李曉晴，馮 新，陳雪諾，馬 戰(zhàn)，姜 政

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400016)

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率一直居高不下。由于缺乏腫瘤標(biāo)志物和特異性的癥狀與體征，早期診斷以及早期治療存在一定的困難。盡管近年來胃癌的診斷和治療取得了很大進(jìn)展，但由于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，胃癌患者的預(yù)后仍然較差。目前，腫瘤血清標(biāo)志物如癌胚抗原(CEA)、胃蛋白酶原、幽門螺桿菌抗體以及胃鏡和組織病理學(xué)檢查是用于診斷和評估疾病的主要手段，但這些診斷方法對早癌的檢出率較低[1]。因此，尋求可用于胃癌早期檢測和大規(guī)模篩選的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。

微小RNA(miRNA)是具有17～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼調(diào)節(jié)RNA，其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)中起重要作用[2]。由于miRNA存在于涉及腫瘤的基因組區(qū)域中，故越來越被認(rèn)為是腫瘤診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤中發(fā)揮致癌或抑癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b-5p參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤[3]、肝癌[4]、結(jié)腸癌[5]、肺癌[6]、胰腺癌[7]等多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展。然而，有關(guān)miR-181b-5p在胃癌中的表達(dá)和作用機(jī)制卻罕有報(bào)道。

GEO(Gene Expression Omnibus)是由美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，是當(dāng)今最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源。本文通過GEO數(shù)據(jù)庫的miRNA芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)分析方法，研究miR-181b-5p在胃癌中的表達(dá)情況，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料：在GEO 數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載胃癌的 miRNA 數(shù)據(jù)，檢索詞為“gastric cancer”，“microRNA”。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃癌的miRNA數(shù)據(jù)物種為人類；②有腫瘤組和正常對照組；③樣本數(shù)量超過2例；④樣本數(shù)據(jù)可以用來計(jì)算。排除標(biāo)準(zhǔn)：①樣本為血液或腹水的；②樣本是胃癌細(xì)胞系的；③樣本中無miR-181b-5p相關(guān)數(shù)據(jù)；④樣本中有其他干擾因素。

1.2方法

1.2.1數(shù)據(jù)提取和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：下載miR-181b-5p的表達(dá)數(shù)據(jù)，用SPSS 23.0分析數(shù)據(jù)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，繪制ROC曲線來檢驗(yàn)miR-181b-5p的診斷價值。Review Manager 5.3進(jìn)行Meta分析，卡方檢驗(yàn)和I2檢驗(yàn)用于判斷數(shù)據(jù)的異質(zhì)性，若I2<25%，表明異質(zhì)性較?。?5%≤I2<50%，表明異質(zhì)性中等；P<0.05或I2≥ 50%，表明異質(zhì)性高。若異質(zhì)性小或中等，使用固定效應(yīng)模型分析；若異質(zhì)性大,使用隨機(jī)效應(yīng)模型分析。繪制森林圖檢驗(yàn)數(shù)據(jù)有無偏移，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2生物信息學(xué)分析：采用MirDB[8]、miRWalk[9]、Pictar[10]、TargetScan[11]、Mirtarbase[12]、DIANAmicroT[13]預(yù)測miR-181b-5p的靶基因，預(yù)測的結(jié)果取交集，納入至少被三個平臺預(yù)測到的靶基因，從而減少軟件預(yù)測的假陽性率。對全部納入的潛在靶基因用DAVID在線工具[14]進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析。

2 結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：從GEO數(shù)據(jù)庫中收集到5個miRNA芯片數(shù)據(jù)集：GSE28700、GSE30070、GSE54397、GSE78091、GSE93415，表達(dá)數(shù)據(jù)均已經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見圖1，其中GSE30070、GSE54397、GSE93415數(shù)據(jù)集中胃癌組織的miR-181b-5p表達(dá)水平均值高于正常組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別是P=0.0455、P=0.0027、P<0.001)。3個數(shù)據(jù)集的ROC曲線見圖2，從GSE30070、GSE93415數(shù)據(jù)的ROC曲線可以看出，miR-181b-5p對胃癌有一定的診斷價值。

圖1 5個GEO數(shù)據(jù)集中miR-181b-5p在胃癌組織和正常組織的表達(dá)水平

圖2 3個GEO數(shù)據(jù)集中miR-181b-5p的ROC曲線

2.2Meta分析結(jié)果：對5個miRNA芯片數(shù)據(jù)集中miR-181b-5p的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析，異質(zhì)性檢驗(yàn)示P<0.05，I2=83%，異質(zhì)性大,應(yīng)用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，SMD(標(biāo)準(zhǔn)±均數(shù)差)為 1.09(95%CI:0.29～1.89，P<0.0001)，Meta分析顯示胃癌和正常胃組織的 miR-181b-5p的表達(dá)水平有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。圖3為繪制的森林圖。

