胡學(xué)春 任凌云 王麗娟 王 駿 張艷俠 金增偉 吳真真 王瑞杰 郭啟雷

(山東省糧油檢測(cè)中心1 ，濟(jì)南 250101) (山西糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心 2 ，太原 030024) (山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 3 ,濟(jì)南 250101) (安捷倫科技(中國(guó))有限公司 4 ,北京 100102)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是由鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢族化合物中的一種，屬于?類(lèi)單端孢霉烯族毒素，是一種有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，因動(dòng)物食后嘔吐，又名嘔吐毒素。

小麥在生長(zhǎng)期、成熟期和收獲期，都可感染嘔吐毒素。鐮刀菌能在1～39 ℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適溫度為25～30 ℃，最適產(chǎn)毒溫度通常在8～12 ℃之間。土壤幾乎包含了自然界所有菌類(lèi)，我國(guó)高產(chǎn)量的方法之一是密集種植，陽(yáng)光不能照射土壤殺死其中的真菌，當(dāng)遇到陰雨連綿，溫度濕度適宜時(shí)，土壤中的真菌快速繁殖，小麥通過(guò)根系把土壤中的真菌吸收進(jìn)入果實(shí)。在成熟期，小麥果殼張開(kāi)，尤其是在淮河流域，此時(shí)正是梅雨季節(jié)，雨水進(jìn)入籽粒果殼內(nèi)，果殼降溫收縮閉合，包含住雨水，此時(shí)溫度高、濕度大，小麥籽粒特別容易感染真菌。在收獲期，糧食籽粒特別是在胚芽部，此處水分大、富含糖、脂肪和蛋白質(zhì)，是真菌的良好培養(yǎng)基，適宜真菌的快速生長(zhǎng)。

圖1 DON分子結(jié)構(gòu)式

2006年，歐盟規(guī)定嘔吐毒素在粗谷物中的最大限最為1 250 μg/kg[2]。2001年食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)(JECFA)第56次會(huì)議首次對(duì)DON進(jìn)行了評(píng)估，根據(jù)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，JECFA提出DON的暫定每日最大耐受攝入量( provisional maximum tolerable daily in-take，PMTDI)為1 μg/kgbw。2010年JECFA第72次會(huì)議維持了DON的PMTDI值為1 μg/kgbw[3,4]。GB 2761—2017中規(guī)定小麥及其制品中DON的最大允許限量為1 000 μg/kg[5]。

目前，國(guó)內(nèi)研究小麥(糧食)中DON降解的主要方法有風(fēng)選除去赤霉病粒、紫外線照射法；臭氧水浸泡法降解赤霉病小麥中的 DON[6]，DON的降解率可達(dá)19.99%，增大濃度、延長(zhǎng)浸泡時(shí)間，降解率最大可到44.12%；生物發(fā)酵法降解糧食及其制品中真菌毒素[7]，酒糟降解后DON的含量≤500 μg/kg，還有蒙脫石物理吸附法、氨發(fā)酵法等。

本研究分析了小麥中DON的降解方法及降解產(chǎn)物，感染DON的小麥經(jīng)高溫高壓膨化處理，不添加任何化學(xué)試劑，可使DON降解率達(dá)61.9%～81.1%，降解產(chǎn)物經(jīng)UHPLC-QTOF-MS分析，通過(guò)全掃描模式采集數(shù)據(jù)，利用設(shè)備配置的粒子群優(yōu)化算法(Particle Swarm optimization, PSO)，對(duì)不同質(zhì)核比范圍內(nèi)分段優(yōu)化，考慮同位素權(quán)重計(jì)算精確質(zhì)量數(shù)，利用分子式生成(MFG)功能生成元素組成，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜圖檢索比對(duì)譜庫(kù)(PCDL庫(kù))，與譜庫(kù)已知化合物分析確認(rèn)降解產(chǎn)物的分子式，根據(jù)DON的已知結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵能推測(cè)可能的分解產(chǎn)物，通過(guò)儀器內(nèi)置的結(jié)構(gòu)解析輔助軟件(MSC)，對(duì)未知結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷，得到至少5個(gè)分解產(chǎn)物，確定降解產(chǎn)物可能的分子結(jié)構(gòu)，降解產(chǎn)物之一3-epi-DON的毒性是DON的1/350[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

