劉琳琳，嚴(yán) 佳，周 欣 （中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350025）

真菌性皮膚病，是指由病原菌真菌所引起的一大類感染性皮膚疾病[1]，其中，淺部真菌感染性皮膚病中，足癬最為常見(jiàn)且發(fā)病率最高，而趾間糜爛型和水皰型為最主要的發(fā)病類型[2]，患者抓癢造成皮損繼發(fā)細(xì)菌感染，此時(shí)感染已不僅僅累及皮膚角質(zhì)層，而是進(jìn)入真皮層，甚至透過(guò)皮下組織，危害深層組織，甚至導(dǎo)致出現(xiàn)發(fā)熱等全身癥狀。駐閩部隊(duì)官兵長(zhǎng)期穿著不透氣的作戰(zhàn)靴、膠鞋，皮膚真菌感染率普遍較高，且部隊(duì)官兵訓(xùn)練任務(wù)重、居住環(huán)境艱苦，往往因診療不及時(shí)等原因，容易出現(xiàn)繼發(fā)感染[3-4]。復(fù)方特比萘芬是在課題組前期研制的復(fù)方酮康唑軟膏基礎(chǔ)上，選擇抗真菌藥鹽酸特比萘芬和糖皮質(zhì)激素藥糠酸莫米松，聯(lián)合適宜的抗菌藥物莫匹羅星，作為處方的主藥[5]。解決了酮康唑不穩(wěn)定、易變色的問(wèn)題，既可利用協(xié)同作用增強(qiáng)治療效果，又方便應(yīng)用，提高了患者使用的依從性，改善了市售產(chǎn)品的有效性和安全性，具有較高的軍事利用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)主要研究在制劑過(guò)程考慮加入滲透促進(jìn)劑，增加藥物透皮吸收速率和濃度，達(dá)到根治此類疾病、杜絕反復(fù)發(fā)作的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DV215CD 型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；安捷倫1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；KQ-600DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），YSEI 型綜合藥品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱（重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠），DF-101B 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸特比萘芬對(duì)照品（批號(hào)：100563-201402，含量99.8%）、莫匹羅星對(duì)照品（批號(hào)：130568-200501，含量94.2%）、糠酸莫米松對(duì)照品（批號(hào)：100930-201201，含量99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，鹽酸特比萘芬原料藥（批號(hào)：20150405)、莫匹羅星原料藥（批號(hào)：20150301）均購(gòu)自武漢鑫佳靈生物科技有限公司，糠酸莫米松原料藥（批號(hào)：20150228，浙江仙琚制藥股份有限公司），聚乙二醇400、聚乙二醇3350（中國(guó)醫(yī)藥對(duì)外貿(mào)易公司），甲醇為色譜純，水為超純水；氮酮（廣州化學(xué)試劑廠），1,2-丙二醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），其余所用試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，體重（170～230）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK 滬（2017-0001），購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)7 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

色譜柱為ZORBAX SB-C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

經(jīng)專屬性考察發(fā)現(xiàn)，鹽酸特比萘芬、莫匹羅星、糠酸莫米松分離度良好，所用輔料均不會(huì)對(duì)藥物的測(cè)定產(chǎn)生干擾。以藥物峰面積A 為縱坐標(biāo)，藥物濃度C 為橫坐標(biāo)作線性回歸曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸特比萘芬線性回歸方程為：A=1.763×10C+36.63，r=0.999 7，在20～200 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；莫匹羅星線性回歸方程為：A=2.307C+6.777，r=0.999 8，在40～400 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；糠酸莫米松線性回歸方程為：A=2.854×10C+1.763，r=0.999 8，在2～20 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對(duì)日內(nèi)、日間精密度及方法的重復(fù)性進(jìn)行考察，其RSD 值均小于1%；低、中、高3 個(gè)水平濃度的平均回收率在98%～101%范圍內(nèi)，且RSD 值小于1%；供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，且RSD 值小于1%。以上數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)精密度、重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性均符合要求。

制備復(fù)方特比萘酚軟膏3 批，每批3 份，測(cè)定藥物含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品中的3 種主藥莫匹羅星、糠酸莫米松和鹽酸特比萘芬的含量均為標(biāo)示量的90.0%～110.0%，符合規(guī)定。