圖3 miR-181b-5p在胃癌和正常胃組織中表達(dá)水平的森林圖

2.3生物信息學(xué)分析結(jié)果： 通過6個miRNA靶基因預(yù)測平臺結(jié)果取交集后，共得到145個miR-181b-5p潛在的靶基因。各項(xiàng)結(jié)果見表1。GO功能分析結(jié)果表明，靶基因的功能主要為轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合的調(diào)節(jié)等方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KEGG通路分析表明，靶基因主要涉及的生物學(xué)通路為：背腹軸形成、腫瘤miRNA、雌激素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、Fox O信號通路、MAPK信號通路、腫瘤的中心碳代謝、HTLV-I感染等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 GO功能和KEGG通路分析結(jié)果各項(xiàng)預(yù)測的前10項(xiàng)

3 討論

胃癌是由于多個基因發(fā)生不同遺傳變化而導(dǎo)致的多步驟的結(jié)果。由于缺乏高靈敏度和非侵入性的生物標(biāo)志物，導(dǎo)致胃癌的診治和預(yù)后未得到明顯改善[15]。盡管許多研究一直在不斷地探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，但具體的分子機(jī)理仍未完全闡明。為了更深入地了解胃癌的分子機(jī)制，從miRNA層面分析其調(diào)控的生物學(xué)過程和功能，對腫瘤的診治有重要意義。miRNA可以通過分泌外泌體顆粒從癌細(xì)胞釋放到體液中，如血清、血漿、尿液、羊水和胃液等[16]，這可以保護(hù)它們免受核糖核酸酶(RNase)的降解。在一定的生理狀態(tài)下，來源于不同細(xì)胞的miRNA在體液中會有不同的表達(dá)模式[16-17]。因此，miRNA可能是診斷胃癌有效的非侵入性生物標(biāo)志物。

miR-181b-5p在許多癌癥中的基因表達(dá)、分子調(diào)控等方面都發(fā)揮著重要的作用。Shi L等人的研究[3]指出，miR-181b-5p作為腫瘤抑制因子觸發(fā)生長抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，異常下調(diào)的miR-181b-5p可能是導(dǎo)致人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵因素。Wang B.指出上調(diào)的miR-181b-5p會促進(jìn)肝癌的生長、遷移和侵襲[4]。Nakajima G等人發(fā)現(xiàn)miR-181b-5p在結(jié)腸癌組織中過表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞周期控制等方面促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。Tian F等證明miR-181b-5p在肺鱗狀細(xì)胞癌中負(fù)調(diào)控RASSF1和PIK3R1的表達(dá)，而RASSF1和PIK3R1直接參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生[6]。Tomihara H等人的研究[7]表明，ETS1是miR-181b-5p的靶標(biāo)，與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后有關(guān)。關(guān)于miR-181b-5p在胃癌中的表達(dá)和機(jī)制的研究卻少有文獻(xiàn)報(bào)道，國內(nèi)的一項(xiàng)研究報(bào)道了對12例胃癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織進(jìn)行微陣列研究，結(jié)果表明miR-181b在胃癌組織中異常過表達(dá)[18]。同樣的，還有一項(xiàng)國內(nèi)研究也通過RT-PCR法檢測了46例胃癌患者、27例胃癌前病變患者及21例健康人外周血漿中miR-181b的表達(dá)水平，結(jié)果表明在胃癌和胃癌前病變患者中miR-181b表達(dá)明顯增加[19]。但是在另一項(xiàng)研究中，miR-181b在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于正常組織細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[20]。這些研究表明，目前關(guān)于miR-181b-5p與胃癌的關(guān)系和作用機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步的探索。

本研究通過在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索含有miR-181b-5p的數(shù)據(jù)集，比較miR-181b-5p在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)水平，用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和Meta分析方法，發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織的 miR-181b-5p的表達(dá)水平有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)，表明對miR-181b-5p胃癌有一定的診斷價值。同時結(jié)合多個靶基因預(yù)測平臺得到145個miR-181b-5p的靶基因，盡可能減少預(yù)測的假陽性。對靶基因進(jìn)行GO功能分析，得到靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合的調(diào)節(jié)等方面；KEGG通路分析顯示其主要涉及背腹軸形成、腫瘤miRNA、雌激素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、Fox O信號通路、MAPK信號通路、腫瘤的中心碳代謝等。本研究結(jié)合多個GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，結(jié)果較為可靠，這為胃癌的診治提供了一些新的思路。但仍存在一些不足，如納入miRNA數(shù)據(jù)集的異質(zhì)性較大、芯片測序及標(biāo)準(zhǔn)化處理的方法不同、需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證結(jié)果等。

總之，miR-181b-5p的上調(diào)與胃癌有密切的聯(lián)系，對胃癌的診斷可能有重要的意義，未來需要更多多中心、大樣本的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。