占 爽，吳 望，胡軍華,2，吳玉珠，喬興華，陳 力，程 蘭，周 彥,2

(1 西南大學(xué)柑桔研究所，重慶，400712；2 農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)果樹科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，重慶，400712；3 重慶市萬州區(qū)植物保護(hù)與果樹技術(shù)推廣站，重慶，404020)

2018年秋季至2019年春季，重慶市萬州區(qū)的尤力克檸檬種植區(qū)域，突發(fā)大面積柑桔植株枝梢枯死、大量葉片枯萎伴隨大量落果的現(xiàn)象，并且在鄰近的臍橙和雜柑上也有類似現(xiàn)象發(fā)生。按照柑桔炭疽病采取相應(yīng)的防控措施未能有效控制病害。從發(fā)病季節(jié)及主要癥狀來看，高度疑似由Pseudofabraeacitricarpa引起的柑桔真菌病害——柑桔輪斑病(the citrus target spot)[1-5]。在防治上，有研究者根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定，提出苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺對(duì)柑桔輪斑病病原菌有抑制作用[2]，但生產(chǎn)中可用于防控此病害的藥劑有限[3]。目前，關(guān)于柑桔輪斑病病原菌的侵染機(jī)制、致病機(jī)理及系統(tǒng)防控方案等尚無報(bào)道。為了明確重慶市萬州區(qū)疑似柑桔輪斑病的病原和初步篩選防控藥劑，以重慶萬州地區(qū)患病柑桔為材料，進(jìn)行病原菌分離鑒定和致病性測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行常用殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 材料病害樣品：采自重慶市萬州區(qū)患病尤力克檸檬、北京檸檬和紐荷爾臍橙植株。

供試菌株：WZ1、WZ2和WZ3菌株分離自尤力克檸檬病害樣品，NHRQC1菌株分離自紐荷爾臍橙病害樣品，BJNM1菌株分離自北京檸檬病害樣品。在PDA培養(yǎng)基上，20 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，4 ℃保存、備用。

供試組織材料：尤力克檸檬、紅桔、北京檸檬、塔羅科血橙、W·默科特桔橙、大雅柑、紐荷爾臍橙、北碚447錦橙均采摘自國(guó)家果樹種質(zhì)重慶柑桔圃(重慶市北碚區(qū)歇馬街道中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所內(nèi))。昭通蘋果(紅富士品種)和碭山酥梨果實(shí)均購買于重慶市北碚區(qū)歇馬街道超市。

1.2 致病菌鑒定觀察患病柑桔樣品，記錄其特征。采用組織塊分離法對(duì)樣品進(jìn)行病菌分離。菌株純化后，挑取少量菌絲，加入30 μL 2× T5 Direct PCR Kit(Plant)(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)裂解液 Lysis Buffer A，95 ℃加熱20 min。常規(guī)引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)擴(kuò)增ITS片段。25 μL PCR 反應(yīng)體系：T5 Plant 12 μL，模板1 μL，ITS1/ITS4各1 μL，ddH2O 10 μL。ITS擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)充延伸3 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送擎科公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果序列提交至NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析，用MEGA-X鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))。

1.3 致病性測(cè)定取尤力克檸檬秋季展開而未轉(zhuǎn)綠葉片、未轉(zhuǎn)褐枝條和膨大期果實(shí)，用75%酒精消毒20 s，無菌水沖洗3次，備用。葉片設(shè)置正面及反面的無傷接種、針刺2針接種和針刺10針接種，共6種處理方式；枝條設(shè)置無傷接種、刻傷接種和去皮接種3種處理方式；果實(shí)設(shè)置無傷接種、針刺10針接種和去皮接種3種處理方式。各處理接種WZ1菌株，對(duì)照組接種無菌PDA培養(yǎng)基。接種后，20 ℃保濕培養(yǎng)，每日觀察發(fā)病情況，十字交叉法測(cè)量病斑直徑并記錄。