2.2 體外經(jīng)皮滲透性考察

2.2.1 裝置

試驗(yàn)裝置為立式Franz 擴(kuò)散池[6-9]，藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，透皮有效擴(kuò)散面積是3.14 cm2，接受室體積為7.8 ml。

2.2.2 滲透膜的處理

斷頸處死SD 大鼠后，用電剪刀剪除腹部的鼠毛，硫化鈉溶液去除絨毛，取腹部處皮膚，將皮下脂肪與筋膜剝離，用0.9%的氯化鈉注射液清洗干凈后，放于冰箱4 ℃保存，備用。

2.2.3 接受液的選擇

通常體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)的接受液選擇0.9%氯化鈉注射液，但是由于復(fù)方特比萘芬軟膏中3 種主藥在水中的溶解度不佳，為了保持其漏槽條件，考察3 種主藥在不同比例的聚乙二醇400-生理鹽水混合液中的溶解情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 種主藥在60%聚乙二醇400-40%生理鹽水中都可以保持漏槽條件并達(dá)到最大溶解度，因此，實(shí)驗(yàn)的接受液選擇60%聚乙二醇400-40%生理鹽水。

2.2.4 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)方法

將“2.2.2”項(xiàng)下經(jīng)過(guò)處理的大鼠皮在水平擴(kuò)散池的兩個(gè)半池之間固定，加接收液7.8 ml 于接受池中，擴(kuò)散池在(32±1)℃的水浴中預(yù)平衡1 h 后，分別加入0.5 g 不同濃度和種類促進(jìn)滲透劑的復(fù)方特比萘芬軟膏于供體池中，于0.5、1、2、4、6、8、24 h分別取樣2 ml，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后注入HPLC儀分析測(cè)定。同時(shí)，在受體池中補(bǔ)加等量空白接收液。以累積滲透量為指標(biāo)篩選最適宜的透皮促進(jìn)劑及其用量。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理公式

累積滲透量的計(jì)算公式：

式中，Cn是在第n 個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)所測(cè)得的藥物濃度；V0是接受室的體積；Ci是在第i 個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)所測(cè)得的藥物濃度；V 是取樣體積；A 是滲透面積（cm2）。

2.3 體外經(jīng)皮滲透性比較試驗(yàn)

2.3.1 未加滲透促進(jìn)劑的復(fù)方特比萘芬軟膏的體外經(jīng)皮滲透性

取未加滲透促進(jìn)劑的復(fù)方特比萘芬軟膏進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透性試驗(yàn)，計(jì)算累積滲透量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不加滲透促進(jìn)劑時(shí)，復(fù)方特比萘芬軟膏中鹽酸特比萘芬24 h 的累積滲透量為8.64 μg/cm2，莫匹羅星24 h 的累積滲透量為9.12 μg/cm2，而糠酸莫米松無(wú)滲透。

2.3.2 氮酮對(duì)復(fù)方特比萘芬軟膏經(jīng)皮滲透的影響

在復(fù)方特比萘芬軟膏中分別加入1%、3%、5%氮酮，進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透性試驗(yàn)。以累積滲透量為縱坐標(biāo)，滲透時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制累積滲透曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以氮酮為滲透促進(jìn)劑時(shí)，不同濃度氮酮對(duì)鹽酸特比萘芬作用大小為3%＞1%＞5%，不同濃度氮酮對(duì)莫匹羅星作用大小為3%＞1%＞5%，不同濃度氮酮對(duì)糠酸莫米松無(wú)滲透作用。結(jié)果見(jiàn)表1、表2 和圖1、圖2。

表1 鹽酸特比萘芬在不同濃度氮酮作用下的累積滲透量(μg/cm2)

表2 莫匹羅星在不同濃度氮酮作用下的累積滲透量(μg/cm2)