污染DON不同程度的小麥 ，1#小麥DON含量731 μg/kg、2#小麥DON含量8 995 μg/kg、3#小麥DON含量4 023 μg/kg；DON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，5 mg，純度98.0%；DON參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Lot # D-C-622，含量1 900 μg/kg；甲醇、乙腈，色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

膨化罐：304不銹鋼，自制(見(jiàn)圖2)；Waters e2695高效液相色譜儀，UHPLC-QTOF-MS 6545高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀。

1.2 方法

1.2.1 潤(rùn)麥

取500 g小麥于潤(rùn)麥瓶中，加入水至實(shí)驗(yàn)要求的水分，充分混合均勻，密閉放置24 h，使水被小麥完全吸收。

加水量按公式(1)計(jì)算：

w水=w樣(m1-m0)/(100-m1)

(1)

式中：w水為需要加水?dāng)?shù)量/g；w樣為實(shí)驗(yàn)樣品的數(shù)量/g；m1為樣品需要加到的水分/%；m0為樣品原始水分/%。

1.2.2 小麥中DON的降解脫毒處理

實(shí)驗(yàn)用膨化機(jī)膨化腔2.5 L，轉(zhuǎn)速30 r/min和60 r/min 2擋可以選擇，煤氣加熱，設(shè)計(jì)最高使用壓力1.3 MPa。

將1.2.1潤(rùn)麥處理后的小麥300 g置于高溫高壓膨化機(jī)中，在不同水分、壓力下膨化處理，控制加熱時(shí)間和轉(zhuǎn)速，使膨化腔達(dá)到規(guī)定的壓力后，啟動(dòng)泄壓開(kāi)關(guān)，達(dá)到膨化的目的，冷卻至室溫后粉碎，粉碎后的樣品檢測(cè)其DON含量，確定降解脫毒的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.2.3 DON 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)

將5 mg DON 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解于1 mL乙腈中，并稀釋成500 μg /mL 的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，將膨化罐置于烘箱中加熱至80 ℃，把1 mL DON乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到膨化罐內(nèi)部，使乙腈自然揮發(fā)干，將膨化罐置于高溫高壓膨化機(jī)中，按1.2.2確定的最佳條件隨同樣品一起膨化處理。

圖2 膨化罐結(jié)構(gòu)示意圖(單位mm)

1.2.4 檢測(cè)方法

1.2.4.1 按照GB 5009.111—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y(cè)定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定小麥降解脫毒處理前后的DON含量。

1.2.4.2 按照 LS/T 6113—2015《糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定 膠體金快速定量法》測(cè)定小麥降解脫毒處理前后的DON含量。

1.2.4.3 高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀解析DON降解產(chǎn)物

UHPLC-QTOF-MS實(shí)驗(yàn)條件為，液相色譜柱: Agilent Eclipse Plus C18(RRHD)(柱長(zhǎng)150 mm，柱內(nèi)徑 3.0 mm, 填料粒徑1.8μm)；流動(dòng)相: A相：水溶液(0.5 mmol/L 氟化銨+ 4.5 mmol/L 甲酸銨+ 0.1% 甲酸)；B相：甲醇溶液 (0.5 mmol/L 氟化銨+ 4.5 mmol/L 甲酸銨+ 0.1% 甲酸)；梯度洗脫；流速: 0.40 mL/min；柱溫: 40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；離子源: 電噴霧離子源；質(zhì)量數(shù)掃描范圍: 40m/z～1 000m/z(+)；40m/z～1 100m/z(-) ；干燥氣溫度: 300 ℃；干燥氣流量: 7 L/min；霧化器壓力: 40 psi；鞘氣溫度: 375 ℃；鞘氣流量: 12 L/min；毛細(xì)管電壓: 3 500 V/4 000 V；噴嘴電壓: 0 V/1 000 V；采集頻率：2 Spec/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的質(zhì)量控制