取其他柑桔品種的材料清洗完后，秋季展開未轉(zhuǎn)綠葉片采用正面針刺10針接種，未轉(zhuǎn)褐枝條采用去皮接種，膨大期果實(shí)采用針刺10針接種；昭通蘋果和碭山酥梨果實(shí)采用針刺10針接種處理。20個(gè)樣品一組，設(shè)置3次重復(fù)。各處理接種WZ1菌株，對(duì)照組接種PDA培養(yǎng)基。20 ℃保濕培養(yǎng)。十字交叉法測(cè)量病斑直徑并記錄。采用SPSS Statistics 25 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 常用殺菌劑室內(nèi)藥劑篩選供試殺菌劑包括：37%苯醚甲環(huán)唑WP(山東省綠士農(nóng)藥有限公司)、450 g/L咪鮮胺EC(安道麥馬克西姆有限公司)、50%甲基硫菌靈SC(陜西湯普森生物科技有限公司)、3%噻霉酮ME(江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司)、50%醚菌酯WP(利爾化學(xué)股份有限公司)、40%腈菌唑WP(美國(guó)陶氏益農(nóng)有限公司)、60%唑醚·代森聯(lián)WP(巴斯夫歐洲公司)、30%堿式硫酸銅SC(保定農(nóng)藥廠)、25%嘧菌酯SC(英國(guó)先正達(dá)有限公司)、11.5%吡唑嘧菌脂EC(石家莊市深泰化工有限公司)、50%啶酰菌胺WG(巴斯夫歐洲公司)、86.2%氧化亞銅WP(挪威勞頓克斯公司)、12.5%烯唑醇WP(江蘇托球農(nóng)化股份有限公司)、99%噁霉靈DP(煙臺(tái)鑫潤(rùn)精細(xì)化工有限公司)、250 g/L戊唑醇EW[安道麥(北京)農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司]、75%肟菌·戊唑醇WG(德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司)、46%氫氧化銅WP(上海生農(nóng)生化制品股份有限公司)、60%霜脲·醚菌酯WP(美國(guó)世科姆公司)、70%丙森鋅WP(德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司)、80%克菌丹WP[安道麥(北京)農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司]、80%代森錳鋅WP(利民化工股份有限公司)、65%代森鋅WP(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)、99%礦物油EC(天津綠穎農(nóng)藥銷售有限公司)。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行殺菌劑毒力測(cè)定[6]。將各殺菌劑配置成1 mg/mL的母液，再將母液稀釋成各濃度梯度，單獨(dú)或復(fù)配[7]與PDA培養(yǎng)基混合制成含有不同濃度藥劑的培養(yǎng)基，以加入等量無菌水的PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照。每處理3次重復(fù)。各含藥培養(yǎng)基接種WZ1菌株菌餅，20 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(PBT)對(duì)各藥劑試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得各藥劑對(duì)菌株的毒力回歸方程、抑制中濃度(EC50)、抑制90%濃度(EC90)、相關(guān)系數(shù)(r)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀及發(fā)病規(guī)律自2018年12月中旬開始，在萬州地區(qū)尤力克檸檬的葉片上發(fā)現(xiàn)了零星點(diǎn)狀病斑；2019年1—2月，田間開始出現(xiàn)大面積葉片枯萎、大量落葉，隨后枝條上的病斑逐漸擴(kuò)展，導(dǎo)致整枝干枯，因而造成大量落果。病情發(fā)生非常迅速。2019年3月下旬左右，萬州區(qū)白羊、黃柏和太龍3個(gè)鎮(zhèn)(鄉(xiāng))共10個(gè)村的尤力克檸檬種植區(qū)，葉片基本全部落光，枝條大部分枯死，發(fā)病區(qū)域面積約達(dá)100 hm2。在患病柑桔葉片上，可見明顯的圓形或橢圓形病斑，病斑中部為淺褐色凹陷，外圈深褐色并伴有黃色暈圈；在枝條上，呈現(xiàn)為眼狀輪紋枯萎病斑，病斑擴(kuò)展后導(dǎo)致整個(gè)枝條枯死，隨后落葉、落果(見圖1)。

注：A—C 尤力克檸檬，D—F 紐荷爾臍橙，拍照時(shí)間2019年3月。圖1 重慶萬州疑似柑桔輪斑病的田間癥狀

2.2 病原菌鑒定在PDA培養(yǎng)基上，分離菌株(WZ1)的菌落邊緣光滑，氣生菌絲生長(zhǎng)較旺盛。菌絲最初為白灰色或灰色，外圈為淺白色或淺黃色，后逐漸整體變成灰褐色、靠近中心少量白灰色，菌絲成棉絮狀且貼壁伸展。培養(yǎng)基背面最初為淺奶黃色，后逐漸產(chǎn)生深黑褐色圓圈，并不斷擴(kuò)展至全黑。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基正面或背面會(huì)出現(xiàn)深黑褐色菌核。氣生菌絲隔膜明顯，產(chǎn)孢菌絲同氣生菌絲相同。在PDA培養(yǎng)基上，產(chǎn)生少量小型分生孢子，孢子呈橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，頂端鈍圓，向一側(cè)稍有彎曲；不產(chǎn)生厚垣孢子和剛毛(見圖2)。

