden immuno-chromatogrephic method[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，36（4）：529-532] doi：10.7505/j.issn. 1007-9084.2014.04.016.

王國強，劉耀東，段勝和. 2019. 2019年上半年飼料及飼料原料霉菌毒素污染及調(diào)查報告[J]. 養(yǎng)豬，（6）：17-20. [Wang G Q，Liu Y D，Duan S H. 2019. Mycotoxin contamination and investigation report of feed and feed ingredients in the first half of 2019[J]. Swine Production，（6）：17-20.] doi：10.13257/j.cnki.21-1104/s.2019.06.008.

謝琿，章先，王歆，凡鵬程，時玉菲，方維煥. 2015. 黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備及間接競爭ELISA檢測技術(shù)研究[J]. 微生物學(xué)通報，42（10）：2033-2040. [Xie H，Zhang X，Wang X，F(xiàn)an P C，Shi Y F，F(xiàn)ang W H. 2015. Preparation of anti-aflatoxin B1 monoclonal antibodies and its use in an indirect competitive ELISA for aflatoxin B1[J]. Microbiology China，42（10）：2033-2040.] doi：10.13344/j.microbiol.china.141030.

謝潔. 2017. 基于黃曲霉毒素廣譜性抗體的高效分離凈化樣品前處理技術(shù)研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué). [Xie J. 2017. Study of high effective separation and purification of sample pretreatment techniques based on aflatoxins broad-spectrum antibody[D]. Beijing：China Agricultural University.]

許嬌嬌，黃百芬，周健，項瑜芝，任一平，蔡增軒. 2017. 直接稀釋—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定谷物及其制品中16種真菌毒素[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志，29（6）：708-715. [Xu J J，Huang B F，Zhou J，Xiang Y Z，Ren Y P，Cai Z X. 2017. A dilute-and shoot approach using ultra high-performance liquid chromatograph-mass/mass spectrometry for 16 mvcotoxins analysis in cereals and products[J]. Chinese Journal of Food Hygiene，29（6）：708-715.] doi：10.13590/ j.cjfh.2017.06.015.

楊利國，胡少昶，魏平華，郭愛珍. 1998. 酶免疫測定技術(shù)[M]. 南京：南京大學(xué)出版社：323-339. [Yang L G，Hu S C，Wei P H，Guo A Z. 1998. Enzyme immunoassay technology[M]. Nanjing：Nanjing University Press：323-339.]

余厚美，安飛飛，羅秀芹，陳松筆，歐文軍. 2017. 淀粉磷酸化酶原核表達及單克隆抗體的制備[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，33（14）：28-32. [Yu H M，An F F，Luo X Q，Chen S B，Ou W J. 2017. Starch phosphorylase prokaryotic expression and preparation of monoclonal antibodies[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，33（14）：28-32.]

詹屋強，王弘. 2015. 小分子物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析方法的研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，6（3）：857-862. [Zhan W Q，Wang H. 2015. Research progress on enzyme-linked immunoassay for small molecules substances[J]. Journal of Food Safety and Quality，6（3）：857-862.] doi：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2015.03.023.

張敏，張先舟，李聰，高浩，劉健慧，田益玲，馬雯，李英軍，檀建新. 2020. 黃曲霉毒素B1核酸適配體篩選和檢測方法的建立[J]. 食品科學(xué)，41（24）：295-303. [Zhang M，Zhang X Z，Li C，Gao H，Liu J H，Tian Y L，Ma W，Li Y J，Tan J X. 2020. Screening of aptamers for aflatoxin B1 and establishment of a method for aflatoxin B1 detection[J]. Food Science，41（24）：295-303.] doi：10.7506/spkx1002-6630-20190628-369.

