邱炳發(fā) 梁馨元 王建忠 白天道 蔣維昕

摘要：【目的】分析大花序桉基因組SSR的分布特征及序列分析，為大規(guī)模開發(fā)大花序桉分子標(biāo)記輔助育種的SSR標(biāo)記提供理論依據(jù)。【方法】通過高通量測(cè)序獲得大花序桉基因組序列信息，經(jīng)嚴(yán)格過濾、拼接和組裝后獲得scaffolds，利用MISA網(wǎng)站對(duì)Scaffolds進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢索及分析，并利用Primer 5.0對(duì)具有較大多態(tài)性開發(fā)潛力（二基元重復(fù)次數(shù)≥10、三基元重復(fù)次數(shù)≥7）的SSR標(biāo)記進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，隨機(jī)挑選48對(duì)基因組SSR引物進(jìn)行有效性檢測(cè)及有效擴(kuò)增引物篩選?！窘Y(jié)果】大花序桉基因組共含有177750個(gè)SSR位點(diǎn)，包括171530個(gè)SSR獨(dú)立位點(diǎn)和6220個(gè)復(fù)合型SSR位點(diǎn);SSR發(fā)生頻率為17.86%，分布密度為1/3.13 kb。大花序桉基因組SSR基元類型較豐富，以單核苷酸重復(fù)基元類型數(shù)量最多，占基因組總SSR數(shù)量的69.33%，其次為二、三核苷酸重復(fù)基元類型，分別占基因組SSR數(shù)量的21.01%和7.58%，四、五、六核苷酸的重復(fù)基元類型所占比例均相對(duì)較低，三者的比例含量總和為2.08%。SSR基元類型以AG/CT占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（16812個(gè)），其次為AT/AT（8193個(gè)）和AAG/CTT（4404個(gè)）。從48對(duì)SSR標(biāo)記引物中篩選出31對(duì)引物能有效擴(kuò)增出清晰、明亮條帶且大小與預(yù)期相符，其中有14對(duì)在6個(gè)大花序桉樣本中均呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)百分率為29.17%。【結(jié)論】大花序桉基因組SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率高，基元類型較豐富，SSR多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)潛力大。該研究結(jié)果為進(jìn)一步大花序桉SSR引物開發(fā)和篩選，以及開展大花序桉及其他桉樹遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大花序桉;基因組;SSR;重復(fù)基元;多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S792.39;S718.46? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）10-2744-07

Abstract：【Objective】 The distribution patterns and sequence characterstics of simple sequence repeat （SSR） in Eucalyptus cloeziana genome were analyzed in order to lay the foundation for developing SSR markers in molecular marker-assisted breeding of E. cloeziana. 【Method】 The genome sequence information of E. cloeziana was obtained based on high-throughput sequencing. Scaffold sequences were identified after rigorous filtration， splicing and assembly. The SSR loci from Scaffolds were searched and analyzed by using MicroSAtellite （MISA）. Primer 5.0 software was used to design the SSR sequences with high potential for polymorphism development （the repetitions of dinucleotide ≥10， the repetitions of trinucleotides ≥7）. Forty-eight genomic SSR primer pairs were randomly selected for validity detection and screening of primers successfully amplicated. 【Result】 The genome of E. cloeziana contained 177750 SSR loci， including 171530 single SSRs and 6220 compound-loci SSRs. The SSR occurrence frequency was 17.86% and the distribution density was 1/3.13 kb. There were abundant SSR motifs in E. cloeziana genome， and among them， the mononucleotide repeats were the most abundant types， accounting for 69.33% of the total genomic SSRs， followed by dinucleotide and trinucleotide repeats， accounting for 21.01% and 7.58%， respectively. The proportions of tetra-， penta- and hexa-nucleotide repeats were relatively low， and the total proportion of the three nucleotides was 2.08%. For the SSR motifs， AG/CT were the dominant primitive types （16812），followed by AT/AT （8193）， AAG/CTT （4404）. A total of 48 SSR marker pairs were randomly selected for initial screening test. Thirty-one primers pairs could effectively amplify clear and bright bands matching the expected size， and 14 of them showed polymorphism across six samples of E. cloeziana. The percentage of polymorphic loci was 29.17%. 【Conclusion】 The SSR loci in the genome of E. cloeziana occur in high frequency and abundant motifs， and exhibit great potential for developing polymorphic SSR markers. Therefore， the results provide a basis for further SSR development and screening，genetic diversity analysis and genetic mapping of E. cloeziana and other Eucalyptus trees.