注：A—B 菌落正、反面， C—D菌絲及其隔膜， E小型分生孢子。圖2 分離菌株(WZ1)的形態(tài)特征

將分離菌株(WZ1)接種在離體尤力克檸檬上，葉片出現(xiàn)中部凹陷深色、外圈伴有黃色暈圈的病斑，與田間癥狀一致；枝干上出現(xiàn)棕色病斑并逐漸擴(kuò)大；果實(shí)出現(xiàn)水浸狀凹陷(見圖3)。從病斑上重新分離的菌株與接種菌株，在形態(tài)和ITS序列信息上一致。

圖3 分離菌株(WZ1)對(duì)尤力克檸檬離體組織的致病性

從重慶萬州尤力克檸檬患病樣品中分離得到3株菌株(WZ1、WZ2、WZ3)，在北京檸檬患病樣品中分離得到1株菌株(BJNM1)，在紐荷爾臍橙患病樣品中分離得到1株菌株(NHRQC1)。將測(cè)得的各菌株ITS序列放于NCBI進(jìn)行BLAST分析，5株菌株與Pseudofabraeacitricarpa(KR859281.1)的相似度為100.00%?；贗TS1/ITS4序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)WZ1和WZ2聚在一起，并且與陜西城固柑桔輪斑病的病原菌SXL1(JN601676.1)處于不同分支；WZ3和BJNM1、NHRQC1聚在一起，且與SXL1(JN601676.1)處于同一分支(見圖4)。

注：利用Kimura 2-parameter模型進(jìn)行N-J分析；LZ-2012 SXL1 JN601676.1 Cryptosporiopsis sp. 后被定名為Cryptosporiopsis citricarpa [1]，再被更名為Pseudofabraea citricarp [5]。圖4 重慶萬州疑似柑桔輪斑病樣品5株分離菌株基于ITS1/ITS4序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 分離菌株的致病性采用無傷處理接種時(shí)，離體葉片、枝條和果實(shí)上無病斑形成。在所有致傷處理接種的離體材料上，均可形成明顯病斑。由此推測(cè)，該病原菌是通過傷口侵染植物。在葉片上，正面針刺10針接種形成的病斑最大，反面2針接種形成的病斑最小。枝條去皮接種后，去皮處產(chǎn)生明顯的褐色病斑。果實(shí)去皮接種后，沿著去皮部位四周會(huì)形成透明水浸狀不規(guī)則的病斑，不向海綿層擴(kuò)展。采用針刺10針致傷接種的果實(shí)，針刺處及其四周微微向內(nèi)凹陷，果實(shí)表皮形成圓形深褐色病斑，手按壓明顯感覺果斑處變硬，切開病斑表層，可見果實(shí)海綿層褐變。

WZ1菌株對(duì)萬州地區(qū)規(guī)模種植的8個(gè)柑桔品種的葉片、枝和果均有致病性。接種12 d時(shí)，不同品種和不同組織材料之間的致病性均存在明顯差異。WZ1菌株接種12 d后，葉片上的病斑直徑以塔羅科血橙、W·默科特桔橙、紐荷爾臍橙顯著大于其他品種，枝條上的病斑直徑以W·默科特桔橙等6個(gè)品種顯著大于紅桔和紐荷爾臍橙，果實(shí)上的病斑直徑以塔羅科血橙顯著大于其他7個(gè)品種。塔羅科血橙在葉、枝和果實(shí)上的病斑均較大，是最易受害的品種(見表1)。

表1 WZ1菌株對(duì)8個(gè)柑桔品種不同離體材料的致病性 mm

菌株WZ1接種在昭通蘋果和碭山酥梨果實(shí)上4 d后，出現(xiàn)圓形深黑褐色偏棕病斑(圖5)，病斑向內(nèi)微凹陷，輕按病斑處發(fā)現(xiàn)果實(shí)質(zhì)地變得軟，果皮易破，果實(shí)剖面可見明顯U型腐爛。病斑會(huì)持續(xù)擴(kuò)大，8 d時(shí)，碭山酥梨上病斑直徑達(dá)9.49 mm，昭通蘋果上病斑直徑為3.76 mm。