圖1 鹽酸特比萘芬在不同濃度氮酮作用下的累積滲透曲線

圖2 莫匹羅星在不同濃度氮酮作用下的累積滲透曲線

2.3.3 丙二醇對(duì)復(fù)方特比萘芬軟膏經(jīng)皮滲透的影響

在復(fù)方特比萘芬軟膏中分別加入5%、10%、15%丙二醇，進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透性試驗(yàn)。以滲透時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積滲透量為縱坐標(biāo)，繪制累積滲透曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10%丙二醇對(duì)復(fù)方特比萘芬軟膏的促滲作用明顯大于15%丙二醇，且10%丙二醇滲透量又大于3%氮酮，故本實(shí)驗(yàn)選擇10%丙二醇作為滲透促進(jìn)劑。結(jié)果見(jiàn)表3～5 和圖3～5。

表3 鹽酸特比萘芬在不同濃度丙二醇作用下的累積滲透量(μg/cm2)

表4 莫匹羅星在不同濃度丙二醇作用下的累積滲透量(μg/cm2)

表5 糠酸莫米松在不同濃度丙二醇作用下的累積滲透量(μg/cm2)

圖3 鹽酸特比萘芬在不同濃度丙二醇作用下的累積滲透曲線

圖4 莫匹羅星在不同濃度丙二醇作用下的累積滲透曲線

圖5 糠酸莫米松在不同濃度丙二醇作用下的累積滲透曲線

3 討論

3.1 滲透促進(jìn)劑的種類

滲透促進(jìn)劑能夠提高或加速藥物透過(guò)皮膚且對(duì)皮膚沒(méi)有損傷和刺激。滲透促進(jìn)劑有很多種，包括二甲亞砜及其類似物、醇類化合物、氮酮類化合物、表面活性劑等，其中，氮酮與丙二醇最為常用。丙二醇為無(wú)色黏稠液體，近乎無(wú)味，毒性和刺激性都非常小。氮酮為無(wú)色澄明的液體，無(wú)刺激性且副作用小，潤(rùn)滑效果好，理化性質(zhì)穩(wěn)定，作為新型滲透促進(jìn)劑近幾年來(lái)應(yīng)用廣泛[10-11]。

3.2 滲透促進(jìn)劑的作用

促滲劑的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以氮酮和丙二醇為滲透劑的累積滲透量均明顯高于無(wú)滲透促進(jìn)劑者。作為研究治療淺部真菌皮膚病合并細(xì)菌感染的外用制劑，治療時(shí)要求藥物不僅作用于角質(zhì)層，還需穿透皮膚，提高藥物在皮膚中的溶解度，因此有必要在處方中加入滲透促進(jìn)劑，達(dá)到治標(biāo)又治本的目的。

3.3 不同濃度丙二醇的促滲作用對(duì)比

以丙二醇為滲透促進(jìn)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然15%丙二醇對(duì)莫匹羅星和糠酸莫米松的促滲作用最大，但與10%丙二醇相比，累積滲透量相差不大，而在對(duì)鹽酸特比萘芬的促滲作用中，10%丙二醇明顯優(yōu)于15%丙二醇。

3.4 氮酮和丙二醇的促滲作用對(duì)比

以氮酮為滲透促進(jìn)劑的實(shí)驗(yàn)表明，3%氮酮對(duì)復(fù)方特比萘芬軟膏促滲作用最好，但對(duì)糠酸莫米松無(wú)滲透作用，氮酮未能增加糠酸莫米松透皮量和透皮速度，是否糠酸莫米松仍滯留在皮膚層中或皮膚表面，在今后實(shí)驗(yàn)中擬通過(guò)皮膚滯留量實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析可能原因。對(duì)比氮酮和丙二醇的促滲效果，10%丙二醇優(yōu)于3%氮酮，因此，研究以累積滲透量為指標(biāo)選擇10%丙二醇作為滲透促進(jìn)劑加入處方。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用60%聚乙二醇400-40%生理鹽水為接受液，10%丙二醇作為滲透促進(jìn)劑加入處方中，大大提高了藥物在皮膚中的溶解度。本研究結(jié)果為臨床治療淺部真菌皮膚病并申報(bào)一種安全有效的院內(nèi)制劑特比萘酚軟膏提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在為部隊(duì)官兵提供更優(yōu)質(zhì)便捷的臨床服務(wù)方面具有重要的軍事意義。