Key words：Eucalyptus cloeziana; genome; SSR; repeat motif; polymorphism

Foundation item： Key Research and Development Project of Guangxi（2018AB44025）; Guangxi Forestry Science and Technology Project （Guilinkezi 〔2016〕 2）;Science Research Foundation of Guangxi University （20180493）

0 引言

【研究意義】大花序桉（Eucalyptus cloeziana F. Muell）為桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）昆士蘭桉亞屬的大型喬木，天然分布于海拔25～ 950 m的澳大利亞昆士蘭州中和北部區(qū)域（144°44′～152°52′E，15°45′～26°41′S）（祁述雄，2002）。該樹種材干通直、木材硬度高、尖削度低，自然整枝良好，木材的花紋美觀，紋理和結(jié)構(gòu)均勻，耐久性沉重，鋸材性能優(yōu)良，是一種用于制作高檔實(shí)木家具的優(yōu)良材料，且在輪伐期具有較強(qiáng)的木材生長(zhǎng)潛力和材質(zhì)特性，成熟階段材積生長(zhǎng)顯著（祁述雄，2002;李昌榮等，2012），其經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于短輪伐期的普通桉樹，目前已被納入我國(guó)珍貴用材樹種之一（黃振等，2018）。利用高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)獲得大花序桉全基因組數(shù)據(jù)，挖掘其SSR位點(diǎn)，分析其分布特征，并開發(fā)SSR引物，對(duì)大花序桉遺傳結(jié)構(gòu)分析、指紋圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選育等均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】合理選擇遺傳標(biāo)記是群體遺傳學(xué)及分子標(biāo)記輔助育種研究的重要保證。SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，具有擴(kuò)增穩(wěn)定、數(shù)量豐富、多態(tài)性高及特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于桉樹遺傳多樣性評(píng)價(jià)、無(wú)性系指紋圖譜構(gòu)建、遺傳作圖、物種鑒定、親本指派及QTLs定位等研究（Kirst et al.，2005;Shepherd and Raymond，2010;Subashini et al.，2014;Lv et al.，2020）?；诨蚪M開發(fā)的SSR（gSSR）標(biāo)記相對(duì)轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR（EST-SSR）具有較高的多態(tài)性（Liu et al.，2018）。gSSR為中性標(biāo)記，與任何特定的性狀均無(wú)關(guān)聯(lián)，但最能反映出一個(gè)野生種群所潛在的全部遺傳多樣性（Zonneveld et al.，2012）。不同桉樹基因組中SSR分布特征有所不同，對(duì)NCBI、FORESTS等公共數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)藍(lán)桉（E. globulus）、尾葉桉（E. urophylla）和巨桉（E. grandis）等重要桉樹的基因組或轉(zhuǎn)錄組SSR序列分析結(jié)果表明，桉樹SSR發(fā)生頻率通常為12.3%～25.5%，以AG/TC和CCG/GGC分別為二、三基元重復(fù)優(yōu)勢(shì)類型（Ceresini et al.，2005; Yasodha et al.，2008;Sumathi and Yasodha，2014;Liu et al.，2018）;而在蘋果桉（E. gunnii）（Rengel et al.，2009）和赤桉（E. camaldulensis）（Hirakawa et al.，2011）的基因組SSR三基元類型中，則以AAG/CTT最為豐富。部分學(xué)者也利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)開發(fā)出大量桉樹SSR標(biāo)記，但這些SSR標(biāo)記在大花序桉中表現(xiàn)出較低的通用率（Nevill et al.，2008; Zhou et al.，2014）。近年來(lái)，研究人員基于巨桉、赤桉、尾葉桉等重要近源桉樹開發(fā)的SSR標(biāo)記開展了大花序桉遺傳變異的研究（鄧紫宇等，2019;Lv et al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)已有的桉屬樹種系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，大花序桉與同屬其他桉樹存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，為獨(dú)立的亞屬分支（Steane et al.，2011），因而針對(duì)該樹種的基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR標(biāo)記研究將有助于進(jìn)一步探究其分子遺傳學(xué)特性。但迄今為止，鮮見大花序桉SSR分布特征及標(biāo)記開發(fā)的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過高通量測(cè)序獲得大花序桉基因組序列信息，經(jīng)嚴(yán)格過濾、拼接和組裝后獲得scaffolds，利用MISA網(wǎng)站對(duì)Scaffolds進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢索及分析，并利用Primer 5.0對(duì)具有較大多態(tài)性開發(fā)潛力（二基元重復(fù)次數(shù)≥10、三基元重復(fù)次數(shù)≥7）的SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，隨機(jī)挑選48對(duì)基因組SSR引物進(jìn)行有效性檢測(cè)及有效擴(kuò)增引物篩選，以期開發(fā)大花序桉SSR標(biāo)記，為大花序桉種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性及分子標(biāo)記輔助育種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