圖5 WZ1菌株對(duì)蘋果(左)和梨(右)果實(shí)的致病性(接種4 d)

2.4 常見殺菌劑對(duì)WZ1菌株的毒力供試殺菌劑對(duì)WZ1的菌絲生長(zhǎng)均有一定程度的抑制作用(見表2)。EC50值小于3 mg/kg且EC90值小于50 mg/kg的殺菌劑有以下10種：450 g/L咪鮮胺 EC、50%甲基硫菌靈 SC、30%堿式硫酸銅 SC、50%啶酰菌胺 WG、11.5%吡唑嘧菌脂 EC、86.2%氧化亞銅 WP、50%醚菌酯WP、3%噻霉酮 ME、40%腈菌唑WP、99%噁霉靈 DP。這些殺菌劑對(duì)菌株WZ1的毒力較強(qiáng)，且長(zhǎng)期、多次使用，菌株也不易產(chǎn)生耐藥性。EC50值小于3 mg/kg，但EC90值大于50 mg/kg的殺菌劑有以下6種：37%苯醚甲環(huán)唑 WP、60%唑醚·代森聯(lián) WP、25%嘧菌酯 SC、250 g/L戊唑醇 EW、75%肟菌·戊唑醇 WG、12.5%烯唑醇 WP。如果長(zhǎng)期、多次使用這些殺菌劑，菌株可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性。46%氫氧化銅 WP、70%丙森鋅 WP、80%克菌丹 WP、80%代森錳鋅 WP、65%代森鋅 WP的EC50值在10 mg/kg和40 mg/kg之間，99%礦物油EC的EC50值大于200 mg/kg。這幾種殺菌劑不及其他藥劑效果理想，但也對(duì)菌株存在抑制作用，可用于保護(hù)嫩梢幼葉。

表2 供試殺菌劑對(duì)Pseudofabraea citricarpa WZ1菌株的室內(nèi)毒力

為了提高藥劑對(duì)菌株的敏感性，降低菌株產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)，減少用藥量，進(jìn)行了殺菌劑復(fù)配篩選。試驗(yàn)結(jié)果看出，80%代森錳鋅 WP分別與50%啶酰菌胺 WG、37%苯醚甲環(huán)唑WP復(fù)配使用時(shí)，EC50值均小于1.2 mg/kg。其中，80%代森錳鋅 WP與50%啶酰菌胺 WG 1∶64復(fù)配效果最佳，EC90值為7.11 mg/kg。80%克菌丹 WP與37%苯醚甲環(huán)唑 WP 1∶1復(fù)配也可以達(dá)到類似的效果，EC50值和EC90值分別為0.17和13.79 mg/kg。冬季清園時(shí)，植株會(huì)有大面積的創(chuàng)口，防控需同時(shí)使用清園保護(hù)藥劑和殺菌劑。99%礦物油 EC和80%代森錳鋅 WP 1∶50復(fù)配使用時(shí)，EC50值和EC90值分別為10.81和6 487.41 mg/kg(見表3)。