不同方法測(cè)定DON的結(jié)果均符合GB 5009.111—2016中25%的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)要求，也達(dá)到DON參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)第一范圍800～1 000 μg/kg的要求，從而確定本研究對(duì)DON測(cè)定結(jié)果的可靠性。

2.2 小麥中DON降解條件選擇實(shí)驗(yàn)

2.2.1 膨化機(jī)檢漏和預(yù)熱

檢漏和預(yù)熱：在膨化腔加入100 mL水，關(guān)閉密封閥，檢查是否漏水。開(kāi)啟自動(dòng)旋轉(zhuǎn)器30 r/min、點(diǎn)火加熱至1.3 MPa，關(guān)閉加熱和旋轉(zhuǎn)器，開(kāi)啟膨化開(kāi)關(guān)。如果有漏氣，檢查或更換密封墊片后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膨化壓力在0.7 MPa以下時(shí)，轉(zhuǎn)速選擇30 r/min和60 r/min均可，膨化壓力在0.7 MPa以上時(shí)，應(yīng)選擇轉(zhuǎn)速60 r/min，保證受熱均勻和膨化效果。

2.2.2 水分對(duì)DON降解的影響

將2#小麥潤(rùn)濕至水分為15%、20%、25%，分別置于高溫高壓膨化機(jī)中，調(diào)整壓力為0.7 MPa， 小麥降解后DON檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 水分對(duì)降解的影響結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水分對(duì)降解脫毒效果影響不大，考慮到能耗，選擇20%。

按照設(shè)想，水分的增加會(huì)有利于小麥中DON的降解。按照克拉伯龍方程PV=nRT,1 moL 水完全氣化，在理想狀態(tài)下的體積是22.4 L，體積膨脹1 244倍，飽和水蒸氣在0.7 MPa時(shí)的溫度約165 ℃，在壓力P一定時(shí)，v1/T1=v2/T2，當(dāng)溫度從20 ℃(293 K)升高到165 ℃(438 K)時(shí)，體積增加1.5倍，即1 moL水完全氣化，溫度達(dá)到165 ℃時(shí)的體積膨脹1 866倍，水分體積的瞬間爆破，有可能將小麥連同DON一起撕裂，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，增加水分并不會(huì)提高降解效果。

2.2.3 壓力對(duì)DON降解的影響

將2#小麥潤(rùn)濕至水分為20%，分別置于高溫高壓膨化機(jī)中，調(diào)整壓力為0.7、1.0、1.3 MPa，小麥降解后DON檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 壓力對(duì)降解的影響結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，壓力是影響降解脫毒效果的關(guān)鍵因素，選擇壓力1.3 MPa。

膨化時(shí)的溫度、壓力是影響膨化效果的關(guān)鍵因素，溫度是由壓力確定的，所以調(diào)節(jié)壓力是本實(shí)驗(yàn)的主要控制條件，但因本膨化機(jī)設(shè)計(jì)的最高使用壓力是1.3 MPa，為安全計(jì)只能使用到最高設(shè)計(jì)壓力。增加壓力即提高溫度，分子獲得足夠能量，化學(xué)鍵斷裂，說(shuō)明在高溫高壓下瞬間爆破使化學(xué)鍵獲得足夠的能量是DON降解的必要條件。

2.2.4 小麥中DON降解的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將1#、2#、3#小麥潤(rùn)濕至水分為20%，置于高溫高壓膨化機(jī)中，在1.3 MPa壓力下，在不同時(shí)間進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，在不同的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定其原料和處理后產(chǎn)品的DON含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一年內(nèi)不同時(shí)間，對(duì)不同DON含量的小麥進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，降解率在61.9%～81.1%，平均75.2%，說(shuō)明本方法對(duì)于污染不同濃度DON的小麥降解脫除效果是可重復(fù)實(shí)現(xiàn)的，方法是可靠的。降解率的差異，應(yīng)該是樣品檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)參數(shù)的差異引起的，而不是方法的不穩(wěn)定引起的。