高通量測(cè)序所用材料為2年生大花序桉頂芽，采集自廣西崇左市扶綏縣國(guó)有東門林場(chǎng)大花序桉種源試驗(yàn)林基地（107°14′108.00″E，22°17′22.30″N）。樣品采集后迅速投入液氮速凍保存，由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提取其基因組DNA并建庫(kù)，通過Illumina HiSeq X Ten高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。后續(xù)SSR引物擴(kuò)增所用樣本為6株大花序桉新鮮葉片，隨機(jī)采自廣西東門林場(chǎng)以實(shí)生苗營(yíng)造的3年生大花序桉子代試驗(yàn)林。該試驗(yàn)林種子來(lái)自澳大利亞昆士蘭州的大花序桉天然母樹林。采集后于干冰保存帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存?；蚪MDNA快速提取試劑盒及PCR Mix均購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1. 2 基因組SSR標(biāo)記開發(fā)及引物設(shè)計(jì)

采用Trimmomati對(duì)高通量測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格過濾和質(zhì)量評(píng)估（Bolger et al.，2014），獲得高質(zhì)量的clean reads，將clean reads之間重疊區(qū)域拼接形成contigs，再根據(jù)序列信息將contigs組裝成更長(zhǎng)的scaffolds（Xie et al.，2014）?；贛ISA（http：//pgrc. ipk-gatersleben.de/misa/）網(wǎng)站對(duì)大花序桉全部scaffolds進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢索及分析。SSR搜索參數(shù)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)如下：重復(fù)基元1～6 bp，分別代表單核苷酸～六核苷酸，各核苷酸類型最小重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5次，復(fù)合型SSR的檢索條件是2個(gè)SSR片段間的距離低于100 bp。利用Primer 5.0對(duì)含有SSR且位點(diǎn)上、下游序列≥100 bp 的二基元（重復(fù)次數(shù)≥10次）、三基元（重復(fù)次數(shù)≥7次）核苷酸重復(fù)序列進(jìn)行引物批量設(shè)計(jì)。參數(shù)設(shè)置為：SSR引物長(zhǎng)度為18～22 bp;退火溫度（Tm）為58～62 ℃，且上、下游引物相差的退火溫度<2 ℃;PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為100～350 bp，G+C含量為50%～55%;避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1. 3 PCR擴(kuò)增及SSR引物有效性驗(yàn)證