表3 復(fù)配藥劑對(duì)P. citricarpa WZ1菌株的室內(nèi)毒力

3 討論

柑桔輪斑病最初在陜西城固的溫州蜜柑和金柑上被發(fā)現(xiàn)，2012年被首次報(bào)道[1-2]。柑桔輪斑病的病原菌主要侵染柑桔植株的葉和枝，造成患病柑桔大量枯葉、枯枝、落果，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成果園毀園，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。柑桔輪斑病的病原最初被鑒定為擬隱殼孢屬的一個(gè)新種，并被命名為CryptosporiopsiscitricarpaL. Zhu, K. D. Hy de & H.Y. Li[1]，2014年林惠嬌等[4]根據(jù)分子生物學(xué)數(shù)據(jù)將該病原菌歸入Neofabraea屬，2016年Chen等[5]將其更名為Pseudofabraeacitricarp。2018年，基于SCAR標(biāo)記的P.citricarp快速鑒定法被開發(fā)出來[8]。2019年，P.citricarpa轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果被報(bào)道[9]。本試驗(yàn)通過對(duì)患病柑桔樣品進(jìn)行鑒定，確定重慶萬州地區(qū)近年新發(fā)生的疑似柑桔輪斑病的致病菌為Pseudofabraeacitricarpa，園區(qū)大面積發(fā)生的就是柑桔輪斑病。自2012年報(bào)道在陜西城固縣的溫州蜜柑和金桔上發(fā)現(xiàn)柑桔輪斑病后[1-2]，這是首次在新地區(qū)、新品種上的鑒定報(bào)道。病原菌的鑒定結(jié)果顯示，從萬州分離得到的柑桔輪斑病菌株和陜西城固的菌株在形態(tài)和分子序列[1-2]上均有差異；致病性測(cè)試結(jié)果顯示，重慶菌株對(duì)柑桔枝、葉、果均有致病性，與陜西菌株[1-2]有所不同。

室內(nèi)離體測(cè)試結(jié)果顯示，WZ1菌株可侵染萬州地區(qū)規(guī)模種植的8種柑桔的葉、枝和果。相比葉片和果實(shí)，菌株對(duì)枝條的致病性更強(qiáng)，在枝條上發(fā)病更快速、明顯。這也與田間的發(fā)病情況類似[1-3]。田間，枝條上著生葉片和針刺的部位病斑最多，且病斑會(huì)持續(xù)擴(kuò)大，隨后葉片從基部向尖部開始枯萎，直至整枝枯萎、葉枯至掉落。離體尤力克檸檬不及田間尤力克檸檬發(fā)病嚴(yán)重，可能是因?yàn)閳@區(qū)內(nèi)植株因感染黃化脈明病毒導(dǎo)致整個(gè)樹體衰弱[10-11]，接著柑桔輪斑病菌在弱樹上暴發(fā)。由此推測(cè)，植株患其他病害更易感染柑桔輪斑病，或者是感染柑桔輪斑病后，植株會(huì)多種病害一起發(fā)病。除了已確定患柑桔輪斑病菌的品種外，萬州的多種雜柑種植區(qū)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了柑桔輪斑病。這表明萬州地區(qū)柑桔種植園有暴發(fā)柑桔輪斑病的風(fēng)險(xiǎn)。該病害一旦擴(kuò)展，將會(huì)造成毀園，帶來不可逆轉(zhuǎn)的巨大損失。種植塔羅科血橙、W·默科特桔橙、紐荷爾臍橙的園區(qū)，尤其需要高度重視，做好防控準(zhǔn)備。值得警惕的是，柑桔輪斑病菌除侵染柑桔外，還可侵染蘋果和梨。WZ1菌株在昭通蘋果上形成的病斑，與明孢盤菌屬引起的蘋果牛眼果腐病癥類似但又不同[12-14]，WZ1菌株在昭通蘋果和碭山酥梨上形成病斑的速度更快、病斑擴(kuò)大更快、癥狀更明顯。

化學(xué)殺菌劑是目前田間防控柑桔輪斑病的主要方法[1-3]。2012年朱麗[1]研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺對(duì)柑桔輪斑病菌有抑制效果。本試驗(yàn)通過室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈、噻霉酮、醚菌酯、腈菌唑、堿式硫酸銅、吡唑嘧菌脂、啶酰菌胺、氧化亞銅、噁霉靈等殺菌劑，或是代森錳鋅與啶酰菌胺復(fù)配、克菌丹與苯醚甲環(huán)唑復(fù)配，都對(duì)WZ1菌株生長(zhǎng)有較好的抑制效果，可以進(jìn)一步用于田間試驗(yàn)。

柑桔輪斑病容易暴發(fā)成災(zāi)，一旦在田間發(fā)現(xiàn)患病植株，應(yīng)及時(shí)處理患病組織和噴灑殺菌劑。針對(duì)柑桔輪斑病菌低溫生長(zhǎng)的特點(diǎn)，春、秋新梢抽發(fā)期是生產(chǎn)上進(jìn)行防控的關(guān)鍵期。秋季應(yīng)噴灑藥劑保護(hù)秋梢尤其是晚秋梢；冬季加強(qiáng)清園，修剪病枝并噴灑保護(hù)劑和殺菌劑；春季新梢抽發(fā)前噴灑殺菌劑降低病原菌基數(shù)。