表3 DON重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表

2.3 DON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的降解脫毒處理及其降解產(chǎn)物的分析

2.3.1 DON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的降解脫毒處理

將1.2.3處理的膨化罐隨小麥在壓力為1.3 MPa時(shí)膨化處理，然后將膨化罐置于乙腈中浸泡清洗罐中的DON及其降解產(chǎn)物，濃縮后用UHPLC-QTOF-MS解析其降解產(chǎn)物。

2.3.2 主要降解產(chǎn)物的變化方式和降解產(chǎn)物的基本參數(shù)

根據(jù)UHPLC-QTOF-MS分析檢定，解析出以下5種DON降解產(chǎn)物，見(jiàn)表4和圖3。

表4 DON主要降解產(chǎn)物

2.3.3 DON主要降解產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜圖

DON降解的主要途徑為DON的3-OH的β、α異構(gòu)化和酮基化及內(nèi)醚鍵的水化反應(yīng)、C5、C6位基團(tuán)的降解脫落等。3-OH和內(nèi)醚結(jié)構(gòu)是 DON的重要毒位點(diǎn)，3-OH的異構(gòu)化和內(nèi)醚鍵水化反應(yīng)使內(nèi)醚鍵的斷裂對(duì)DON毒性的降低意義重大。

2.3.3.1 主要降解產(chǎn)物之一

水化-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配圖，見(jiàn)圖3。

圖3 水化-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配圖

圖3a為水化-DON的保留時(shí)間和豐度圖，圖3b為水化-DON的同位素分布的理論值(方框)和實(shí)際值(方框內(nèi)棒狀)完美匹配，基本確定了降解產(chǎn)物水化-DON的分子式、分子結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量，化學(xué)反應(yīng)方程結(jié)構(gòu)式如圖4。

圖4 DON發(fā)生水化反應(yīng)生成水化-DON的反應(yīng)結(jié)構(gòu)方程式

雜環(huán)內(nèi)醚結(jié)構(gòu)是目前已知DON的重要毒位點(diǎn)之一，水化反應(yīng)是醚鍵打開(kāi)，結(jié)合一個(gè)H2O分子，此處分子鍵的斷裂對(duì)毒性的降低意義重大。 此處化學(xué)鍵的斷裂，意味著DON的雜環(huán)結(jié)構(gòu)變成不穩(wěn)定的單鍵連接，猜測(cè)雜環(huán)結(jié)構(gòu)完全斷裂的可能性極大。

2.3.3.2 主要降解產(chǎn)物之二

3-epi-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配對(duì)比圖見(jiàn)圖5。

圖5a為DON和3-epi-DON的保留時(shí)間和豐度對(duì)比圖，圖5b為DON和3-epi-DON的同位素分布的理論值(紅框)和實(shí)際值(紅框內(nèi)棒狀)匹配對(duì)比圖，基本確定了3-epi-DON的分子式、分子結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量。

圖5 DON和3-epi-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配對(duì)比圖

盡管3-epi-DON只是DON的3位羥基發(fā)生差向異構(gòu)，是 DON的同分異構(gòu)體，與DON的分子式、分子質(zhì)量、質(zhì)核比一樣，但二者的分子結(jié)構(gòu)式不同，保留時(shí)間有較大差異，這也說(shuō)明了二者的化學(xué)性質(zhì)有較大差異，也從另一方面證明了3-epi-DON與DON的毒性有較大差異。

3 結(jié)論

污染了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的小麥，經(jīng)高溫高壓膨化處理，61.9%～81.1%的DON發(fā)生了降解反應(yīng)，已經(jīng)解析出的降解產(chǎn)物有水化-DON、3-epi-DON、3-kedo DON；降解機(jī)理是DON分子化學(xué)鍵獲得足夠能量發(fā)生斷裂，其斷裂途徑主要是DON的3位羥基發(fā)生差向異構(gòu)和酮基化，1位內(nèi)醚發(fā)生水化反應(yīng)；壓力是影響降解脫毒效果的關(guān)鍵因素；通過(guò)UHPLC-QTOF-MS基本確定了DON部分裂解產(chǎn)物的分子式有C15H20O6、C15H18O6、C15H22O7，分子質(zhì)量分別是296.126 0、294.110 3、314.136 6 ku。