隨機(jī)挑選48對(duì)基因組SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用基因組DNA快速提取試劑盒提取6株大花序桉新鮮葉片的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10.0 μL：10×Buffer 1.0 μL，dNTPs終濃度200 μmol/L，正、反向引物終濃度0.40 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，DNA模板5 ng，ddH2O定容至10.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性6 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色，拍照保存，統(tǒng)計(jì)其中能夠穩(wěn)定擴(kuò)增、條帶明亮且符合預(yù)期目的片段大小。

2 結(jié)果與分析

2. 1 大花序桉基因組SSR的重復(fù)基元類型

對(duì)大花序桉進(jìn)行基因組測(cè)序，經(jīng)拼接、組裝后獲得995093條Scaffolds，總長(zhǎng)度556992 kb。通過MISA網(wǎng)站對(duì)全部Scaffolds進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢索，共獲得177750個(gè)SSR位點(diǎn)，包括171530個(gè)SSR獨(dú)立位點(diǎn)和6220個(gè)復(fù)合型SSR位點(diǎn)（表1）。由表1可知，大花序桉基因組SSR發(fā)生頻率為17.86%，SSR位點(diǎn)分布密度為1/3.13 kb;大花序桉基因組重復(fù)基元類型較豐富，以單核苷酸的重復(fù)基元類型數(shù)量最多，分別占基因組SSR數(shù)量69.33%（118918個(gè)SSR位點(diǎn)），其次為二、三核苷酸的重復(fù)基元類型，占基因組SSR數(shù)量的21.01%（36036個(gè)SSR位點(diǎn)）和7.58%（13007個(gè)SSR位點(diǎn)）;四、五、六核苷酸的重復(fù)基元類型所占比例均相對(duì)較低，三者的比例含量總和為2.08%（共3569個(gè)SSR位點(diǎn)）?？傉麃?lái)看，含SSR位點(diǎn)的序列數(shù)量隨核苷酸基元堿基數(shù)的增加逐漸減小。

2. 2 大花序桉基因組SSR的重復(fù)基元堿基構(gòu)成

對(duì)大花序桉基因組中52612個(gè)二核苷酸～六核苷酸重復(fù)基元進(jìn)一步分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)138種重復(fù)基元類型，比例最高的20種類型SSR（圖1）共計(jì)43618個(gè)（占82.91%）。在這些核苷酸重復(fù)類型中，二核苷酸基元重復(fù)類型中以AG/CT占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（共16812個(gè)，占31.95%），其次為AT/AT（共8193個(gè)，占15.57%）和AC/GT基元類型（共2863個(gè)，占5.44%）;三核苷酸重復(fù)類型中則以AAG/CTT（共4404個(gè)，占8.37%）為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元類型，其次為AAT/ATT（4.93%）、AGG/CCT（2.91%）和CCG/CGG（2.86%）基元類型;大花序桉基因組SSR中四、五、六核苷酸重復(fù)基元雖然類型也較豐富，但占SSR位點(diǎn)總數(shù)的比例較低，且其中有76種基元類型僅出現(xiàn)1次。

2. 3 大花序桉基因組SSR基元重復(fù)次數(shù)分布

大花序桉基因組各類型核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量和比例隨著基元重復(fù)次數(shù)的增加而逐漸降低（圖2）。除去單核苷酸類型，大花序桉基因組不同SSR類型重復(fù)次數(shù)主要集中于5～11次之間，占獨(dú)立位點(diǎn)SSR總數(shù)的79.89%（表3）;重復(fù)次數(shù)≥12的SSR位點(diǎn)以二核苷酸類型SSR為優(yōu)勢(shì)，占19.29%（10151個(gè)），其中，高重復(fù)次數(shù)（≥20次）的SSR位點(diǎn)數(shù)共983個(gè)。在大花序桉基因組所有類型SSR序列中，占比例最高的重復(fù)次數(shù)依次為6次、5次、7次和8次重復(fù)類型，分別為12333、8276、7382和5049個(gè)，各占SSR總數(shù)的23.44%、16.58%、14.03%和9.60%。