張杏，岳曉鳳，丁小霞，李培武，余秋玉，謝華里，張奇，張兆威，張文. 2019. 中國西南花生產(chǎn)區(qū)黃曲霉菌分布、產(chǎn)毒力及花生黃曲霉毒素污染[J]. 中國油料作物學(xué)報，41（5）：773-780. [Zhang X，Yue X F，Ding X X，Li P W，Yu Q Y，Xie H L，Zhang Q，Zhang Z W，Zhang W. 2019. Distribution and aflatoxin contamination by Aspergillus flavus in peanut from the southwest China[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，41（5）：773-780.] doi：10.19802/j.issn.1007-9084.2018242.

張振文，李開綿. 2019. 木薯及其食品加工技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社. [Zhang Z W，Li K M. 2019. Cassava and its food processing technology[M]. Beijing：China Agriculture Press.]

章飚，李彥川，高雯，李細芬，張?zhí)m蘭，李萍. 2018. 中藥小分子單克隆抗體制備技術(shù)研究進展[J]. 中草藥，49（10）：2469-2476. [Zhang B，Li Y C，Gao W，Li X F，Zhang L L，Li P. 2018. Research progress on preparation of small molecular monoclonal antibodies in Chinese materia me-dics[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，49（10）：2469-2476.] doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2018.10.032.

趙浩軍，王坤，楊衛(wèi)花，楊朝義. 2013. 高效液相色譜柱后光化學(xué)反應(yīng)—熒光檢測茶葉中黃曲霉毒素B1[J].茶葉科學(xué)，33（3）：237-241. [Zhao H J，Wang K，Yang W H，Yang C Y. 2013. Determination of aflatoxins B1 in tea by high performance liquid chromatography-fluorescence detector with post-column photochemical reaction[J]. Journal of Tea Science，33（3）：237-241.] doi：10.13305/j.cnki.jts. 2013.03.001.

朱艷梅，羅興錄，樊吳靜. 2016. 木薯內(nèi)源細胞分裂素含量對塊根淀粉積累的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，47（8）：1279-1284. [Zhu Y M，Luo X L，F(xiàn)an W J. 2016. Effects of endogenous cytokinin content on starch accumulation in root tuber of cassava[J]. Journal of Southern Agriculture，47（8）：1279-1284.] doi：10.3969/j：issn.2095-1191. 2016.08.1279.

Adegoke G O，Akinnuoye O F A，Akanni A O. 1993. Effect of processing on the mycoflora and aflatoxin B1 level of a cassava-based product[J]. Plant Foods for Human Nutrition，43（3）：191-196. doi：10.1007/BF01886219.

Adegoke G O，Babalola A K，Akanni A O. 1991. Effects of sodium rnetabisulphite，hydrogen peroxide and heat on aflatoxin B1 in lafun and gari-two cassava products[J]. Die Nahrung，35（10）：1041-1045.

Adjovi Y C S，Bailly S，Gnonlonfin B J G，Tadrist S，Querin A，Sanni A，Oswald I P，Puel O，Bailly J D. 2014. Analysis of the contrast between natural occurrence of toxigenic Aspergilli of the Flavi section and aflatoxin B1 in cassava[J]. Food Microbiology，38：151-159. doi：10.1016/j.fm. 2013.08.005.

Ediage E N，di Mavungu J D，Monbaliu S，van Peteghem C，de Saeger S. 2011. A validated multianalyte LC-MS/MS method for quantification of 25 mycotoxins in cassava flour，peanut cake and maize samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，59（10）：5173-5180. doi：10. 1021/jf2009364.

Ediage E N，Hell K，de Saeger S. 2014. A comprehensive study to explore differences in mycotoxin patterns from agro-ecological regions through maize，peanut，and cassava products：A case study，Cameroon[J]. Journal of agricultural and food chemistry，62（20）：4789-4797. doi：10. 1021/jf501710u.

Satyanarayana T，Deshmukh S K，Deshpande M. 2019. Advancing frontiers in mycology & mycotechnology：Basic and applied aspects[M]. Singapore：Springer：377-404. doi：10.1007/978-981-13-9349-5.

（責任編輯 羅 麗）