2. 4 大花序桉基因組SSR重復(fù)片段長(zhǎng)度

由于SSR序列長(zhǎng)度≥20 bp時(shí)具有較高多態(tài)性，是理想的標(biāo)記位點(diǎn);序列長(zhǎng)度在12～20 bp之間時(shí)標(biāo)記多態(tài)性適中;<12 bp時(shí)SSR標(biāo)記的多態(tài)性表現(xiàn)極低（Temnykh et al.，2001），因此本研究選取≥12 bp的二～六核苷酸重復(fù)基元作進(jìn)一步片段長(zhǎng)度分析，結(jié)果圖3所示。大花序桉基因組SSR重復(fù)片段的長(zhǎng)度變化規(guī)律和基元重復(fù)次數(shù)一致，SSR序列長(zhǎng)度主要集中于12～20 bp，為38735個(gè)，占SSR總數(shù)的73.26%;分布于21～28 bp的SSR數(shù)量為9868個(gè)，占SSR總數(shù)的18.66%;≥30 bp以上的SSR數(shù)量為4265個(gè)，占SSR總數(shù)的8.07%。另外，大花序桉基因組SSR最長(zhǎng)重復(fù)片段為三核苷酸類型ATT/AAT（102～111 bp），出現(xiàn)次數(shù)為7。總整來(lái)看，大花序桉SSR長(zhǎng)度主要集中在中等多態(tài)性長(zhǎng)度，具有較大的多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)潛力。

2. 5 大花序桉基因組SSR標(biāo)記的擴(kuò)增有效性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)大花序桉基因組中具有較大多態(tài)性開發(fā)潛力的10585個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，從中隨機(jī)挑選48對(duì)SSR標(biāo)記引物，以6株大花序桉新鮮葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并從中篩選擴(kuò)增效果較好且符合預(yù)期大小的引物。由圖4可知，有31對(duì)引物能有效擴(kuò)增出清晰、明亮條帶，且大小與預(yù)期相符（表2），其中有14對(duì)引物在6株大花序桉中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，多態(tài)百分率為29.17%，8對(duì)引物擴(kuò)增效果不佳或擴(kuò)增出非目的條帶，9對(duì)引物未擴(kuò)增出條帶。結(jié)合表2還可知，未呈現(xiàn)多態(tài)性的SSR基元重復(fù)次數(shù)為7～33次;呈現(xiàn)多態(tài)性的SSR位點(diǎn)中，除復(fù)合型位點(diǎn)Ec015外，二基元類型占85.71%，重復(fù)次數(shù)為16～44次;三基元類型僅有一個(gè)SSR位點(diǎn)（即Ec007），重復(fù)次數(shù)為34次。

3 討論

經(jīng)本研究分析發(fā)現(xiàn)，大花序桉基因組177750個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR分布密度為1/3.13 kb，發(fā)生頻率為17.86%，高于赤桉（E. camaldulensis）的SSR分布密度（1/7.1 kb）（Hirakawa et al.，2011）以及基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析的巨桉（E. grandis）（11.8%）、蘋果桉（E. gunnii）（4.6%）和細(xì)葉桉（E. tereticornis）（8.3%）EST-SSR發(fā)生頻率（Yasodha et al.，2008），但低于基于FORESTs數(shù)據(jù)庫(kù)分析的巨桉、赤桉、藍(lán)桉等EST-SSR分布頻率（25.6%和25.6%）（Ceresini et al.，2005;Rabello et al.，2005）?？梢?，不同樹種基因組中SSR的分布特征存在較大的差異，相對(duì)于其他桉樹，大花序桉基因組中SSR發(fā)生頻率處于中等水平。Varshney等（2005）研究認(rèn)為，SSR分布頻度之所以出現(xiàn)差異，除了物種間差異因素外，還與測(cè)序數(shù)據(jù)深度、序列拼接數(shù)據(jù)質(zhì)量及SSR位點(diǎn)查找軟件以及SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元是絕大多植物基因組SSR序列中優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型（Biet et al.，1999）。本研究發(fā)現(xiàn)，大花桉基因組SSRs中，單、二和三核苷酸重復(fù)基元類型分別占基因組SSR數(shù)量的69.33%、21.01%和7.58%，且二核苷酸基元類型以AG/CT為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元（16812個(gè)，占31.95%），該結(jié)果和絕大部分植物中觀測(cè)到的結(jié)果一致（Sumathi and Yasodha，2014）。而三核苷酸重復(fù)基元優(yōu)勢(shì)類型則因物種而異（Victoria et al.，2011）。本研究中，大花序桉SSR序列中三核苷酸重復(fù)類型占比從高至低依次為AAG/CTT（8.37%）、AAT/ATT（4.93%）、AGG/CCT（2.91%）和CCG/CGG（2.86%），與蘋果桉（E. gunnii）（Rengel et al.，2009）和赤桉（E. camaldulensis）（Hirakawa et al.，2011）的基因組SSR三核苷酸重復(fù)類型中AAG/CTT為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元類型的結(jié)論一致。但藍(lán)桉、尾葉桉、巨桉及細(xì)葉桉等桉樹基因組SSR三核苷酸重復(fù)類型中CCG/GGC為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元類型（Ceresini et al.，2005;Yasodha et al.，2008;Sumathi and Yasodha，2014;Liu et al.，2018）。對(duì)于大花序桉而言，其根部轉(zhuǎn)錄組三核苷酸重復(fù)序列中CCG/GGC也為優(yōu)勢(shì)類型（朱林生等，2018）。上述基因組和轉(zhuǎn)錄組間的差異間接反映了三核苷酸重復(fù)類型SSR在桉樹基因組上分布不隨機(jī)。

研究表明，SSR基元重復(fù)次數(shù)越高，多態(tài)性標(biāo)記的開發(fā)潛力越大，尤其當(dāng)基元的重復(fù)次數(shù)≥12次或片段長(zhǎng)度≥20 bp時(shí)多態(tài)信息含量（PIC）較高（Thao et al.，2013）。本研究對(duì)大花序桉基因組中具有較大多態(tài)性開發(fā)潛力的10585個(gè)SSR序列（二基元重復(fù)次數(shù)≥10、三基元重復(fù)次數(shù)≥7）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，從中隨機(jī)挑選48對(duì)基因組SSR標(biāo)記引物進(jìn)行初篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有31對(duì)引物能有效擴(kuò)增，其中有14對(duì)引物在6株大花序桉中均呈現(xiàn)多態(tài)性。進(jìn)一步將多態(tài)與非多態(tài)SSR位點(diǎn)基元重復(fù)次數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重復(fù)次數(shù)最高的SSR并非一定表現(xiàn)出多態(tài)性，但從占比最高的二基元類型分析，SSR長(zhǎng)度≤30 bp（或重復(fù)次數(shù)小于16次）的位點(diǎn)多態(tài)性表現(xiàn)極低。本研究得出，大花序桉基因組SSR引物的多態(tài)百分率為29.17%，與E. victrix（33.33%）（Nevill et al.，2013）和E. gomphocephala（25%）（Bradbury et al.，2013）的多態(tài)百分率相近，但遠(yuǎn)低于赤桉（E. camaldulensis）（56%）（Silva et al.，2009）的多態(tài)百分率。今后應(yīng)對(duì)大花序桉群體的多態(tài)信息含量（PIC）、觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）進(jìn)行深入研究，為群體遺傳學(xué)分析和分子標(biāo)記輔助育種打下理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

花序桉基因組SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率高，基元類型較豐富，SSR多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)潛力大。該研究結(jié)果為大花序桉SSR引物開發(fā)和篩選，以及開展大花序桉及其他桉樹遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）